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Title : Comptes rendus de l'Académie des sciences. Série 3, Sciences de la vie

Author : Académie des sciences (France). Auteur du texte

Publisher : (Paris)

Publisher : Centrale des revues (Montrouge)

Publisher : Elsevier (Paris)

Publication date : 1986-06

Type : text

Type : printed serial

Language : french

Language : French

Format : Nombre total de vues : 30522

Description : juin 1986

Description : 1986/06 (SER3,T303 (DOUBLE))-1986/12.

Rights : public domain

Identifier : ark:/12148/bpt6k5675408m

Source : Bibliothèque nationale de France, département Collections numérisées, 2008-93531

Relationship : http://catalogue.bnf.fr/ark:/12148/cb34394202h

Provenance : Bibliothèque nationale de France

Date of online availability : 19/01/2011

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COMPTES RENDUS

DE L'ACADEMIE DES SCIENCES


GAUTHIER-VILLARS IMPRIMEUR-LIBRAIRE DES COMPTES RENDUS DE L'ACADÉMIE DES SCIENCES

3412-86

Imprimé en France


DE L'ACADÉMIE DES SCIENCES

1986 — Tome 303

Série III : SCIENCES DE LA VIE



TOME 303—SERIE III — N° 17 JUIN 1986



« Reproduction in whole or in part without the permission of the author or his représentative is prohibited (law of March II, 1957, Article 40, line 1). Such reproduction by whatever means, constitutes an infringement forbidden by Article 425 and those following it, of the Pénal Code. The law of March 1-1, 1957, lines 2 and 3 of Article 41, authorizes only those copies or reproductions made for the exclusive use of the copyist, and not intended for collective use, and such analyses and short quotations as are made for the purposes of an example or illustration. >>

« Toute représentation ou reproduction, intégrale ou partielle, faite sans le consentement de l'auteur, ou de ses ayants-droits ou ayants-cause, est illicite (loi du 11 mars 1957, alinéa 1er de l'article 40). Cette représentation ou reproduction, par quelque procédé que ce soit, constituerait une contrefaçon sanctionnée par les articles 425 et suivants du code pénal. La loi du II mars 1957 n'autorise, aux termes des alinéas 2 et 3 de l'article 41, que les copies ou reproductions strictement réservées à l'usage privé du copiste et non destinées â une utilisation collective d'une part et, d'autre part, que les analyses et les courtes citations dans un but d'exemple et d'utilisation. »

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© Académie des Sciences, Paris, 1986



CONTENTS

1986 — VOLUME 303 — SECTION III — N° 1

Immunology

A study of the phylogenic repartition of human rena! antigens by monoclonal antibodies, Jean-Jacques Càndelier, Philippe Couillin, Sylvie Pluvinage, Marie-Claude Vissault and André Boue. 1

The préparation of five monoclonal antibodies spécifie of important human rénal histologie structures both functionnally and organogenetically has permitted to identify the repartition of the corresponding antigens in the vertébrale phylum. For three ofthem, appeared a clear eut histologie ideniity in intensity and localization between the mammals siudied and mon. For the two others a phylogenic and histologie dispersion was observed. It may be supposed, in the latter case, that the évolution and the biotope have actedin différent manners on rénal function and organogenesis according to the vertebrate classes or species investigated.

Pharmacology

Use of thiopental in human. High performance liquid chromatographic and mass spectrometric détermination of the drug and its metabolites in plasma and urine, Claudette Bory, Christiane Chantin, Roselyne Boulieu, Jean Cotte, Jean-Claude Berthier, Daniel Froisse and Marie-Joëlle Bobenrieth. 7

Thiopental is an anaesthetic drug which is currently used for cerebral resuscitation. In this last indication the drug is administrated at high dosés over a period of several days. Under clinical trials thiopental and two metabolites namely 5 ethyl-5 (l' methyl-3' hydroxy-butyl ) 2 thiobarbituric acid and 5 ethyl-5 (Vmethyl3' carboxy-propyl) 2 thiobarbituric acid have been determined by high performance liquid chromatography and mass spectrometry. In human plasma high concentrations of thiopental and 5 ethyl-5 (l' methyl-3' hydroxy-butyl) 2 thiobarbituric acid and à lower concentration of 5 ethyl-5 (l' methyl-y carboxy-propyï) Ithiobarbituric acid hâve beenfound. In urine samples thèse metabolites are excreted in large and approximately equàl quantities, whereas smail amounts of thiopental were recovered.

Plant Physiology

Clonal degeneration of douglas fir (Pseudotsuga menziesii) cultured in vitro ; relation with the levels of minerai éléments, auxin, abscisic acid, zeatin and zeatin-riboside, Faouzi Bekkaoui, Regis Maldiney, Gilles Pilote, Michel Boulay and André Franclet. . . . . . . . ..... . . 13

Douglas fir microcuttings when subcultured on the same medium, show a variability of the multiplication rate, depending upon the différent subcultures on a culture médium containing activated charcoal but no hormones. Certain clones decay after the first subcultures, others after the tenth one. The degeneration is characterized by stem swelling, apical bud dormancy and a high endogenous rate of zeatin and zeatin-riboside.



C R. Acad. Sc Paris, t. 303, Série III, n° 1, 1986

1

IMMUNOLOGIE. — Étude de la répartition phylogénique d'antigènes rénaux humains définis par desanticorps monoclonaux.Note de Jean-Jacques Candelier, Philippe Couillin, Sylvie Pluvinage, Marie-Claude Vissault et André Boue, présentée par Jean-François Bach.

L'obtention de cinq anticorps monoclonaux spécifiques de structurés histologiques rénales humaines importantes du point de vue fonctionnel et organogénétique a permis de suivre la répartition des antigènes correspondants dans l'embranchement des vertébrés. Elle fait apparaître une très nette identité histologjque tant en intensité qu'en localisation entre les mammifères et l'homme pour trois antigènes. Pour les deux autres, une dispersion phylogénique et histologjque est observée. On peut dans ces derniers cas supposer que l'évolution et le milieu ont agi de façon différentielle sur la fonction et l'organogénèse rénales selon la classe ou l'espèce de vertébrés considérés.

IMMUNOLOGY. — À study of the phylogenic repartition of, human rénal antigens by monoclonal antibodies.

The préparation of five monoclonal antibodies spécifie of important human rend histologie structures both functionnally and organogenetically has permitted to identify the répartition of the corresponding antigens in the vertebrate phylum. For three ofthem, appeared a clear eut histologie identity in intehsity and localization between the mammals studied and mon. For the two others a phylogenic and histologie dispersion was observed. It may be supposed, in the latter case, that the évolution and the biotope have acted in différent manners on rénal function and organogenesis according to the vertebrate classes or species investigated.

INTRODUCTION. — Des travaux récents, en particulier ceux de Le Douarin en 1984 [1] et de Edelman en 1985 [2] ont montré l'importance du rôle joué par certaines molécules membranaires dans les mécanismes d'histo différenciation et de migration cellulaire, au cours des développements embryonnaire et foetal.

Dans cette optique, un travail précédent (Càndelier et coll. 1986 [3]) avait permis de mettre en évidence par des anticorps monoclonaux (A.C.M.) des antigènes membranaires et cytoplasmiques spécifiques de structures rénales humaines précises.

Les grandes lignes de l'embryogenèse et de l'organisation du rein sont demeurées très semblables dans la lignée des métazoaires, en particulier si l'on considère l'embranchement des vertébrés. On observe pratiquement toujours un appareil filtreur : le glomérule et un tabule excréteur constitué de deux parties : l'une proche du glomérule qui porte une bordure en brosse, l'autre distale à cellules cubiques. Si l'on se placé au niveau fonctionnel on retrouve cette même unité (Fraser 1950 [4]).

Les variations de ce schéma de base sont fonctions des différents groupes de vertébrés, de leur développement et de leur éthologie (Edwards et Schnitter 1933 [5], Gérard et Cordier 1934[6]).

Il devenait ainsi intéressant de chercher si les structures antigeniques humaines précédemment définies pouvaient être retrouvées chez les animaux vertébrés et si leurs éventuelles émergences pouvaient être corrélées à des lignes évolutives, adaptives ou développementales.

MATÉRIEL ET MÉTHODES. — 1. Production et sélection des A.C.M. — Les techniques d'hybridation utilisées et cette partie de l'étude, ont déjà fait l'objet de publications détaillées (Couillin et coll. 1982 [7]), Candelier et coll. 1986 [3]). Brièvement, des souris ont été immunisées avec des cellules embryonnaires de mésonéphros (M.S.N.) et de métanéphros (M.T.N.) humains de 7 et 8 semaines. Les A.C.M. sécrétés par les divers clones hybrides obtenus ont été sélectionnés sur des coupes à congélation de M.S.N. et de M.T.N. humains à différents stades de différenciation y compris l'adulte, par immunofluorescence indirecte.

Cinq de ces A.C.M. ont été retenus pour la présente étude phylogénique en raison de leur spécificité de marquage: EE24-6, EG9-11, EG14-1, EJ30-1, EK17-1. Ils reconnaissent respectivement : l'urothélium en membrane, le tube contourné proximal (T.G.P.) en membrane et cytoplasme, la membrane basale glomérulaire, le tissu conjonctif et le mésangium pour les deux derniers.

0249-6313/86/03030001 $ 2.00 © Académie des Sciences G. R., 1986, 2e Semestre (T. 303) Série III - 1


C. R. Acad, Sc. Paris, t. 303, Série III, n° 1, 1986

REPARTITION PHYLOGENIQUE DES A.C.M. ET INTENSITE DU MARQUAGE PHYL0GEN1C REPARTITION OF MONOCLONAL ANTIBODIES AND STA1NWG INTENSITY

2. Les animaux éprouvés. — Ils ont été choisis de façon que les grandes classes et ordres de vertébrés soient représentés (se reporter à la planché en annexe) avec les précisions suivantes : les espèces éprouvées ont été pour les poissons : la truite fario, la truite arc-en-ciel et le carassin ; pour la tortue : trionyx sinensis ; pour le' lézard : le lézard vivipare; pour le serpent : la vipère aspic; pour les oiseaux : la caille et la poule.

3. Techniques histologiques. — Les reins des animaux sélectionnés sont découpés eh parallélépipèdes de 3 à 5mm sur 10mm, puis congelés hermétiquement sous papier aluminium dans l'azote liquide pour certains. D'autres sont fixés dans le Bouin aqueux pour les manipulations d'histologie classique.

Lés coupes à congélation sont réalisées au cryostat à —20°C. Certaines, sont séchées à l'air, d'autres fixées dans l'acétone à — 20°C, d'autres refroidies par aspersion de fréon et une dernière série fixée, colorée afin de situer le niveau de coupe de l'organe étudié. Toutes sont conservées à —20°C.

Là localisation histologique des A.C.M. est révélée par immunofluorescence indirecte.

RÉSULTATS. — L'ensemble des résultats obtenus a été regroupé sur la planche en annexe. Les principaux ordres de mammifères (P, primates; C, carnivores; A, artiodactyles; L, lagomorphes ; R, rongeurs et I, insectivores) ont été disposés arbitrairement sauf les insectivores et les rongeurs. Ces deux ordres étant apparus très tôt dans l'évolution et les insectivores étant à l'origine des mammifères ils ont été placés à. la base de ce groupe.

Spécificité de marquage. — Trois des cinq A.C.M. (EG9-11, EG14-1, EK17-1) reconnaissent chez les animaux les mêmes structures histologiques que chez l'homme. Lé marquage cependant est strictement limité aux mammifères avec un certain nombre d'exceptions : les artiodactyles pour EG9-11 et EG14-1, les rongeurs et le lapin pour EG9-U et EK17-1; le porc et le chat pour EK17-1.

NEPHRON THEORIQUE - THEORETICAL NEPHRON

(1) = PRESENT CHEZ LES POISSONS TESTES, BATRACIENS, SERPENTS

PRESENT IN THE TESTED FISHES, BATRACHlANS, SNAKES

(2) = PRESENT CHEZ LES POISSONS TESTES, BATRACIENS, REPTILES

PRESENT IN THE TESTED FISHES ; BATRACHlANS AND REPTILES

GL .= GLOMERULE - GLOMERULUS

) PELOTON VASCULAIRE - GLOMERULAR CAPILLARY.... ++ MESANGIUM - MESANGIUM .BASALE GLOMERULAIRE - GLOMERULAR BASEMENT MEMBRANE C.C. = COLLET CILIE - NECK SEGMENT T.C.P. = TUBE CONTOURNE PROXIMAL - PROXIMAL TUBULE S.I. -SEGMENT INTERMEDIAIRE - INTERMEDIATE SEGMENT H. = ANSE DE HENLE - LOOP OF HENLE

T.D. = TUBE DISTAL - DISTAL TUBULE T.C. = TUBE COLLECTEUR - COLLECTING SYSTEM Ur. = UROTHELIUM - UROTHEUUM




C. R. Acàd. Sc. Paris, t. 303, Série III, n° 1, 1986

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Pour les deux autres A.C.M. (EE24-6 et EJ30-1) on observe une certaine dispersion des marquages tant histologique que phylogénique.

; Les structures déjà repérées chez l'homme : urothélium pour EE24-6, mésangium et tissu conjonctif pour EJ30-1 sont retrouvées jusque chez le xénope pour la première et chez le lézard pour la seconde. Il s'y ajoute des structures nouvelles : le glomérule, le collet cilié, le T.C.P., le T.D. et le tissu conjonctif pour EE24-6, les parties terminales du néphroh pour EJ30-1. Ce nouveau marquage apparaît chez des espèces appartenant tant aux mammifères qu'aux vertébrés inférieurs.

Il est à noter que dans les cas du rat, de la souris et du pleurodèle aucun marquage n'a pu être mis en évidence quel que soit l'A.C.M. utilisé.

Intensité du marquage. — Indépendamment de sa localisation histologique le marquage présente une variation de son intensité au travers des vertébrés éprouvés {voir planche en annexe), il est très intense chez les primates, le chat et le cobaye, intense chez la vipère, le ragondin, la brebis, faible ou modéré chez les autres vertébrés,

: DISCUSSION ET CONCLUSIONS, — La reconnaissance par trois des A.C.M. des mêmes structures rénales chez l'homme et chez plusieurs espèces animales confirme des hypothèses déjà anciennes relatives à la stabilité de l'organogenèse à travers les espèces. Elle procéderait de la réutilisation de structures moléculaires préexistantes, en particulier si elles se révèlent importantes du point de vue du développement et de la physiologie (Jacob 1977 [8]). Dans ce travail, il s'agit d'antigènes appartenant à la membrane basale glomérulaire, au T.C.P. et au tissu conjonctif dont, pour ce dernier le rôle organisationnel a été évoqué par Ekblom et coll. en 1981 [9].

Ces similitudes sont strictement limitées aux mammifères, mais le spectre des animaux chez lesquels le marquage est positif diffère avec chaque A.C.M. Cette observation tendrait à indiquer que l'évolution n'est pas intervenue de la même façon sur les antigènes mis ici en évidence. Il ne paraît pas possible pour ces cas, d'invoquer des divergences adaptatives puisque tous les mammifères considérés, de par leur mode de vie, semblent confrontés aux mêmes problèmes de physiologie rénale.

Le fait que l'immunisation ait été réalisée chez la souris ne peut pas permettre d'obtenir, s'ils existent, les Ag rénaux qui auraient persisté chez tous les vertébrés durant leur évolution. Par construction les marquages ne peuvent être que lacunaires, en particulier au niveau de la souris (Jacob [8], Platt 1983 [10]). L'absence de marquage également chez le rat suggère une grande ressemblance antigénique du point de vue rénal entre ces deux espèces.

La dispersion phylogénique et histologique du marquage observée avec les deux autres A.C.M. (EE24.6 et EJ30.1) suggèrent un certain nombre de remarques :-; ce serait une preuve supplémentaire de l'hypothèse de Jacob [8] qui correspondrait ici à une certaine convergence adaptative à structure lacunaire (voir avant), les lacunes ne représentant pas obligatoirement une absence de l' Ag mais peut-être un simple masquage ou une faiblesse quantitative de la molécule, difficilement reperable avec notre technique;

— il y aurait une similitude antigénique entre le M.S.N. des anamniotes (opisthonéphros) et le M-T.N. des amniotes confirmant un résultat précédent, démontré chez l'homme (Candelier [3]). Résultat qui établissait cette similitude via l'ontogenèse rénale entre le M.S;N, et le M.T.N.;

— répitope repéré par l'A.C.M. pourrait appartenir à plusieurs antigènes distincts (Thivolet 1983 [11]) qui se répartiraient sur différentes structures rénales. Ainsi l'épitope décrit par EE24.6 apparaît sur le T.C.P. mais strictement chez les reptiles.


6 C. R. Acad. Se. Paris, t-303, Série-III, n°l, 1986

On peut observer enfin une corrélation entre l'intensité du marquage et la classification évolutive des vertébrés. L'immunisation ayant été faite avec des cellules humaines, la réaction antigénique est plus forte chez les mammifères, en particulier chez les primates. Que cette réaction intense soit présente chez les serpents pourrait signifier que l'évolution agit de façon différentielle en fonction des organes concernés. Ainsi au plan rénal les serpents seraient plus proches des mammifères que des oiseaux.

Bien que devant faire face au même problème de l'économie de l'eau, les moyens utilisés n'étant pas les mêmes, l'hypothèse adaptative ne semble que peu vraisemblable.

Nairn et coll. en 1962 [12] avec deux antisérums polyclonaux respectivement contre les reins adultes de l'homme et du hamster ont obtenu des résultats sensiblement différents.

Ils observaient une réaction intense chez les poissons d'eau douce et nulle chez les batraciens et les reptiles. Ces divergences pourraient indiquer que l'évolution serait conservatrice vis-à-vis de certains épitopes, mais agirait sur leurs combinaisons variables et donc sur l'apparition ou la disparition des antigènes.

Nous remercions pour leur-aide précieuse les laboratoires de l'Université de Paris-VI, le Muséum d'Histoire naturelle de Paris, l'I.N.R.A. de Jouy-en-Josas et le laboratoire d'immunologie de l'Hôtel-Dieu, Paris.

Reçue le 7 avril 1986.

RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES

[I] N. M. LE DOUARIN, Ce//, 38, 1984, p. 353-360.

[2] G. M. EDELMAN, Exp.. Cell. Res., 161, 1985, p. 1-16.

[3] J. J. CÀNDELIER, P. COUILLIN, P. EYDOUX et A. BOUE, Comptes rendus, 302, série II, 1986, p. 303-308.

[4] E, A. FRASER, Biol. rev. Cambridge Phil. Soc, 25, 1950, p. 159-187.

[5] J. G. EDWARDS et C. SCHNITTER, Amer. J. Anat., 53, 1933, p. 55-87.

[6] P. GÉRARD et R. CORDIER, Biol. rev. Cambridge Phil. soc, 9, 1934, p. 110-131.

[7] P..COUILLIN, R. CRATNIC, N. CABAU, F. HORODNICEANU et A. BouÉ, Ann. virol., 133E, 1982, p. 315-323.

[8] F. JACOB, Immunological Rev., 33, 1977, p. 3-32.

[9] P. EKBLOM, E. LETHTONEN, L. SAXEN et R. TIMPL., J. cell. Biol., 89, 1981, p. 276-283.

[10] J. L. PLATT, T. W. LE BIEN et A. F. MICHAEL, J. exp. Med., 157, 1983, p. 155-172.

[II] J. THIVOLET, Path. Biol, 31, n° 7, 1983, p. 565-567.

[12] R. C. NAIRN, T. GHOSE, J. E. FOTHERGILL et M. G. MCENTEGART, Nature, 4852, 1962, p. 385-387.

J.-J. G, P. C. et A. B. : Unité de Recherches de biologie prénatale,

I.N.S.E.R.M., Unité n° 73, Château de Longchamp, Bois de Boulogne, 75016 Paris;

S. P. et M.-C. V. : Hôpital Ambroise-Paré, Laboratoire d'Anatomie pathologie,

9, avenue Charles de Gaulle, 92100 Boulogne-Billancourt.


C.R.Acad. Sc. Paris, t. 303, Série III, n° 1, 1986

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PHARMACOLOGIE. — Utilisation du thiopental chez l'homme. Détermination de ce médicament et de ses metabolites dans le plasma et les urines par chromatographie en phase, liquide et spectrométrie de masse. Note de Claudette Bory, Christiane Chantim, Roselyne Boulieu, Jean Cotte, Jean-Claude Berthier, Daniel Fraisse et Marie-Joëlle Bobenrieth, présentée par Guy Ourisson.

Le thiopental est un anesthésique qui est aussi utilisé depuis quelques années comme protecteur cérébral dans les cas de souffrances cérébrales très graves. Dans cette dernière indication, le thiopental est administré a ; de fortes doses pendant plusieurs jours. An cours d'essais cliniques nous avons déterminé le thiopental et ses ;: metabolites par chromatographie en phase liquide" et spectrométrie de masse. Cette étude a permis de noter lal: présence de thiopental à concentrations élevées dans le plasma; en outre deux metabolites ont pu être mis êjr évidence : l'acide éthyl-5 (méthyl l'-hydroxy 3'-butyl)-5 thio-2 barbiturique et l'acide éfhyl-5 (méthyl l'-carboxy; 3'-pr6pyl)-5 thio-2 barbiturique. La concentration du premier métabolite dans le plasma est très supérieure a celle du second. Dans les urines ces deux metabolites sont éliminés en quantités importantes et approximatives ment égales tandis que le thiopental non métabolisé est éliminé en faible quantité.

PHARMACOLOGY. — Use of thiopental in human. High performance liquid chromatographie and mass y spectrométrie détermination of the drug and its metabolites in plasma and urine.

Thiopental is an anaesthetic drug which is currently used for cérébral resuscitation. In this last indication the: drug is administrated at high doses over a period of several days. Under clinical trials thiopental and two/ metabolites namely 5 ethyl-5 (l' methyl-3'hydroxy-butyl) 2 thiobarbituric acid and 5 ethyl-5 (Ymethyliy 3'carboxy-propyl) 2 thiobarbituric acid have been determined by high performance liquid chromatography and mass'spectrometry. In human plasma high concentrations of thiopental and 5 ethyl-5 (l' methyl-3' hydroxy-butyî) 2 thiobarbituric acid and a lower concentration of 5 ethyl-5 (1'methyl-3'carboxy-propyï) 2 thiobarbituric acid have been found. In urine samples thèse metabolites are excreted in large and approximately equal quantities, whereas small amounts of thiopental were recovered.

INTRODUCTION. — Le thiopental (acide éthyl 5-(méthyl l'-butyl) 5 thio-2 barbiturique) - est un anesthésique qui depuis quelques années est aussi utilisé en tant que protecteur cérébral dans les cas d'anoxies ou plus généralement de souffrances cérébrales très graves ([1], -[2]). Dans cette dernière indication qui est de plus en plus répandue dans les services;-: hospitaliers de réanimation le thiopental est administré à de très fortes doses pendant plusieurs jours.

Au cours du traitement, les concentrations plasmatiques de thiopental, déterminées par des méthodes chromatographiques récentes ([3]-[5]) sont élevées, le plus souvent comprises; entre 40 et 80 mg/1. Jusqu'à présent, seule la concentration plasmatique du médicament a été déterminée. Ce thiobarbiturique étant en grande partie. biotransformé [6], il est nécessaire de rechercher et d'identifier également les éventuels metabolites de ce médicament dans le plasma et les urines des patients.

Dans cet article nous décrivons la séparation du thiopental et de ses metabolites par chromatographie en phase liquide à haute performance et l'identification de ces composés' par spectrométrie de masse. En outre ces composés ont été analysés par spectrophotométrie en ultraviolet.

PARTIE EXPÉRIMENTALE. — Patients. — L'étude a été réalisée à partir de 7 enfants (5 garçons et 2 filles); âgées de 2 à 7 ans et 2 adultes (1 homme et 1 femme) .âgés de 29 et 53 ans respectivement, tous atteints dé v souffrances cérébrales très graves et hospitalisés en service de réanimation.

Administration du médicament. — Le thiopental est administré aux patients par voie intraveineuse à raison : d'une dose de charge de 10 mg/kg, suivie d'une dose d'entretien variant de 3 à 5 mg/kg/h.

Prélèvements. — Le sang est collecté par ponction veineuse sur anticoagulant; il est immédiatement centrifugé et le plasma est conservé à —20°C avant l'analyse. Les prélèvements de sang sont effectués du premier au dernier jour du traitement.

Les urines sont recueillies sur 24 h et conservées à —20°C avant l'analyse.

0249-6313/86/03030007 $ 2.00 © Académie des Sciences


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C. R. Acad. Se. Paris, t. 303, Série III, n° 1,1986

Extraction et séparation chromatographique. — Le thiopental et ses metabolites sont extraits du plasma ou des urines par l'éther diéthylique. L'extraction est effectuée en milieu tamponné à pH acide (tampon acétate 0,5 M ; pH 5) après addition d'un étalon interne : le cyclobarbital de calcium.

Là séparation chromatographiqué est réalisée par chromatographie liquide haute performance à polarité de phases inversée. L'appareil utilisé est un Chromatem 380 (Touzart et Matignon, Vitry, France) équipé d'un injecteur automatique Wisp 710 B (Waters, Paris, France) et d'un détecteur, ultraviolet Pye Unicam 4020 (Philips, Bobigny, France). Le support est de l'Hypersil-octadécylsilane (ODS) de fine granulométrie 3 um. La phase mobile est un mélange méthanol-eau 50/50 (V/V). La détection est réalisée à 280 nm. Les volumes d'élition correspondant au thiopental et aux metabolites sont collectés puis évapores à sec à 60°C sous courant d'azote. Les extraits secs sont conservés à —20°C jusqu'à ce qu'ils soient analysés par spectrophotométrie en ultraviolet et spectrométrie de masse.

Analyse par spectrophotométrie en ultraviolet. — Les spectres ultraviolets sont réalisés en utilisant un spectrophotonïètre Pye Unicam SP 1750.

Identification par spectrométrie de masse. — Les spectres de masse sont obtenus avec un spectromètre de masse VG 70-70 E (V.G. Analytical, Manchester, Grande-Bretagne) équipé d'une source mixte, pour l'ionisation par impact d'électrons et l'ionisation chimique. En ionisation chimique l'isobutane (t-C4H9+) est utilisé comme gaz réactant. Les spectres Sont enregistrés dans les conditions suivantes : énergie d'ionisation 70 eV, courant de trappe 100 uA, température de la source 180°C et tension d'accélération 5 kV en ionisation par impact d'électrons. En ionisation chimique le courant d'émission est de 500 uA.

Les spectres MIKE et MIKE-CAD sont obtenus sur un spectromètre de masse ZAB-HF (V.G. Analytical, Manchester, Grande-Bretagne). Tous les échantillons sont introduits par sonde solide classique.

RÉSULTATS ET DISCUSSION. — Le chromatogramme-type obtenu à partir de plasma de patient, au début du traitement par le thiopental, est représenté sur la figure 1A ; celui obtenu en fin de traitement est représenté sur la figure 1 B. Le facteur de capacité k' du thiopental (T) est égal à 10,4 et celui de l'étalon (E) à 4. Les deux autres pics X et Y correspondent à des metabolites du thiopental dont les k' sont 0,7 et 2,3 respectivement. La rétention de ces deux metabolites, en chromatographie liquide en phases inverses, étant inférieure à celle de la molécule initiale, ces deux metabolites sont donc plus polaires. Les chromatogrammes montrent des intensités différentes pour les metabolites X et Y ; en effet le premier pic (métabolite X) est toujours inférieur au second (métabolite Y). Il convient de remarquer aussi que l'intensité du pic dû au métabolite Y peut être supérieure à celle du pic du thiopental en fin de traitement comme le montre la figure 1 B.

La figure 1C montre un chromatogramme type obtenu à partir des urines. Les deux metabolites X et Y sont présents en quantités importantes et approximativement égales. Par contre la quantité de thiopental est très faible.

Les spectres ultraviolets des deux metabolites X et Y sont identiques à celui du thiopental. Les dérivés X et Y sont donc aussi des thiobarbituriques caractérisés par un atome de soufre en position 2 sur le cycle.

Le spectre de masse du thiopental obtenu en impact électronique est représenté sur la figure 2 A. Il est caractérisé par la présence de l'ion moléculaire M+ 0 à m/z 242 et d'ions fragments dont m/z 213, ion formé par la perte du radical C2H"5. L'ion m/z172, (M-70)+ correspondant à (M-C5H10)+ est le pic de base; il est formé au cours d'un réarrangement McLafferty. L'intensité de l'ion mjz 171 (M-71)+ correspondant à (M-C5H11)+ est inférieure à celle de l'ion m/z 172. Par contre sur le spectre MIKE l'intensité de l'ion mjz 171 est très supérieure à celle de l'ion mjz 172 ; l'ion mjz 171 étant plus stable car il est formé au cours d'un réarrangement de McLafferty où interviennent deux protons. Le spectre du thiopental obtenu en ionisation chimique en utilisant l'isobutane comme gaz réactant conduit à la molécule protonée (M+H)+ à m/z 243 qui confirme la masse moléculaire.


SPLANCHE I/PLATE I

CLAUDETTE BORY:

Fig. 1. — Chromatogrammes types obtenus à partir de plasma (A et B) et d'urines (C). A : début de traitement;

B : fin de traitement; T=thiopental (A : 50mg/l ; B : 17 mg/1) ; X et Y = metabolites du thiopental ; E = étalon

interne. Fig. 1. — Typical chromatograms obtained from plasma (A and B) and urine (C) samples. A: beginning of

treatment ; B: end of treatment ; T==thiopental (A: 50 mg/l ; B: 17 mg/1) ; X and Y=metabolites of thiopental ;.

E=internal standard.


Fig. 2. — Spectres de masse en impact électronique du thiopental,

du métabolite X et du métabolite Y collectés en chromatographie liquide.

Fig. 2. — Mass spectra of thiopental ;

métabolite X and métabolite Y from fractions collected by liquid chromatography.


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Les spectres de masse des metabolites X et Y obtenus par impact d'électrons sont représentés sur la figure 2 B et 2 C respectivement. Le spectre du métabolite X fait apparaître un ion moléculaire M+ 0 à m/z 272 (fig. 2B) celui du métabolite Y à m/z 258 (fig. 2C). Ces ions moléculaires ont été confirmés par ionisation chimique avec l'isobutane. Les spectres des metabolites X et Y montrent en.effet la présence presque exclusive d'ions correspondant aux espèces moléculaires protonées (M + H)+ à m/z 273, et m/z 259 respectivement.

Les formules élémentaires des metabolites X et Y déduites des mesures de masse exacte en haute résolution des ions moléculaires sont les suivantes : métabolite X : C11H16N2O4S (déviation maximale 0,2 ppm) ; métabolite Y : C11H18N2O3S (déviation maximale 2,1 ppm).

Les spectres de masse des deux metabolites X et Y obtenus en impact électronique ayant pour pic de base le même ion fragment m/z 172 que le spectre du thiopental, ces deux metabolites sont des thiobarbituriques dont l'un des deux substituants en position 5 sur le cycle est le radical éthyle. Les spectres MIKES et MIKE-CAD des ions m/z 172 confirment une structure identique des ions pour le thiopental et les deux metabolites.

L'étude de la fragmentation et la détermination de la composition des ions observés sur le spectre du métabolite X à m/z 213 (M-CH2C02H)+ (fig. 2B) permettent de déduire que la chaîne isopentyle est oxydée pour former un acide carboxylique en position w. Le métabolite X est donc l'acide éthyl-5 (méthyl l'-carboxy 3'-propyl)-5 thio-2 barbiturique.

Le spectre en impact électronique du métabolite Y montre la présence d'un ion m/z 45 (C2H50)+ (fig. 2C) absent dans le spectre du métabolite X. Cet ion indique que la chaîne isopentyle contient une fonction alcool formée par hydroxylation du carbone en co ou ©—1. Pour ce métabolite les ions m/z 173 sont plus abondants (98 %) que pour X (25 %) et le thiopental (56 %). Ces ions résultent d'un double réarrangement d'hydrogène situés sur les carbones co — 1 et co—2 ; l'hydrogène sur le carbone co —1 étant rendu plus labile du fait de la présence sur ce même carbone de la fonction OH. Le métabolite Y est donc l'acide éthyl-5 (méthyl l'-hydroxy 3'-butyl)-5 thio-2 barbiturique. Les structures des metabolites sont données sur la figure 2.

L'oxydation de la chaîne alkyle en position 5, qui comprend au moins quatre atomes de carbone a été observée par plusieurs auteurs lors de l'étude du métabolisme des barbituriques, l'oxydation sur le carbone co conduisant à un acide carboxylique terminal et l'oxydation sur le carbone w-1 à un alcool ([7], [8], [9]).

Dans le plasma nous n'avons pu confirmer, par spectrométrie de masse, que la présence de l'alcool. Les spectres de masse de l'alcool obtenus à partir des extraits urinaires ou plasmatiques sont identiques.

CONCLUSION. — La méthode de séparation en chromatographie liquide haute performance décrite permet de mettre en évidence deux metabolites importants du thiopental chez l'homme. Les résultats obtenus en spectrométrie de masse ont permis l'identification de ces deux metabolites comme étant l'acide éthyl-5 (méthyl l'-hydroxy 3'-butyl)-5 thio-2 barbiturique et l'acide éthyl-5 (méthyl l'-carboxy 3'-propyl)-5 thio barbiturique.

La principale voie de dégradation métabolique du thiopental est donc l'oxydation de la chaîne isopentyle en position 5 sur le cycle. L'oxydation du carbone en position co-1 sur la chaîne conduit à un alcool et celle sur le carbone en position co à un acide carboxylique terminal. L'alcool est présent en concentrations élevées dans le plasma alors que dans ce milieu les concentrations de l'acide terminal sont faibles. Dans les urines


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l'alcool et l'acide terminal sont éliminés en quantités importantes et approximativement égales.

L'analyse par chromatographie en phase liquide nous a permis de mettre en évidence la présence de nembutal, autre métabolite du thiopental, ceci indique que la désulfuration est aussi une voie métabolique mais les concentrations du nembutal sont très faibles dans le plasma ainsi que dans les urines.

Le nembutal est un métabolite trop mineur pour avoir une efficacité thérapeutique. Par contre le métabolite hydroxylé étant présent à des concentrations élevées dans le plasma il serait intéressant de vérifier si ce dérivé n'a pas d'effet pharmacologique. Reçue le 7 avril 1986.

RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES

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J. C. B. : Service de Réanimation, Hôpital Debrousse, 29, rue Soeur-Bouviér, 69322 Lyon Cedex 05 ;

D. F. et M. J. B. : C.N.R.S., Service central d'Analyse, B. P n° 22, 69390 Vernaison.


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PHYSIOLOGIE VÉGÉTALE. — Dégénérescence clonale du douglas (Pseudotsuga menziesii) cultivé in vitro ; relation avec la teneur en éléments minéraux, en auxine, acide abscissique, zéatine et zéatine-riboside. Note de Faouzi Bekkaoui, Régis Maldiney, Gilles Pilate, Michel Bouiay et André Franclet, présentée par Roger Gautheret.

Des microboutures de douglas, repiquées sur le même milieu de culture, montrent une variabilité du taux de multiplication au cours des passages successifs sur un milieu de culture contenant du charbon actif mais pas d'hormones. Certains clones dépérissent dès les premiers passages, d'autres après le dixième. Cette dégénérescence clonale se caractérise par un gonflement de la tige, une dormance du bourgeon apical ainsi que par un taux endogène, de zéatine et dé zéatine-riboside, élevé.

PLANT PHYSIOLOGY. — Clonal degeneration of douglas fir (Pseudotsuga menziesii) cultured in vitro ; relation with the levels of minerai éléments, auxin, abscisic acid, zeatin and zeatin-riboside.

Douglas fir microcuttings when subcultured on tire same médium, show a variability of the multiplication rate, depending upon the différent subcultures on a culture médium containing activated charcoal but no hormones. Certain clones decay after the first subcultures, others after the tenth one. The degeneration is characterized by stem swelling, apical bud dormancy and a high endogenous rate of zeatin and zeatin-riboside.

I. INTRODUCTION. — Le douglas occupe une place importante dans les reboisements. Beaucoup de recherches sont effectuées afin de multiplier in vitro intensivement cette espèce. Il est possible de multiplier des microboutures de douglas par : la culture de bourgeons dormants [3], le bourgeonnement adventif sur les cotylédons [5] ou la culture de méristèmes [1]. La technique de culture ne devient intéressante du point de vue pratique que si les microboutures sont maintenues in vitro indéfiniment, avec un taux de multiplication relativement élevé et stable, comme cela est réalisé chez le Séquoia sempervirens [2]. Cet article décrit certaines difficultés rencontrées et différentes observations effectuées au cours des passages de microboutures de jeunes douglas. Comme le Ca++ et K+ pourraient intervenir dans la réactivité des microboutures [15], nous avons voulu vérifier ce point en dosant ces deux éléments et d'autres cations. D'autre part, il est bien connu que les régulateurs de croissance jouent un rôle dans les processus d'organogenèse [18], nous avons utilisé une méthode immunoenzymatique pour mesurer la teneur des microboutures en auxine, acide abscissique et zéatine et zéatine-riboside en relation avec les passages.

II. MATÉRIEL ET MÉTHODES. — Matériel végétal. — Les microboutures sont issues de graines dé provenance Benton (Oregon). Les graines sont conservées en chambre froide (2°C + 1). Un lot de 24 microbouturcs est cultivé in vitro en 1983 [15], les microboutures issues de ce lot ont subi quinze passages sur le même milieu de base (lot A 15). La multiplication est effectuée par bourgeonnement axillaire. Une microbouture au début de chaque passage a une hauteur de 15+ 5 mm et comprend au moins un bourgeon visible. La microbouture est subdivisée après chaque passage, si elle peut donner deux ou plusieurs microboutures.

Un deuxième lot est préparé en 1985 par la technique suivante : les graines sont désinfectées à l'eau oxygénée 110 volumes puis rincées deux fois à l'eau désionisée stérile. Elles sont alors semées sur vermiculite stérile additionnée d'eau désionisée. Lorsque les épicolyles ont une hauteur de 15 ±5 mm, ils sont introduits sur le milieu de base. Ce dernier lot a subi un passage sur le milieu de base (lot A 1).

Un passage dure environ quatre à cinq semaines.

Milieu de culture. — Le milieu de culture est dérivé du milieu de Murashige et Skoog [14]. Les macroéléments sont dilués deux fois; les microéléments sont complets : la thiamine : lO mg.l- 1 ; le méso-inosilol : lOOmg.l-' ; le saccharose : 30 g.l- 1. Après ajustement du pH à 5,6±0,1, l'agar (Bacto-Difco) à 8g.I- 1 puis le charbon actif (Merck) à 5 g.]- 1 sont ajoutés au milieu. Le milieu de culture ne contient pas de régulateur de croissance.

Les tubes de culture (200x25mm) contiennent environ 15ml de milieu et sont fermés avec des bouchons Kimble. La stérilisation à l'autoclave est effectuée à 118°C, pendant 25 mn. Les conditions d'éclairement et de température sont les suivantes : 16h de lumière +8h d'obscurité, la lumière est fournie par des tubes

0249-6313/86/03030013 $ 2.00 © Académie des Sciences


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fluorescents Sylvania Grolux, l'intensité d'éclairement est d'environ 70uE.m 2. s 1; la température est 25 + 1°C le jour et 20 ± 1°C la nuit.

Dosage d'hormones. Les protocoles d'extraction, de purification et de dosage ont été décrits par Leroux [10], Sotta [16] et Leroux et coll. [11]. Nous en rappelons brièvement les différentes étapes. Après une extraction, classique par du méthanol à 80% sous agitation durant une nuit, les extraits sont filtrés et prépurifiés sur des cartouches SepPakC18. Après évaporation sous vide du méthanol, la phase eau est acidifiée et chargée sur un Sep PakC18 qui est ensuite élue par de l'acétate d'éthyle. Après évaporation et reprise par du méthanol, l'extrait est injecté sur une colonne HPLCC18, les trois pics d'hormones sont séparés par un gradient eau, méthanol, acide acétique. Les fractions correspondantes à la zéatine et zéatine-ribosid.e (Z+.ZR), acide indole acétique (AIA) et acide abscissique (ABA) sont ensuite évaporées, AIA et ABA sont méthylés et. ces fractions après reprise dans le tampon phosphate seront soumises au dosage immunologique. Le rendement de purification est calculé à partir d'ajouts de AIA et de ABA tritiés. La technique employée pour doser.les trois formes hormonales fait appel à un test immuno-erizymatique indirect avec deux anticorps (anticorps dé lapin spécifique d'une hormone et anticorps de chèvre anti-lapin marqués à la biotine). La révélation est réalisée avec de Pavidine marquée à la phosphatase. La très forte affinité entre l'avidine et la biotine permet de disposer d'un système de révélation unique et performant.

Dosage des minéraux. — Les principaux cations sont dosés par la torche.à plasma. Environ 20mg de matière sèche sont attaqués par de l'acide nitrique à 65% dans des fioles en quartz. Le mélange est porté à ébullition jusqu'à dégradation complète de la matière organique puis évaporé à sec et repris par de l'acide chlorhydrique. La solution est filtrée sur papier Wathman n° 541 avant l'analyse.

III. RÉSULTATS ET DISCUSSION. — L'évolution au cours des passages successifs du nombre des clones vivants, de l'effectif et du taux de multiplication ( 1) est représentée dans la figure 1 A. Le nombre de clones diminue progressivement du premier au sixième passage passant de 24 à 15 clones. Avant leur dégénérescence, la majorité des clones a montré un gonflement de la tige. L'effectif, ainsi que le taux de multiplication (fig. 1 A) augmentent nettement à partir du quatrième passage. Il existe une variabilité interclonale et intraclonale importante. Le clone ri°- 1, dont l'effectif est le plus élevé (fig. 1B) montre une augmentation de l'effectif très nette du premier au neuvième passage. Le taux de multiplication est assez variable mais pendant les neuf premiers passages, il est en moyenne de 0,74 alors que pendant les quatre suivants, il n'est que de 0,29. Les microboutures qui ne se multiplient pas, montrent un gonflement de la tige et une dormance des bourgeons : arrêt de la croissance et présence d'écaillés brunes. Ces microboutures anormales (photo 2, lot B15 G) sont distinguées des microboutures normales (photo 1, lot B15N).

EXPLICATIONS DE LA PLANCHE

Fig. 1. — Evolution du nombre de clones, de l'effectif et du taux de multiplication au cours des passages de microboutures de douglas;. la durée d'un passage est d'environ 4-5 semaines. A : 24 clones en premier passage. B ; Illustration du comportement d'un clone (n° 1) maintenu au cours de 13 passages.

Fig. 1. .—- Evolution of the clonal number, the clonal strength and the multiplication rate during the subcultures of the douglas fir microcuttings ; the time of each subculture is approximately 4 to 5 weeks. A: 24 clones in the first subculture. B: clone No. 1 subcultivated during 13 subcultures.

Photo 1. .— Microbouture de douglas, clone n° 1 sur le milieu de base avec charbon actif : état normal. Picture1. — Douglas fir microcutting, clone No. 1 on the basai médium containing activated charcoal: normal state.

Photo 2. — Microbouture de douglas, clone n° 1 sur le milieu de base avec charbon actif : état anormal.

Picture 2. — Douglas fir microcutting, clone No. 1 on the basai médium containing activated charcoal: (Anormal state.

Photo 3. — Microbouture de douglas, clone n° 1 sur le milieu de base sans charbon actif, saccharose 5g.I" 1 : (la microbouture a été cultivée auparavant sur ce même milieu avec acide indole butyrique 5.10M)- 7 : état anormal redevenu normal.

Picture 3. —. Douglas fir microcutting, clone 1 on the basai médium without activated charcoal, sucrose 5g.I' 1 (the microcutting was cultived before on the same médium with indol butyric acid 5x 10M)- 7: abnormal state becoming normal.


PLANCHE I/PLATE I

FAOUZI BEKKAOUI

Fig. 1

Photo 1

Photo 2

Photo 3



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TABLEAU I

Composition en minéraux (mg/gramme de matière sèche)

et rapport matière sèche/matière fraîche (ms/mf) de microboutures de douglas.

Minerai composition (mg/gramme dry weight)

and the rate dry weight/freish weight of douglas fir microcuttings.

:- Minéraux (mg/gms)

Lots ms/mf K Ca P Mg Na Fe Mn Zn Cu B

Al......... 18,9 11,2 1,81 2,44 0,89 3,05 2,26 0,72 0,107 0,031 0,059

A15.-....... . 18,1 18,9 2,98 2,19' 1,00 ' 3,90 1,60 0,18 0,288 0,019 0,087

B15N 17,0 20,6 2,94 2,22 0,97 3,67 1,02 0,16 0,092 0,013 0,111

B15G 19,4 20,4 2,89 2,35 1,04 3,87 1,12 0,17 0,122 0,010 0,104

TABLEAU II

Composition en hormones (g/gramme de matière sèche) de microboutures de douglas ;

% V représente le pourcentage de variation de A15 par rapport à Al et de B15 par rapport à B15N.

Hormonal composition (g/gramme dry weight) of douglas fir microcuttings.

Hormones (ug/gms)

Lots AIA %V ABA %V Z + ZR %V

Al,. ... . . .... . . 1,07 2,77 0,17

A15 1,49 +39 4,82 +74 0.72 +323

B15.N .... 1,05 4,55 0,62

B15G ....:.... . 0,55 -48 2,92 -36 2,19 +253

Al : lot ayant subi 1 passage sur le milieu de base, dosage effectué sur plusieurs clones. A15 : lot ayant subi 15 passages sur le milieu de base, dosage effectué sur 10 clones. B15N : lot ayant subi 15 passages sur le milieu de base, dosage effectué sur 1 clone n° 1, les microboutures sont normales (photo 1). B15G : lot ayant subi 15 passages sur le milieu de base, dosage effectué sur 1 Clone n° 1, les microboutures présentent une tige gonflée (photo 2).

Al: one subculture on the basai médium, the dosage is dotie on several clones. AI5 : 15 subcultures on the: basai médium, the dosage is donc on 10 clones. B15N : 15 subcultures on the basai médium, the dosage is dorie on the clone No. 1, the microcuttings are normal (picture 1). B15G : 15 subcultures on the basai médium, the dosage is done on the clone No. 1, the cuttings présent a swelling stem (picture 2).

Les dosages de minéraux sont effectués sur les lots : Al, A15 d'une part et B15N et B15G d'autre part (tableau I). Les microboutures repiquées quinze fois, contiennent plus de calcium et de potassium et moins de fer, de cuivre et de manganèse que les microboutures ayant subi un passage. La comparaison des microboutures normales (B15N) et anormales ou gonflées (B15 G) ne montre pas de différence de teneur en minéraux. Le charbon actif s'est souvent révélé favorable pour la croissance et Forganogenèse ([2], [4], [12]). Il agirait en adsorbant des substances organiques telles que les phénols [8] ou l'auxine[7] mais aussi minérales tels que le fer et le cuivre [13]. Il peut aussi apporter des substances comme les phénolamines [4]. Par ces différentes actions, la présence du charbon actif en continu, pourrait devenir défavorable et serait à l'origine de la dégénérescence observée. En effet, lorsque des microboutures anormales sont transférées sur un milieu sans charbon actif, on peut observer un débourrement du bourgeon dormant, qui régénéré une tige normale (photo 3).

Les repiquages successifs provoquent une augmentation des teneurs en AIA et ABA et surtout en Z + ZR (tableau II) ; quant aux microboutures anormales (B15G), comparées aux microboutures normales (B15N), elles présentent une diminution des teneurs en AIA et ABA ; par contre les quantités en Z+ZR sont très fortement accrues. Une forte augmentation du rapport Z+ZR/AIA (0,6 pour B15N et 4,0 pour B15G) pourrait refléter la diminution de réactivité des microboutures ainsi que leur morphologie anormale.


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Les passages successifs seraient à l'origine de l'augmentation des cytokinines. Takeno et coll. [17] ont en effet observé chez Malus pumila, une augmentation des teneurs en cytokinines après plusieurs passages. Ce phénomène peut être apparenté à Fanergie observée par Gautheret [9]. Les microboutures après plusieurs passages contiennent plus de cytokinines ; on peut penser qu'elles sont le siège du même phénomène. Einset et Skoog [6] ont, en effet, observé le phénomène d'anergie vis-à-vis des cytokinines dans les cals de tabac.

La dégénérescence clonale existe dans les conditions naturelles chez certaines espèces cultivées [19]. Généralement, on l'observe lorsqu'il y a multiplication végétative successive et lorsque les conditions du milieu sont défavorables. Chez le douglas cultivé in vitro, la dégénérescence observée est différente de celles rencontrées généralement in vitro ; elle est caractérisée par une diminution du taux de multiplication, une dormance des bourgeons, un gonflement de la tige et serait corrélée avec une teneur élevée de Z+ZR.

IV. CONCLUSION. — La multiplication végétative sur un même milieu de culture de microboutures de douglas, même si elle est relativement importante pendant les dix premiers passages, devient négligeable par la suite. La diminution de la multiplication serait corrélée avec une teneur en cytokinine très élevée. L'utilisation de milieux de composition minérale différente ou de séquences de milieux différents au cours des passages permettrait d'éviter la dégénérescence observée. Des expériences sont menées actuellement pour confirmer cette hypothèse.

(') Le taux de multiplication=(Effectif du passage n +1 —Effectif du passage n)/Effectif du passage n. Reçue le 27 janvier 1986, acceptée après révision le 21 avril 1986.

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4, place Jussieu, 15230 Paris Cedex 05.


C. R. Acad. Sc. Paris, t. 303, Série III, n° 2, 1986

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SUR L'ACCIDENT NUCLEAIRE DE TCHERNOBYL

Note de Raymond Latarjet, Membre de l'Académie

L'Académie a demandé à Raymond Latarjet de lire lors de sa séance publique du 2 juin, une note résumant les points essentiels et. les conclusions majeures de l'exposé qu'il avait présenté en Comité Secret le 26 mai. L'Académie à décidé que cette Note qui a reçu son plein.assentiment serait exceptionnellement publiée en tête du : prochain fascicule de chacune des séries scientifiques des Comptes rendus. YLe

YLe 26 avril dernier, un accident s'est produit dans la centrale nucléaire de Tchernobyl (Ukraine, U.R.S.S.) à 150 km au nord de Kiev, le plus grave de tous les accidents connus survenus dans l'industrie nucléaire civile. Beaucoup de données essentielles nous manquent encore pour nous faire une image adéquate, des événements et de leurs conséquences pour l'U.R.S.S., et, à un moindre degré, pour l'Europe et, en particulier pour la France. Il nous semble néanmoins possible de dire aujourd'hui ce qui suit.

I. L'ACCIDENT. — La centrale de Tchernobyl comprend quatre reacteurs de 1000 MW à double destination, la production d'électricité et la production de plutonium (3 kg de Pu par tonne d'U brûlé). Ces installations soviétiques se distinguent des installations françaises de même puissance par trois autres différences majeures qui, toutes trois, vont dans le sens d'une sûreté moindre :

(a) Le réacteur est du type graphite-eau bouillante. En France, comme aux U.S.A., on a adopté la filière PWR à eau pressurisée. Le graphite ne subsiste plus chez nous que dans les anciennes installations (Chinon, Bugey, Marcoule et Saint-Laurent-des-Eaux), Encore, le fluide calo-porteur y est-il l'anhydride carbonique dans lequel le graphite a une probabilité de combustion pratiquement nulle, ce qui n'est pas le cas dans la vapeur d'eau.

(b) Il n'y a qu'une circulation d'eau. Celle qui alimente la turbine est celle-là même qui refroidit le coeur. Elle est radioactive. En France, la chaleur est transférée, au sein d'un échangeur étanche, du circuit primaire radioactif de refroidissement au circuit secondaire non radioactif d'alimentation de la turbine.

(c) II n'y a, semble-t-il, autour du réacteur soviétique, qu'une enceinte calculée pour résister à 1,9 bar, et ne ménageant qu'un faible volume de détente, alors que les réacteurs français et américains bénéficient d'un vaste volume de détente cerné par une très résistante enceinte, dite de confinement, comportant une paroi d'acier et du béton armé sous 1 m d'épaisseur. L'enceinte soviétique a cédé à l'explosion d'hydrogène, alors que celle de Three Mile Island avait résisté dans des circonstances comparables.

On ignore — et on ignorera peut-être toujours — comment l'accident s'est amorcé (circonstance fortuite ou erreur humaine?) et comment il s'est déroulé. D'après les quelques données dont on dispose, on peut toutefois considérer comme plausible le scénario suivant.

A 1 h 23 (heure locale) un échauffèment anormal est détecté dans le réacteur n° 4. Il ne semble pas inquiéter outre mesure le personnel de service puisque c'est seulement à % h qu'on réduit la puissance du réacteur de 1000 à 200 MW. Rappelons ici que l'uranium est disposé dans des tubes de force de zirconium au sein desquels circule Veau de refroidissement,

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ces tubes étant eux-mêmes noyés dans le graphite modérateur. L'échauffement augmente, et le graphite, qui brûle à 1400°, prend feu. Le feu élève encore la température qui dépasse 2000°, et. approche le point de fusion du coeur. La température s'est peut-être élevée beaucoup plus. On a, en effet détecté des traces de plutonium dans le nuage sur l'Europe occidentale (à des concentrations sans danger), traces qui suggèrent qu'une fraction du coeur, non seulement a fondu, mais s'est vaporisée, ce qui impliquerait une température d'au moins 3000°.

On cherche alors à éteindre le feu en déversant de l'eau sur le foyer. C'est ainsi qu'on était venu à bout du feu de graphite à Windscale (Angleterre) en 1957 et à La Hague en 1980. Mais il faut des masses d'eau considérables, et celles-ci s'avérèrent en l'occurence insuffisantes. Bien plus même, en présence d'eau à très haute température, le zirconium s'oxyde tandis que l'hydrogène se dégage (on arrête alors les trois autres réacteurs). A 17 h 30, l'hydrogène, qui s'est accumulé, explose, rompant l'enveloppe métallique du coeur, ou ce qui en reste, détruisant l'enceinte et le bâtiment, et envoyant à une hauteur de 500 à 1 500 m un panache de gaz et de poussières radioactifs qui va être à l'origine du nuage de contamination à longue distance. Il y a alors deux tués, l'un écrasé, l'autre brûlé.

Le dimanche matin, devant l'ampleur de ce qui se passe, les autorités ukrainiennes, qui, jusque là, ont pensé pouvoir maîtriser l'affaire elles-mêmes, décident d'évacuer la population sur un rayon de 10 km, soit 40000 personnes, y compris la petite ville de Pripiat, distance qui sépare de la frontière avec la Byélo-Russie. L'évacuation a lieu le dimanche après-midi.

Il semble que le gouvernement central de Moscou n'ait été informé que le lendemain matin. L'ordre fut alors donné de Moscou d'étendre à 30 km le rayon de la zone interdite, soit d'évacuer promptement 50000 autres habitants.

Pendant plusieurs jours, le graphite continue de brûler, la radioactivité continue de s'envoler dans le panache et de s'infiltrer à,ans le sol. En prenant de grands risques, le personnel de la centrale, les pompiers convoqués en renfort, et les pilotes d'hélicoptères, s'efforcent de circonscrire l'incendie en recouvrant le foyer d'une carapace de sable, de plomb, et de bore (5 000 t déversées à partir du mardi 29). D'autres, en même temps, attaquent par le sous-sol pour juguler l'infiltration, en isolant, par du ciment et par le gel du terrain (azote liquide), le foyer radioactif de la nappe phréatique sous-jacente. C'est parmi ces personnels que se trouvent les sujets fortement irradiés dont nous parlerons plus loin. On ne peut qu'admirer l'ampleur des efforts pleins de risques déployés pendant cette période.

Ces efforts ne restent pas vains. Le foyer se calme peu à peu. Le 9 mai un premier groupe d'experts étrangers est admis sur les lieux (de l'Agence Internationale de l'Énergie Atomique de Vienne, conduits par Hans Blix, directeur de cette agence). Ils rapportent que la température du réacteur est encore élevée, mais bien au-dessous du point de fusion, qu'il reste encore beaucoup d'énergie non encore libérée dans ce réacteur, et qu'il faudra plusieurs mois pour que cette énergie tombe à zéro.

IL CONSÉQUENCES LOCALES. LES IRRADIÉ À FORTES DOSES. — Par suite de la fusion du coeur, de la dispersion des eaux radioactives, et de la destruction du bâtiment sous l'explosion (qui ne s'était pas produite à Three Mile Island), et selon ce que l'on peut calculer, le champ de radiations fut très intense à proximité du foyer : de 2 500 à 70 rads.h' 1 au


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début, depuis le-voisinage même du réacteur jusqu'à une distance de 500 m ; de 270 à 8 rads.h- 1 aux mêmes endroits 4 jours plus tard (1).

..Très tôt, 400 sujets furent évacués, comme fortement irradiés. 200 furent hospitalisés à Moscou dans un hôpital où se trouve un service spécialisé dans, le traitement des irradiés, les autres dispersés dans d'autres hôpitaux. Le service moscovite est dirigé,par le Dr Angelina Gouskova, spécialiste très compétente qui est venue plusieurs fois à l'Institut Curie à Paris. Le gouvernement soviétique, jaloux de son image, refusa les aides officielles étrangères venues notamment des Etats-Unis et de France, mais : il accepta l'initiative privée de l'industriel américain Armand Ranimer, ami des dirigeants soviétiques, Renvoyer à ses frais une équipe dirigée par le Dr Robert Gale (Los Angeles).

Parmi les 200 hospitalisés, un petit nombre furent considérés comme justiciables d'une transplantation médullaire. Parmi eux, 19 furent rapidement, traités, lei{autres ayant reçu dès doses de radiations suffisamment réduites pour que ce traitement ne s'imposât pas, ou, au contraire, des doses trop fortes pour qu'on pût en attendre.uneffet.salvateur (car l'intervalle des doses — 500-1 000 rems — au sein duquel la transplantation peut être bénéfique, est malheureusement restreint). Ces transplantations soulèvent le problème du typage immuno-génétique du receveur, lequel dicte le choix des donneur s i{c'est de ce typage que le Dr Gale est un spécialiste). En. l'occurrence, ce typage fut rendu, souvent impossible

du.fait de l'aplàsie lymphocytàire très précoce dans laquelle les sujetsSE trouvaient déjà.

C'est pourquoi, sur 19 transplantations, 13 seulement utilisèrent des moelles, et 6 des foies foetaux, moins différenciés du point de vue immuno-génétique. On annonçait 1 décès le 15 mai, il le 20 mai, 20 le 23 mai. Ces décès précoces ne sont pas . des «morts Mmatôlogiques » qui ne surviennent .guère avant le30e jour, niais plutôt des «morts intestinales » contre lesquelles la transfusion, ne peut pas grand chose. C'est pourquoi l'on peut s'attendre à.: ce que, dans les jours qui viennent, croissele: nombre des victimes lorsque les morts hêmatologiques vont se produire.

III. LA POLLUTION RÉGIONALE. — On ne peut pas en dire grand chose pour l'instant, faute de renseignements. On sait seulement que les doses de radiations directes et que la radioactivité déposée furent considérables sur un rayon de plusieurs kilomètres, et s'atténuèrent vite avec la distance. Ainsi, les doses de radiations reçues au sol du fait du panache pendant la durée de celui-ci seraient estimées de l'ordre de 200 rads à 1 km, de 30 rads à 5 km, de 1 ràd à 30 km, et de 0,1 rad à 100 km. De leur côté, les doses au sol dues au dépôt radioactif et totalisées sur les 4 premiers jours, seraient d'environ 100 rads à 1 km, 15 rads à 5 km, et 0,40 rad à 30 km. Le débit de dose le 9 mai à 60 km de la centrale aurait été de : 8 millirads par jour.

.Ces valeurs font pressentir que de nombreux habitants ont reçu,:avant leur évacuation, de fortes doses, sublétales certes, mais porteuses de sérieuses conséquences pathologiques à plus ou moins-long terme et avec une fréquence d'autant plus élevée qu'on était plus proche du foyer, Notons, toutefois, que, sauf pour les sujets les plus, proches de là centrale, ces doses sont inférieures dans leur ensemble à celles que reçurent-les survivants d'Hiroshima et de Nagasaki.. Aussi, comme dans le cas du Japon, la communauté internationale doit.

■'vC 1) Le rad est une unité de dose de radiations ionisantes. Il représente:une densité d'énergie absorbée^ à savoir 100 ergs absorbés par gramme de la substance absorbante. Le rem est un rad affecté d'un « facteur d'efficacité . biologique » (égal à 1 pour les rayons y, à 10 pour les neutrons, etc.). Le becquerel est-une nouvelle unité de radioactivité. C'est la quantité du radioélément considéré qui subit une transmutation par seconde (lcurie-3,7A0xo Bq).


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pouvoir tirer les enseignements de ce douloureux événement. Souhaitons que les autorités soviétiques fournissent un jour toutes les précisions utiles sur la distribution territoriale des divers radio-éléments, sur les doses totales reçues, et procèdent, pendant plusieurs décennies, au suivi médical des sujets exposés, ainsi qu'il a été fait au Japon.

IV. LES RETOMBÉES SUR L'EUROPE. — Le léger vent du sud-est qui soufflait sur l'Ukraine entraîna le panache radioactif sous forme de nuage vers la Pologne, la Finlande et la Suède. C'est d'ailleurs en Suède que fut enregistrée la première élévation anormale de la radioactivité. Une analyse de l'air effectuée sur ce pays le 2 mai montra que la radioactivité provenait pour 90% d'éléments à vie brève, en sorte qu'on était assuré qu'elle décroîtrait rapidement (de 2 fois par semaine). On trouva 46% d'iode-131 (période & jours), 36 % de tellure-132 (3,3 j), 7% de baryum-140 (12 j) ; de nombreux éléments à l'état de traces, et 4% d'un élément à vie moyenne, le césium-137 (27 ans). La présence de baryum suggérait celle, probable, de strontium-90 (30 ans) que T organisme fixe dans les os et dans le lait, car il ne le distingue pas du calcium.

Puis, au gré des vents, le nuage se dirigea vers le sud-ouest, survolant l'Europe centrale. Il atteignit la France par sa région sud-est, et ne s'y attarda pas, repoussé vers l'est par les vents océaniques. En une semaine, il effectua ainsi un tour d'Europe. au cours duquel il perdit plus de la moitié de son activité. Le dépôt radioactif fut en général très faible. On doit toutefois mentionner quelques dépôts supérieurs à la moyenne produits localement par des pluies dans la région de Munich où la radiation, normalement de 8 µrads.h- 1 s'éleva à 110 µrads. h-l, avec un dépôt de 40 kBq. m- 2 de 131Cs qui est digne de remarque.

L'Organisation Mondiale de la Santé, aussitôt alertée, commit un groupe international d'experts avec mission de collecter les résultats recueillis par les divers états européens, et de donner ses recommandations. Celles-ci furent diffusées le 13 mai. Voici, d'une manière abrégée, l'essentiel de ces recommandations, avec lesquelles, sur la base des mesures et de leurs résultats, l'Académie se déclare pleinement d'accord.

1° En dehors de l'U.R.S.S,, les doses furent trop faibles pour provoquer d'accident de santé à court terme.

2° En Europe, l'irradiation externe (par le nuage et par les dépôts) fut et reste trop faible pour soulever préoccupations et inquiétudes.

3° Pour ce qui est de l'irradiation interne (par l'air inhalé, les aliments et les boissons) deux principaux contaminants sont à considérer, l'iode-131 et le césium-137.

(a) En ce qui concerne Piode-131, qui se localise principalement dans la thyroïde, et pourrait menacer les enfants buveurs de lait la limite admise dans plusieurs pays, dont la France, de 2,000 Bq.l- 1, aujourd'hui remise en question dans le sens de la baisse, est déjà très prudente. En admettant plusieurs hypothèses, qui, toutes, surestiment le risque, cette dose provoquerait, au plus, un cancer de la thyroïde parmi un million d'enfants, alors que, quoi qu'on fasse, ceux-ci développeront plus tard 280000 cancers d'autres sortes. Les contaminations européennes, qui sont inférieures à cette limite, et qui, de plus, diminuent rapidement, ne doivent donc pas inquiéter.

(b) En ce qui concerne le césium-137, dont l'activité initiale dans le panache était de l'ordre du dixième de celle de l'iode, la situation est différente, du fait de son dépôt rapide au sol par gravité, et du fait de sa longue période. Il est peu probable que les niveaux mesurés en Europe soulèvent des problèmes, mais, étant donné la longue durée de l'exposition, on ne pourra pas donner de précision tant que la distribution territoriale de cet élément n'aura pas été complètement déterminée.


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4e Les contaminations relevées en Espagne, France, Islande et Portugal, sont considérées comme non significatives.

5° Plusieurs décisions prises à la hâte n'étaient pas justifiées en dehors de l'U.R.S.S., notamment :

— ne pas boire les eaux de surface habituellement qualifiées de potables ;

— déconseiller le lait maternel aux bébés ;

— limiter les séjours à l'extérieur des bâtiments ;

— absorber des comprimés iodés, leur risque propre étant supérieur du risque négligeable contre lequel on les aprescrits;

— interdire ou restreindre les échanges, alimentaires, hormis peut-être pour le lait frais en provenance de fermes situées dans les quelques zones signalées ci-dessus.

A ces conclusions de l'Organisation Mondiale de la Santé, nous ajoutons qu'en conséquence, on ne saurait reprocher aux autorités soviétiques leur refus d'indemniser des pertes consécutives à des décisions qui ne s'imposaient pas.

V. LES RETOMBÉES SUR'LÀ FRANCE. — Ëh France, le Service Central de Protection contre les Radiations Ionisantes (Ministère de la Santé) a été tout naturellement chargé d'enregistrer Vévolution quantitative et qualitative de la radioactivité consécutivement à l'accident de Tchernobyl. Grâce à son réseau permanent de dispositifs de mesures couvrant le territoire entier, et grâce: à son personnel compétent dirigé par le Professeur Pierre Pellerin, le S.C.P.R.I. s'est remarquablement acquitté de cette tâche. Au cours des seules deux premières semaines, il a procédé à plus d'un millier de mesures, et, dès le 30 avril, il fournissait aux Autorités les éléments dont elles avaient besoin. (On a reproché au S:C.P.R,I. de n'avoir pas convenablement informé le public ; ce n'était pas à lui de le faire, et personne ne s'en est véritablement chargé.)

De son -côté, l'Institut de Protection et de\. Sûreté. Nucléaire (C.EiA.), a procédé à des mesures régulières en neuf stations (situées là où il y a des réacteurs : Saclay, Grenoble, Cadarache, Marcoule, La Hague...).

Ces mesures ont porté sur des échantillons très divers : air et poussières atmosphériques, sols, eaux de pluie et de rivière, végétaux (légumes et herbages), lait, viande et boissons, thyroïdes de bovins. En déterminant d'une part le rayonnement, d'autre part les proportions respectives des isotopes présents, on à pu le plus souvent distinguer l'exposition immédiate due au nuage, et l'exposition différée due aux dépôts que le nuage a laissés derrière lui.

Dès le 29 avril, on releva une augmentation de la radioactivité qui commença par le sud-est, puis s'étendit vers le nord-ouest en s'amenuisant progressivement de 2 à 3 fois. La carte de distribution de la radioactivité sur l'ensemble du territoire fut dressée et communiquée chaque jour. Le maximum fut atteint le 2 mai qui persista 3 jours, suivi d'une décrue générale qui s'explique par l'éloignement du nuage vers l'est, par la dilution atmosphérique, et par la décroissance des éléments à vie courte. Le 1 mai le bulletin du S.C.P.R.I. précisait : « Ni la situation actuelle, ni son évolution ultérieure, ne justifient dans notre pays quelque contre-mesure que ce soit ». Il rejoignait ainsi la conclusion de l'O.M.S. considérant la contamination en France comme non significative.

On trouvera les détails des dosages dans les rapports du S.C.P.R.L et de l'I.P.S.N. Contentons-nous ici de souligner que les niveaux sont restés très bas. Une façon globale assez explicite d'en témoigner est d'intégrer toutes les irradiations (de l'extérieur et de l'intérieur), et d'en faire la moyenne sur l'ensemble du territoire — sachant que les écarts


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d'un point à un autre n'ont pas excédé le facteur 3 —. On obtient ainsi, sinon une valeur précise, du moins un ordre de grandeur de l'irradiation totale.

Ainsi calculé, le débit de dose moyen au niveau du sol n'a jamais excédé 1,5 mrem par jour, soit 4 fois le bruit de fond naturel en France, soit aussi 1,5 fois seulement celui des régions granitiques. Encore cette très faible augmentation n'a-t-elle duré que quelques jours. Son caractère transitaire interdit de l'intégrer à plus longues durées. Si ce maximum s'est maintenu pendant 4 jours, la dose excédentaire moyenne reçue aura été de 6 mrems, valeur négligeable. Elle correspond, en effet, pour fixer les idées, à l'excédent de Virradiation naturelle reçue à Mexico en 2 semaines, ou pendant deux vols transatlantiques aller et retour. Elle ne peut pas produire plus de mutations ou de cancers que, par exemple, la quantité d'éthylène absorbée par le fumeur lorsqu'il consomme quelques dizaines de cigarettes.

VI. CONCLUSIONS. — 1° La gravité exceptionnelle de l'accident de Tchernobyl et l'étendue de ses conséquences proviennent de ce que le bâtiment du réacteur n'a pas résisté et que la radioactivité s'est échappée en panache à l'extérieur. A cet égard, les centrales françaises sont plus sûres. Souhaitons néanmoins de connaître bientôt les détails de l'accident afin d'en, tirer les enseignements pour la sûreté de nos installations nucléaires.

2° Les conséquences biologiques et médicales pour une population importante et pour une fraction étendue du territoire soviétique sont déjà graves, et se poursuivront longtemps. Souhaitons ici également de recevoir les informations qui seront pleines d'enseignements.

3° La pollution radioactive sur l'Europe a, d'une manière générale, été très faible, et a rapidement diminué. Elle ne devrait soulever aucune inquiétude. Il nous semble que les contre-mesures prises ne s'imposaient pas. Cette conclusion est particulièrement valable pour la France qui, située à l'extrémité occidentale du périple du nuage radioactif, n'a subi qu'une contamination insignifiante, d'ailleurs de courte durée.

4° L'information du public français a été mal conduite et insuffisante. Une instance, telle qu'était, il y a peu, le Conseil de l'Information sur l'Énergie électro-nucléaire, eut été très utile en l'occurrence.


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OCÉANOGRAPHIE BIOLOGIQUE. — Découverte de communautés animales profondes durant la campagne franco-japonaise KAIKO de plongées dans les fosses de subduction autour du Japon. -Note deLucien Laubier, Sugoru Ohta et Myriam Sïbùet, présentée par Lucien Laubier, Correspondant de l'Académie.

Au cours de vingt-sept plongées du submersible Nautile pendant l'été 1985 dans'les fosses de subduction autour du Japon (fosses de Nankai, du Japon et des Kouriles), des communautés bénthiques animales caractérisées par la prédominance de grands bivalves du genre Càlyptogena (famille dès Vesicomyidae) ont été découvertes dans des sédiments abyssaux. Les communautés observées entre 3800-et 4020m dans le canyon"-•; de Tenryu situé sûr le prisme d'accrétion sédimentaire de la fosse de Nankai et au pied de la ride de Zenisu, sont dominées par deux espèces distinctes de Càlyptogena nouvelles pour la science. Dés communautés souvent représentées par des colonies dispersées occupant des surfaces plus variables, caractérisées par une troisième" espèce de Calyptogena également nouvelle, ont été observées plus profondément entre 5130 et 5 960m sur les pentes-internes des fosses du Japon et des Kouriles. L'analyse des photographies-prises par le Nautile permet 1 "de préciser l'importance de la biomasse brute de ces communautés, qui.varie entre 16 et 51 kg/m 2 (poids frais .coquilles comprises).: Plusieurs observations et la comparaison avec d'autresiommunautés: animales profondes découvertes récemmentindiquent que ces colonies de bivalves dépendent en majeure, partie de phénomènes, [chimiosynthétiques eux-mêmes liés ,aux suintements d'eau interstitielle expulsée dés sédiments profonds par la 1 subduction. Le méthane, présent dans l'eau de mer qui baigne ces colonies, est vraisemblablement à l'origine, de la chimiosynthèse. Jusqu'à présent, on ne connaissait pas de communautés chimiosynthétiques au-delà d'environ 3 000 m.

.BIOLOGICAL OCEANOGRAPHY. — Discovery of deep animal communities during the french-japanesev project KAIKO in the subduction trenches around Japan.

::.iTwehtyseven dives of the submersible Nautile in the subduction zones around Japan conducted during Summérj 1985:in the French-Japanese Project KAIKO proved that fairly luxuriant benthic animal communities dominaièdl by deep-sea giant clams belonging to the genus Calyptogena (family Vesicomyidae) were.consistently présent at

: abyssal depths, from. 3,800 to 5,960 m ([1], [2]). According to the bathymétrie range cmdihe géographie locations,

twodifferent types of clam colonies have.been discovered — The first type extends from 3,800 to 4,020 min the mouth of Tenryu canyon on the accretionary prism and at

: the top of basement swell of Zenisu ridge, both located in the eastern Nankai subduction zone. The bivalve colonies are composed of two différent undescribed speciespf Calyptogena, often.associated with several speciesofinverïebfates and différent types of animal tracks'at the sédiment surface. Récurrent dives on the same colohy. séparatéd by four days-enable to demonstrate that Calyptogena spp. are able to mové around on several.-:

-decimeters keeping their vertical position within the sédiment with the hinged apex of the shell as leading edge The second type extends from 5,130 to 5,960 m in the landward wallofthe Japan trench, the axis of the Japon trench West of Kashima seamount and the. landward wall of western Kurile trench. This community is: dominated by a third undescribed species of Calyptogenaofpeculiar slender shape frequèntly associated with.. several other invertebrate species whiçh vary according to depth and sites. This type of colony has a less cohtinuous distribution and a greater variability in colony size than the first type:

The crudè biomqss (total wet weight iheluding the shelt) is extremely high for.such depths, ranging from. 16 kg/m 2 (Tenryu canyon and Zenisu ridge) to 24-42kg/mi (near Kashima seamouni) and.even 51 kg/m 2 (Japan trench), for Calyptogena only. Such high biomasses combined with the occurrence of haemoglobin in ail three.. Calyptogena species and the situation of the colonies in the geological framework clearly suggest that thèse

- communities are susiained by chemasynthetic processes rather than photosynthetic organic sources. Similar. communities have been recently described at shallowerdepths ôri the accretionary prism ofthe Oregon subduction :

zone [3] and a model of chemosynthetic energy source derived from pore water methane has been proposed [4] Geochemiçal analyses performed on water samples from Japon and Kurile trenches communities demonstraite the occurrence of seepage of pore water containing thermogenic methane [5]. Although ; some work remains tobe: donc, the distribution, disposition and densities ofthe japanese bivalve colonies can only be explained in the general contëxt of chemosynthetic mechanisms using methane dissolved in pore water squeezed from the sédiments as a chémical source of energy. Thèse communities are to date the deepest record of benthic life associated with chemosynthetic processes.

Au cours de la deuxième phase du projet franco-japonais KAIKO d'étude des phénomèhes de subduction le long de la côte Pacifique du Japon [6], 27 plongées du submersible %

Nautile ont étéeffectuées pendant l'été 1985. Neuf d'entre elles ont permis de découvrir dans trois zones géographiques distinctes des communautés bénthiques animales dominées par trois espèces nouvelles de bivalves appartenant au genre Calyptogena (famille des Vesicomyidae), occupant des surfaces réduites et caractérisées par une biomasse très élevée (le tableau fournit les coordonnées et les profondeurs des sept plongées analysées). -

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TABLEAU

Liste des plongées où des colonies de Calyptogena spp. ont été observées sur les photographies.

List of dives where colonies of Calyptogena spp. have been observed on the pictures.

Profondeurs Profondeurs Nombre début où

de et fin de Càlyptogena

Plongée Zone géographique Plongeur Date Durée clichés plongée a été observé

KD3 Fossé de Nankai, C. Rangin 6/06/85 12h01'15" 468 3 855-3 654 m 3 787-3 835 m

canyon de Tenryu 17h47'38" 33°37,2'N ; 137°31,6'E

KD5 Fossé de Nankai, A. Taira 10/06/85 13h23'59" 222 3 765-3 832 m 3 830 m

canyon de Tenryu 17h45'30" 33°36,9'N ; 137°32,0'E

KD6 Ride de Zenisu J. Charvet 11/06/85 15hll'07" 207 4 216-4 026 m 4021m

33°15',8'N; 137°23,0'E 18hl8'46"

KD14 Fosse du Japon, K. Fujioka 22/07/85 13h47'14" 516 5 890-5635m 5 640-5695m

MontKashima 18h06'44" 35°54,2'N; 142°30,7'E

KD18 Fosse du Japon, J. P. Cadet 31/07/85 13h24'32" 424 5938-5652m 5653-5960m

pente interne 17 h 34'07" | 40°06,3'N; 144°10,6'E

KD21 Fosse des Kourilles, J. Aubouin 3/08/85 12h49'18" 231 5785-4981m 5131-5785m

pente interne 17hl2'01" 41°18,5'N; 144°48,3'E

KD23 Fosse du Japon, N. Niitsuma 5/08/85 13h02'36" 300 5 679-5 225 m 5479-5 660 m

pente interne 16h56'05" 40°06,5'N; 144°10,0'E

MÉTHODES. — Cette étude préliminaire a été réalisée à partir de l'examen des photographies prises durant les plongées par deux appareils photographiques sous-marins (caméras Benthos modèle 372) montés obliquement à l'avant du sous-marin Nautile. Les photographies ont été analysées par projections. L'observation des enregistrements de vidéo en couleurs a permis de compléter l'interprétation. Les dimensions des communautés animales et les densités de bivalves ont été estimées à partir des dimensions moyennes et du nombre total de bivalves prélevés dans un carottier de 250 cm 2 de section manié par un bras télémanipulateur du submersible. Les identifications de la faune associée aux colonies de bivalves et non prélevée ont été possibles grâce aux informations réunies par l'Océan Research Institute de l'Université de Tokyo sur la faune de la fosse du Japon et du fossé de Nankai.

RÉSULTATS. — Canyon de Tenryu et ride de Zenisu :

Le canyon de Tenryu est une profonde vallée sous-marine entaillant le prisme sédimentaire accumulé le long de la fosse de Nankai à la limite de la plaque eurasienne au cours de la subduction de la plaque Philippines. La ride de Zenisu est un fragment de croûte océanique rejeté vers le haut à la suite d'une phase de compression intraocéanique [7]. Les premières colonies de bivalves ont été découvertes par 3 830 m environ, au cours des plongées KD 3 et KD 5, sur la ligne de contact entre le canyon de Tenryu et le prisme d'accrétion de Nankai. Elles sont composées de deux espèces de Calyptogena, accompagnées à la périphérie de polychètes serpulides, d'actinies et, encore au-delà, de gastéropodes buccinidés, d'une espèce de Munidopsis et d'une holothurie synallactide dont les individus portent tous de deux à six petites actinies. Les colonies de Calyptogena se distinguent par leur forme ovale ou circulaire de petite dimension et leur répartition relativement alignée sur quelques dizaines de mètres. D'après l'étude d'une colonie d'un diamètre de 60 cm et d'une surface de 0,3 m 2, la densité des bivalves de taille moyenne


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(7 cm de longueur) peut atteindre 2 000 individus au mètre carré soit une biomasse fraîche de 16 kg/m 2. Les bivalves sont enterrés en position verticale aux quatre cinquièmes, la partie postérieure seule est visible hors du sédiment. Les tissus des deux espèces de Calyptogena contiennent une grande quantité d'hémoglobine : des individus accidentellement brisés pendant le prélèvement libèrent des nuages de sang rouge vif. Des mesures de température à l'intérieur des colonies ont révélé une légère anomalie positive de 0,2 à 0,6°C par rapport à la température ambiante de 1,2°C. Alors que les sédiments de surface avoisinànts sont très fins et de teinte brun verdâtre, le Sédiment des colonies est remanié, noirâtre'et plus grossier, depuis la; surface jusqu'à une quinzaine de centimètres de profondeur (profil obtenu dans les carottiers). Des coquilles mortes de Calyptogena sont réparties autour des colonies vivantes. A intervalle de quatre jours, la même colonie a été observée à deux reprises : certaines Calyptogena, surtout en périphérie des colonies, sont capables de se déplacer pendant ce court laps de temps de ; plusieurs dizaines de centimètres, tout en conservant leur position verticale.

La plongée KD 6 a exploré une ride sédimentaire de 200m environ d'élévation au-dessus des fonds voisins auvSud de la ride de Zenisu, par 4026m.7 Quelques colonies de Càlyptogena ont été observées dans la partie Nord de la zone explorée; plus petites que les: précédentes, elles comptent environ une vingtaine de bivalves par colonie, appartenant apparemment à une des. deux éxpèces présentes dans le canyon de Tenryu (pas de prélèvement au cours de KD 6).

Fosse du Japon et fosse des Kouriles :

Dans cette région, les communautés animales sont dominées par une troisième espèce de Calyptogena différent des deux formes précédentes et de la plupart des espèces du genre par une forme générale longue et plus étroite. Des colonies de cette espèce ont été vues au cours de quatre plongées : KD 14 à l'axé de la fosse du Japon, sur le mont sous-marin Kashima, KD 18 et KD 23, sur le flanc continental de la fosse du Japon, plus au Nord, enfin KD21 sur le flanc continental : Nord de la fosse des Kouriles (tableau). La colonie observée pendant la plongée KD 14 occupe une zone de 2 x 0,5m environ, avec un noyau particulièrement dense de près de 100 individus sur une surface de 1,3 x0,2 m. La densité des bivalves atteint 400 à 700 individus au mètre carré et la biomasse 24 à 42 kg/m 2. Quelques gastéropodes buccinidés et de très nombreux amphipodes caprellidés de 5 cm de longueur vivent auprès de la colonie. Plusieurs espèces d'holothuries élasipodes sont distribuées en agrégats exceptionnellement denses, notamment une espèce d'elpidiidé nageuse (Peniagone elongatal) représentée par 50 individus sur une- surface de 3 m2 à proximité de la colonie. Les mesures de température au sein de ces colonies révèlent une anomalie positive de 0,3°C par rapport à la température ambiante.

Les plongées KD18 et KD23 ont exploré une zone en pente abrupte caractérisée par l'existence de courants de fond Sud-Ouest Nord-Est (formes de relief, abondance des suspensivores). Les colonies de bivalves rencontrées au cours de ces deux plongées sont très: dispersées et généralement de petite taille. Une seule colonie d'assez grande taille occupe un ovale de 0,7 x 0,45m par 5900m de profondeur et contient plus de 190 Càlyptogena vivantes. La densité correspondante est de 1500 individus au mètre carré et la biomasse de 51 kg/m 2. Autour de cette colonie, on rencontre des buccinidés, de petites actinies blanchâtres et des polyçhètes tubicoles (terebellidés? ). Les colonies contiennent en moyenne moins de 10 Calyptogena, Un individu a été observé en train de se déplacer à la surface du sédiment : l'animal repose horizontalement sur le fond, la charnière vers le haut et une trace d'un mètre de long est encore visible derrière lui.


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La plongée KD 21, sur le flanc continental de la fosse des Kouriles, a rencontré de nombreuses petites colonies probablement de la même espèce entre 5 130 et 5 770 m. Les mesures de température ont révélé une très faible anomalie positive de quelques centièmes de degré. Aux bivalves sont associés des buccinidés et des polychètes tubicoles dans une des colonies observées.

DISCUSSION. — Les communautés de bivalves de deux types découvertes dans le système de fosses de subduction du Japon entre 3 787 et 5 960 m rappellent fortement les communautés animales décrites précédemment à proximité de sources hydrothermales chaudes sur fond de sédiment [8] et surtout celles observées auprès de sources froides minéralisées au pied de l'escarpement de Floride [9] et le long de la zone de subduction de l'Oregon ([3], [4]), ainsi que les colonies de Calyptogena soyoae observés à des profondeurs bathyales en baie de Sagami[10]. Les communautés découvertes durant KAIKO présentent néanmoins des spécificités : seuls des bivalves de grande taille du genre Calyptogena sont les espèces caractéristiques de peuplements animaux reposant sur la chimiosynthèse bactérienne; les bivalves appartenant à trois espèces distinctes ne sont pas répartis sur de grandes surfaces mais forment une série de petites colonies de diamètre maximal de 2m; les trois espèces de Calyptogena, dont deux sont présentes dans les colonies de la fosse de Nankai (3 830 m), forment l'essentiel de la biomasse des colonies (en particulier il ne semble pas exister dans les fosses de subduction du Japon de vestimentifères alors qu'on en a trouvé dans tous les autres cas); il existe de nombreuses espèces accompagnatrices, différentes selon la profondeur et le site, qui tirent probablement parti de cette source de nourriture abondante mais ponctuelle.

La biomasse très élevée de ces colonies de Calyptogena spp., par rapport aux valeurs rencontrées habituellement à de telles profondeurs dans l'océan mondial et même dans ce secteur proche du Japon considéré comme l'un des plus riches du monde en raison du système de courants opposés favorisant le flux de particules au fond ([11], [12]) suggère que ces communautés tirent leur énergie de processus photosynthétiques. La situation topographique des colonies, disposées plus ou moins parallèlement aux structures géologiques ou le long de zones de failles et de flexures, les anomalies positives de la température au sein des colonies, permettent de conclure que les bivalves s'installent aux points de sortie de l'eau interstitielle expulsée des sédiments profonds sous l'effet des forces de subduction. Les mesures géochimiques pratiquées dans l'eau prélevée au-dessus des colonies ont révélé la présence dans l'eau de méthane d'origine thermogène [5]. La présence de quantités importantes d'hémoglobine dans le sang des trois espèces témoigne d'une demande en oxygène supérieure à la moyenne. La comparaison avec les données publiées sur les communautés de l'escarpement de Floride et celles de la zone de subduction de l'Oregon conduit à la conclusion que le méthane constitue la source d'énergie des communautés de bivalves des fosses de subduction du Japon, source d'énergie libérée et utilisée par des bactéries chimiosynthétiques vivant à l'intérieur des cellules des bivalves [5]. Jusqu'à présent, seuls les pogonophores, avec une espèce du genre Siboglinum étaient connus pour renfermer des bactéries symbiontes capables de fixer le 14CH4[13]. Cette hypothèse demande évidemment à être confirmée en démontrant expérimentalement le mode d'utilisation du méthane et la source de carbone.

L'existence de communautés de bivalves chimiosynthétiques dans des sites limités et très variés, jusqu'à une profondeur de près de 6 000 m, conduit enfin à s'interroger sur le rôle de ces communautés vis-à-vis de l'écosystème profond en général et sur les modalités


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d'une éventuelle exportation de la matière organique d'origine chimiosynthétique concentrée dans ces colonies hautement productives. Reçue le 7 avril 1986.

RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES

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[3] E. SUESS et coll., Bull. Biol. Soc. Washington, 6, 1985, p. 475-484. [4] L. D. KULM et coll., Science, 231, 1986, p. 561-566. [5] J. BOULEGUE, comm. pers.

[6] J.-P. CADET et coll., Comptes rendus, 301, série II, 1985, p. 287-296. [7] X. LE PICHON et coll., Earth Planet. Sc. Letters (sous presse). [8] F. GRASSLE, Marine Technol. Soc. Journal, 16, (3), 1982, p. 33-38. [9] C. K. PAUL et coll., Science, 226, 1984, p. 965-967.

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L. L. : IFREMER, 66 avenue d'Iéna, 75116 Paris,

S. O. : Océan Research Institute, University of Tokyo,

Minamidai 1-15-1, Nakanoku, Tokyo 164, Japon;

M. S. : IFREMER, Centre de Brest,

B. P. n° 337. 29273 Brest Cedex.



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PARASITOLOGIE ANIMALE. — Utilisation de la génétique enzymatique pour comparer les copépodes parasites du genre Lernaeenicus (Pennellidae), selon la zone d'implantation dans l'hôte, Sardina pilchardus (Walbaum, 1792). Note de André Raibaut Patrick Berrebi et Viviane Rousset, présentée par Constantin Vago.

La genétique enzymatique a permis de montrer que tous les copépodes du genre Lernaeenicus parasites de sardines provenant des eaux marines littorales du Languedoc-Roussillon, appartiennent à la même espèce, quelle que soit leur zone d'implantation dans l'hôte.

La variation morphologique consistant notamment en la présence ou en l'absence de: nodosités au niveau du cou thoracique de ces parasites constitue un phénomène d'écomorphose. .

ANIMAL PARASITOLOGY. —« Use of the enzymatic electrophoresis to compare the parasitic copepods belonging to the genus Lernaeenicus (Pennellidae) according to the implantation area in the host, Sardina pilchardus(WaLbaum, 1792).

The enzymatic electrophoresis has showh ail the copepods of the genus Lernaeenicus that parasite pilchards comingfrom the coastal waters of the Languedoc-Roussillon, belongto the same species, whatever their implantation, area in the host.

The morphological variation, consisting notably in the présence or absence of hodosities on the thoracic neck of: thèse parasites, constitutes a phenomehon of ecomorphosis.

Les copépodes parasites appartenant aux Lernacidae, Sphyriidae et Pennellidae constituent un modèle particulièrement intéressant pour l'étude des mécanismes de spéciation parasitaire. En effet, ils se singularisent par Fhématophagie des femelles adultes qui vivent enfoncées dans les masses musculaires ou dans divers organes principalement de poissons. Ce typé d'association, qualifié de mésoparasitisme [1], se traduit par Un allongement du corps: qui devient souvent une sorte de harpon implanté plus ou moins profondément dans l'hôte. Il s'ensuit, dans la plupart des cas, des variations morphologiques surtout quand la spécificité parasitaire est euryxène [2]. Le phénomène peut se compliquer avec l'apparition, selon la zone d'implantation des parasites dans l'hôte, de fluctuations morphologiques susceptibles d'être interprétées comme des critères de différenciation interspécifique alors qu'elles ne sont que l'expression d'un phénomène écdmorphique.

Les Lernaeenicus (Pennelhdae) qui parasitent la sardine, Sardina pilchardus (Walbaum, 1792), dans les eaux marines littorales du Languedoc-Roussillon illustrent bien ces problèmes. Les femelles sont enfoncées dans les tissus de l'hôte par leur région céphalique armée d'ancres de fixation. Seule la partie thoracique fusiforme, souvent porteuse de sacs ovigères, émerge: à l'extérieur (fig.). Les Lernaeenicus sont localisés soit au niveau de l'oeil (7%), soit dans les masses musculaires principalement à la base de la nageoire dorsale (40%) [3]. Les deux types de localisation peuvent se rencontrer simultanément sur Un même individu-hôte (fig.). Une étude morphologique détaillée, ayant porté sur 37 parasites de l'oeil et 112 exemplaires extraits des autres régions du corps du poisson, â révêlé que les premiers diffèrent des seconds par la présence,: à une exception près, de constrictions plus ou moins marquées à hauteur du rétrécissement collaire. Tous les: individus enfoncés dans le tissu musculaire ont un cou parfaitement lisse f fig.).

Dans la province atlanto-méditerranéenne, deux espèces de Lernaeenicus parasites de Clupeidae, notamment du sprat, Sprattus sprattus (Linné, 1758), et de la sardine, ont été décrites [4]. Il s'agit de Lernaeenicus sprattae (Sowerby, 1806) et de L. encrasicholi (Turton,; 1507). Étant donné la grande variabilité morphologique des anôres antérieures, bien connue chez de nombreux Pennellidae, le seul critère retenu jusqu'ici pour distinguer ces deux espèces est la présence au niveau du cou de Lernaeenicus sprattae de nodosités,

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TABLEAU I Tests qualitatifs portant sur seize fonctions enzymatiques. Qualitative tests carried out on sixteen enzymatic functions.

cette partie du corps étant lisse chez L. encrasicholi. Par conséquent si l'on se réfère à cette distinction, nous devrions, pour le matériel récolté dans la région du LanguedocRoussillon, considérer que nous sommes en présence de deux espèces. Mais vu la fragilité de l'argument morphologique, nous avons préféré utiliser l'électrophorèse enzymatique afin de vérifier si la séparation en deux espèces des Lernaeenicus parasites des sardines du golfe du Lion est bien justifiée.

A cet effet nous avons utilisé 26 individus femelles récoltés sur le corps de l'hôte et 11 autres prélevés dans 1-oeil. Ces derniers présentaient (sauf un spécimen) un cou avec constrictions tandis que celui des autres parasites était lisse. Les extraits enzymatiques ont été obtenus par écrasement direct sur papier absorbant (Wattman n° 3) ou par broyage rotatif avec du tampon Tris/EDTA/NÀDP à pH 6,8.

Les électrophorèses des protéines enzymatiques ont été effectuées sur gel d'amidon selon les méthodes de Selander et coll. [5] et de Harris et Hopkinson [6] adaptées aux

Tampons

0, aucune activité décelable chez le parasite — no activity observed for the parasite.

+ , faible activité illisible — slight activity, inutilisable.

+ +, lisible — utilisable.

+ + + , bonne révélation, lecture aisée — good révélation, easily read.

( ), nombre de locus pour cette fonction enzymatique — number of loci for that enzymatic function.

\ ], tampon choisi pour l'étude quantitative — buffer chosen for this quantitative study.


PLANCHE I/PLATE I

ANDRÉ RAIBAUT

TABLEAU II

Fréquences alléliques aux dix locus étudiés quantitativement. ( )= nombre de parasites analysés.

Allelic frequencies of ten loci studied quantitatively. ( ) — number of parasites analyzed.

Parasites Parasites

Locus Allèles du corps de l'oeil

PGI 130 0,08(26) 0,09(11)

100 0,87 0,91

40 0,04 0,00

5 0,02 0,00

PGM : 120 0,00(21) 0,08(6)

110 0,44 0,33

100 0,39 0,33

90 0,17 0,25

SOD . 100 0,55(20) 0,44(8)

95 0,15 0,19

90 0,30 0,37

MPM 100 1,00(21) 0,91(11)

90 0,00 0,09

MPI-2 100 1,00(21) 1,00(11)

AAT-1 100 1,00(20) 1,00(10)

AAT-2 100 1,00(21) 1,00(10)

AKP-1 100 1,00(14) 1,00(5)

AKP-2 : 100 1,00(22) 1,00(9)

MDH 100 1,00(14) 1,00(8)

Sardine parasitée par deux Lernaeenicus femelles. Celle extraite de l'oeil montre un cou thoracique

avec nodosités (flèche courte) tandis que chez l'autre le cou est lisse.

Parasitized pilchard with two female Lernaeenicus. 77ÎÊ left one taken from the eye shows a thoracic neck

with nodosities (short arrow) while the other one has a smooth neck.

G R., 1986, 2e Semestre (T. 303)

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TABLEAU III

Coefficients usuels appliqués aux deux lots de parasites: Usual coefficients applied for the two samples of parasites.

Ensemble

§ parasites $ parasites des

. du corps. de. l'oeil parasités

% locus hétérozygotes.... 10 12,3 10,7 Ho (gene diversity, Nei..-..

1973) [7] 0,14 0,17 0,15

P0,00, 30% 40% V 40%

PO,OI. : 30% : 40%. 40% y

P0,05. 30% 40% 40%

copépodes. Le tableau I indique les enzymes éprouvées ; [16], les tampons utilisés et les résultats qualitatifs obtenus. Par précaution, chaque gel a comporté, en plus des extraits de parasites, des extraits de sang, d'oeil et de muscle de sardine afin de déceler une éventuelle pollution enzymatique due au sang ingéré ou à l'organe d'implantation. Le traitement statistique a été réalise en trois étapes :

— pour chaque locus, l'équilibre de Hardy-Weinberg a été contrôlé sur l'ensemble des parasites:

— les fréquences ont été calculées pour chaque allèle et comparées locus par locus à l'aide de tests %2- entre les deux lots de parasites (tableau II).

— Enfin deux coefficients ont été calculés; le coefficient P, le coefficient Ho pour chaque loi de parasites servant donc d'éléments de comparaison (tableau III).

RÉSULTATS ET DISCUSSION. — Le tableau II des fréquences; alléliques indique que, sur les 10 locus assez fiables pour faire l'objet de l'étude statistique, 6 n'ont montré aucun polymorphisme. L'allèle unique a alors été nommé 100. Pour les autres locus, l'un d'eux (MPI-1) n'est pas exploitable puisqu'il ne présente qu'un hétérozygote sur 32 parasites. Enfin PGI, PGM et SOD sont les seuls locus suffisamment polymorphes pour être comparés. Les tests %2 ne révèlent aucune différence significative.

Sur ces trois locus, aucune différence significative n'a été montrée par rapport à l'équilibré de Hardy-Weinberg, quand on considère tous les parasites comme une seule population.

La comparaison du coefficient Ho entre parasites de l'oeil et du; corps n'est pas significative, y

A la suite de cette étude, les remarques suivantes peuvent être faites : les deux lots de parasites présentent toujours les mêmes allèles, à l'exception des allèles 5 et 40 du locus PGI présents seulement chez les parasites du corps et des allèles 90 du locus MPI-1 et 120 du locus PGM présents seulement chez les parasites de l'oeil. Mais il s'agit toujours d'ailèles à faible fréquence et aucune différence significative n'a pu être révélée;

— : les comparaisons de fréquences alléliques et du coefficient Ho entré les deux lots de parasites n'ont montré aucune différence statistiquement prouvée.

Ces résultats nous permettent de; conclure que nous sommes en présence d'une seule espèce de Lernaeenicus parasitant les sardines de la zone littorale de LanguedocRoussillon. Nous considérons que là présence ou l'absence de nodosités du cou thoracique


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sont des adaptations au substrat d'implantation (écomorphose) et non un critère morphologique de différenciation de deux espèces (Lernaeenicus sprattae et L. encrasicholi). Pour désigner définitivement cette espèce il est absolument nécessaire de réaliser la même étude sur les Lernaeenicus du sprat. C'est ce que nous nous proposons de réaliser dans un proche avenir.

Les auteurs remercient Ghislaine Berrebi qui s'est chargée de l'aspect technique des électrophorèses. Reçue le 14 avril 1986.

RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES

[1] Z. KABATA, Advance in Parasitology, 19, n° 1, 1981, p. 1-71.

[2] L. EUZET et C. COMBES, Mém. Soc. Zool Fr., 3, n° 40, 1980fp. 239-285.

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[7] M. NEI, Proc. Nat. Acad. Se. V.S.A., 70, 1973, p. 3321-3323.

Laboratoire d'Ichthyologie et de Parasitologiegénérale

et Laboratoire de Génétique de l'Institut des Sciences de l'Evolution,

Université des Sciences et Techniques du Languedoc,

34060 Montpellier Cedex.


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MORPHOGENESE ANIMALE. — Modifications précoces de l'ontogenèse des membres d'embryons de Lacerta viridis (Laur.) sous l'effet de la cytosine-arabinofuranoside; comparaison avec l'ontogenèse des membres de Reptiles serpentiformes. Note de Albert Raynaud, présentée par Alfred Jost.

Les effets précoces, sur les ébauches des membres des embryons, de la cytosine-arabinofuranoside administrée dans l'oeuf de Lacerta viridis aux stades de 9 à 11 jours de l'incubation, sont décrits; à ces stades, cette substance prévient la formation ou arête la croissance des rayons digitaux dans l'autopode. Les processus de cette réduction sont-comparés à ceux entrant en jeu dans les réductions digitales, chez diverses espèces de Reptiles serpentiformes.

ANIMAL MORPHOGENESIS. — Early changes induced by cytosine-arabinofuranoside in the limb buds of Lacerta viridis (Laur.) ; comparison with the morphogenesis of the limb buds of serpentiform Reptiles.

The early effects, on the limb buds ofthe embryos, of cytosine-arabinofuranoside adjhinistergd into the eggs of Lacerta viridis, between days 9 and 11 of incubation are described ; at thèse stages, this drug canprevent or arrest thé development of the digital anlagen in the autopod. The mechanisms of this réduction are compared to those involved in the réduction of the limb buds ofsome species of serpentiform Reptiles.

Introduite dans l'oeuf de Lacerta viridis à divers stades. de son développement, la cytosine-1-P-D-arabinofuranoside (Ara-C), agent inhibiteur de la synthèse de l'ADN peut provoquer un arrêt général du développement des membres ou de simples réductions digitales ([1], [2], [3]). Pour élucider le mécanisme de cette action, nous avons entrepris l'étude des effets de l' Ara-C sur les membres d'embryons sacrifiés peu de temps après l'administration de cette substance.

CONDITIONS EXPÉRIMENTALES. — La cytosine-arabinofuranoside (Sigma) en solution à 2mg/ml dans du NaCl à 8 % a été injectée (une dose unique de 20 à 40 ug, par oeuf) dans le sac vitellin d'oeufs de Lacerta viridis, soit au 10e, soit au 11e, soit au 12e jour de l'incubation (à 25°C) ; 12 embryons ont été ainsi traités et 10 oeufs témoins ont reçu, aux mêmes stades, une injection d'un même volume, du solvant. Les embryons, traités et témoins ont été sacrifiés 2, 3, 4, 5 et 6 jours après l'injection ; ils ont été fixés dans le mélange de Bouin et étudiés histologiquement Pour l'étude comparative de cette réduction expérimentale et des réductions naturelles, des membres réduits de quelques espèces de Reptiles serpentiformes (Scelotes, Chalcides, etc.) et des sections histologiques de leurs ébauches ont été utilisés.

Au moment de l'injection d'Ara-C, les ébauches des membres des embryons sont constituées d'un court bourgeon (fig. 1, 2) au sommet duquel l'épiblaste a différencié un pli apical. Dans le mésoblaste les deux branches précartilagineuses du zeugopode se terminent dans Une condensation mésoblastique axiale à contour irrégulier; les rayons digitaux ne sont pas formés mais on peut discerner l'emplacement de leur base. Ces embryons, âgés de 9 à 11 jours sont à un stade correspondant au stade 32 de la table de développement de Lacerta vivipara [4].

Injectée à ces stades relativement avancés du développement, l'Ara-C a une action moins accentuée qu'aux stades plus jeunes; elle agit assentiellement en prévenant la formation ou en arrêtant la croissance des rayons digitaux dans l'autopode. Chez les embryons sacrifiés à l'âge de 15 à 17 jours, les membres sont légèrement réduits; à leur sommet, la crête apicale ne s'est pas transformée en pli apical; les cartilages du stylopode et du zeugopode sont présents, ainsi que certains éléments du carpe et du tarse, mais dans l'autopode on observe de nombreuses modifications : le sinus marginal est dilaté, le mésenchyme interdigital est lâche et seulement un à quatre rayons digitaux sont formés. Toutefois, le plan structural pentadactyle est ébauché en ce sens que les amas mésoblastiques représentant les ébauches potentielles des cinq rayons digitaux sont en place, mais

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ces ébauches ne se sont pas allongées ou bien elles ont été arrêtées dans leur croissance. Le doigt IV est en général présent, plus ou moins long; il peut être seul (fig. 4) ou être accompagné par les doigts III et V, de longueur normale ou rudimentaires (fig. 3). L'examen microscopique montre que la croissance de certains rayons digitaux a été arrêtée par suite de la dégénérescence de nombreuses cellules mésoblastiques et par un blocage de la division cellulaire : ainsi, dans l'ébauche du doigt V de la patte représentée sur la figure 3, les mitoses sont rares ou absentes (fig. 5) alors qu'elles sont nombreuses dans l'ébauche du doigt V d'un embryon témoin de même poids (fig. 6). Lorsque quatre rayons digitaux sont présents, c'est le rayon I qui fait défaut et l'on a des pattes tétradactyles. Au cours du développement normal, c'est le rayon IV qui se différencie le permier; puis ce sont les rayons III et V, ensuite, le rayon II; le rayon I est le dernier à se former; il est, de ce fait, fréquemment arrêté dans son développement par l'action de l'Ara-C à ces stades. Les morts cellulaires et l'arrêt de la prolifération cellulaire provoqués par l'Ara-C dans ces ébauches de membres doivent résulter de l'inhibition de la synthèse d'ADN par cette substance, comme cela a été établi chez les embryons de Mammifères ([5] à [8]).

L'action de l'Ara-C chez les embryons de Lacerta viridis détermine des réductions digitales diverses (fig. 1, 8) comparables à celles qui s'observent chez divers Reptiles serpentiformes ([2], [9]; à titre d'exemple, la patte de la figure 8, obtenue par action de l'Ara-C aux stades de 9 à 11 jours rappelle la patte d'un Scincidé sud-Africain, le Tetradactylus eastwoodae (fig. 9); les pattes monodactyles obtenues expérimentalement rappellent les membres styliforrnes de divers Reptiles [9]. L'étude embryologique des

EXPLICATIONS DES PLANCHES

Planche I

Fig. 1 et 2. '■ — Aspect externe des membres d'un embryon normal de Lacerta viridis âgé de 9 jours, pesant

60,5 mg (fig. 1) (G x 10) et structure histologique d'un membre d'un autre embryon normal, âgé de 10 jours

20 h (fig. 2) (c.m.d. : condensation mésoblastique distale ; pi. ap. : pli apical) (Gx 100).

Figs. 1 and 2. — External view ofthe limb buds ofa normal, 9-day-old embryo of Lacerta viridis, weighting 60,5 mg

(Fig. 1) (Mx 10) and histological section through the limb bud of another normal, 10 day 20 hrs.-old-embryo (Fig.

2) (c. m. d. :. distal mesoblastic condensation; ap. : apical fold) (M x 100).

Fig. 3 et 4. — Coupes histologiques d'autopodes de membres d'embryons de Lacerta viridis traités au stade de 10 jours, par 40 ug d'Ara-C, sacrifiés à l'âge de 15 j. 11 h (fig. 3) et de 14 j. 10 h (fig. 4). Dans l'autopode de la figure 3, le doigt IV est bien développé, le doigt V est un peu réduit, le doigt III n'est québauché, les autres doigts ne se sont pas développés. Dans l'autopode de la figure 4, seul le doigt IV est présent (G x 110). (s. m. : sinus marginal).

Figs. 3 and 4. — Histological sections of autopods of limb buds of embryos of Lacerta viridis treated on day 10 -by 40 µg of Ara-C, killed at the stage of 15 days 11 hrs. (Fig. 3) and of 14 days 10 hrs. (Fig. 4). In the section of the Figure-3, the digit IV is well developped, the digit V is somewhat reduced, only a short anlage of digit III is formed,.other digits are lacking. In the autopod of Figure 4, only the digit IV is présent (s.m. : marginal sinus) (M x 110).

Fig. 5 et 6. — Coupe histologique intéressant l'ébauche du doigt V de la patte de la figure 3 (embryon traité à

l'Ara-C, pesant 95,5 mg) (fig. 5) et l'ébauche du même doigt dans la patte d'un embryon normal pesant

95,3 mg. Noter l'absence de mitoses dans le doigt de l'embryon traité (G x 340). Figs. 5 and 6. — Histological sections through the anlage of digit V of the hand represented on Figure 3, of an embryo of Lacerta viridis treated with Ara-C and killed at the stage of 95.5 mg and through the anlage ofthe

same digit in the hand of a normal embryo weighting 93.5 mg. Note the absence of mitoses in the digit ofthe

treated embryo (M x 340).


PLANCHE I /PLATE I

ALBERT RAYNAUD


PLANCHE II/ PLATE II


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Planche II

Fig. 7 et 8. — Exemples de pattes réduites obtenues chez les embryons de Lacerta viridis, par action de l'Ara-C (Gxl2,l; la patte de la figuré 8 rappelle, par sa conformation générale,,celle d'un Scincidé sud-Africain,'le'.; Tetradactylus eastwoodae [Fig. 9, d'après Fitzsimons, 1943 (G x 16,5)]. .Figs: 7 and 8 — Exemples of reduced legs of embryos of Lacerta viridis treated by Ara-C (Mxl2,l). Tiié_

general conformation of the leg of Figure 8 is similar to that of a leg of a south-African Scincid, the

v Tetradactylus eastwoodae [Fig. 9, front Fitzsimons, 1943 (M x 16.5)].

.Fig. 10. — Vue générale, en coupe histologique, d'une ébauche de patte monodactyle (seul le doigt IV est ; présent) d'un embryon de Lacerta viridis traité à l'Ara-C à l'âge de 10 jours, sacrifié au l5e jour (Gx66). Fig. 10. —. Histological section of the limb of an embryo of Lacerta viridis treated by Ara-C on day 10, killed. y pn the 10 day ; only the digit IV (dIV) is présent (M x 66).

FigMl et 12. — Coupes histologiques à travers l'autopode (fig. 11) et l'ensemble (fig. 12) de la patte postérieure d'un embryon de lézard sud-Africain, le Scelotes gronovii (14) ; ici, également, seule l'ébauche du doigt IV est présente (dIV) ; (G x 189) pour la figure 11 et (G x 105) pour la figure 12).

Figs.-1l and 12. — Histological sections through the autopod (Fig. 11) and the totality (Fig. 12) of the posteriori leg of an embryo of a south-African lizard, the Scelotes gronovii (14) ; here also, only the anlage of digit IV:-

(dIV) is présent ; (M x 189) for Figure 11 and (M x 105) for Figure 12).

Fig. 13 et 14.- Nombreuses dégénérescences cellulaires dans le mésoblaste des bourgeons des membres

postérieurs: de deux embryons de Scelotes inornatus (G x 458). Figs. 13 and14 ; — Numerous degenerating cells in the mesoblast of the posterior limb buds of two embryos of d ,

south-African lizard, the Scelotes inornatus (M x 458).

membres, chez plusieurs espèces naturelles de Reptiles serpentiformes apporté de nouvelles données en faveur de ces similitudes : ainsi, dans l'ébauche de la patte postérieure d'un ; ; embryon de Scelotes gronovii (fig. 11, 12), seul un doigt médian s'est formé [14] ; c'est le doigt IV ; à sa base existe un massif Cellulaire formant une protubérance sur chacun de ses côtés ; cette disposition rappelle le processus de formation d'une patte monodactyie ( fig. 4 et 10) sous l'effet de l'Ara-C, chez l'embryon de Lacerta viridis; ici, également, ; seul le doigt IV se développe (comparer la figure 10 aux figurés 11 et 12). D'autre part, dans les ébauches de ces membres rudimentaires de Reptiles serpentiformes, on observé;, aussi la dégénérescence de nombreuses cellules mésoblastiques et l'arrêt de la prolifération cellulaire (fig. 13, 14), comme cela se produit chez les embryons de Lacerta viridis traités à l'Ara-C ; ces constatations suggèrent que dans les ébauchés des membres de ces Reptilesserpentiformes, un arrêt de la synthèse de l'ADN à dû survenir, à ces stades, dans les cellules mésoblastiques.

: une étude antérieure ([10] à [15]) avait montré que dans les ébauches des membres rudimentaires de divers Reptiles serpentiformes, la crête apicale dégénérait précocement ou était incomplètement différenciée. Or, les expériences effectuées chez l'embryon dé Poulet ont établi que l'excision de la crête apicale entraîne la mort de nombreuses cellules; mésoblastiques et l'arrêt de la croissance et de la différenciation du bourgeon du membre ([16], [17], [18]) ; de plus, dans lés régénérats des membres d'Amphibiens [19] et dans les cultures de cellules mésoblastiques d'ébauches de membres d'embryons de Poulet [20], il a été établi que la crête apicale exerçait un effet mitogène sur les cellules mésoblastiques sous-jacentes, suscitant une synthèse d'ADN par ces cellules. On peut donc supposer que là dégénérescence prématurée ou la déficience fonctionnelle de la Crête apicale qui : surviennent dans les ébauches des membres des Reptiles serpentiformes causent un arrêt transitoire de la synthèse d'ADN dans les cellules mésoblastiques de ces ébauches. Les expériences réalisées avec l'Ara-C étayent cette hypothèse. Déficience de la crête apicale


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et arrêt de synthèse de L'ADN dans les cellules mésoblastiques constitueraient ainsi deux facteurs essentiels entrant en jeu dans les étapes terminales du mécanisme responsable de la régression évolutive du membre. Reçue le 3 mars 1986, acceptée après révision le 28 avril 1986.

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Laboratoire de Biologie, route de la Glévade, 81330 Vabre

et Laboratoire de Zoologie, Université Paul-Sabatier,

118, route de Narbonne, 31062 Toulouse.


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NEUROPHYSIOLOGIE. —La vibration des muscles de la nuque: modifie la position apparente d'une cible visuelle. Note de Benjamin Biguer, lain ML L. Donaldson, Alan Hein et Marc Jeanoerod, présentée par Michel Jouvet

L'application d'un stimulus vibratoire ; (100 Hz) aux muscles postérieurs de la nuque d'un côté provoque une illusion de mouvement d'un point lumineux stationnaire présenté au sujet dans une pièce obscure. Ce déplace.

déplace. apparent est dirigé le plus souvent vers le côté opposé au côté stimulé. Le pointage par le sujet vers la position où il voit le point lumineux donne lieu, au cours de la vibration,. à des erreurs de localisation dé

.plusieurs degrés dans le sens de l'illusion. Ces effets ne sont pas dûs à la.présence de mouvements oculaires, -ni de.mouvements de la tête., On peut donc conclure de ces résultats que la décharge des.fuseâux neuromusculaires des musclés de la nuque provoquée par la vibration est interprétée en l'absence du naôuvement de la tête qui accompagné normalement cette décharge, comme un +déplacement relatif de la tête et des Objets visuels.

NEVROPHYSIOLOGY.—Vibration of neck musclés alters visuàl locâlization.

ne discharge rate of muscle spindle afférents normally protides a précisé signal of muscle length. Vibration

'.. of.aPiuscle or Us tendon induçes an iriçrease in afférent discharge which then nô longer represents true muscle, jerigth ; however, this increased proprioceptive input is interpreted in the central nervous System as a lengthening of the muscle. The incremented signal gives rise to illusions of displacement, or movement, of a fixed, vibraied

limb [2]. A visual. target attached to such a vibrated limb also qppears to move [l]. We now report that vibration ' of the neck muscles influences visual localisation by inducing illusory movemeht of targets in visual space. Subjects were seated in a totally dark room and viewed a light-emitiing diode (LED): .The LED was placed

. at eye level approximately in the body midline at a distance of 7O cm. They held a physiotherapy vibrator in the left hand with its tip against the left side of the neck. When vibration was initiated the LED appeared to move rightward. The position of the tip of the vibrator was adjusted to produce the maximum apparent displacement to the. right. In some subjects the illuso had a vertical component. Subjects maintained the vibrator in position and described the illusion when vibration began, during vibration and at its md. They reported that,

: initially, tire target moved to the right but this displacement céased after a second or two. The target then appeared to continue in motion without changing its position. . When vibration ended. the target returned to its initial position. Immobilisation of the head with a bite-plate and electrooculographic rëcording assured that none of the effeots was the result of head or eye movements.

: After a rest of dbout 30 mimeach.subjeçt returned to his viewing position with. the: ffliiminated LED directly ahead. He poihted with the.index fingerôf thé right hand to àposition, on ,a horizontal surface, directly belôw. thestationarytarget and repeated this movement ten times. He then repositioned the tip ofthe vibrator against: thé left side ofthe neck. Beginnmg a few seconds after vibration was initiated, he againpointed ten times to the apparent location of the LED. Comparison of the locations reached during pointing before, with those reached

: during, vibration indicated that neck stimulation induced a shift of the trajectory of pointing to the right in ail subjects. The loci of pointings before and during vibration did not overlap in five of the. six subjects. For thèse five subjects the mean displacemént of the pointing trajectory during vibration was 5,0° (SD + 2.1°). Tlie sixth subject reported that the visual illusion was présent only for a short time after vibration began; he made errors in pointing only. when the illusion was présent. We noted for that subject, as well as the otlier five, that the Impression ofthe magnitude of the visual illusion was related to the size ofthe shift in their. pointing movemehts. The illusions which we now report indicate that vibration of the neck muscles can altér thé central représentation

r ofthe position ôf the head on the trunk. This central modification appears to combine with a presumably normal : représentation of eye-position-in-heaâ to produce an altered signal of the direction of gaze, Further investigation of thèse central représentations of eye-position and head-position and of the visual illusions is in progress.

Le taux de décharge des fuseaux neuromusculaires est normalement fonction de la longueur du muscle. Toutefois, une augmentation de ce taux de décharge peut être produite expérimentalement en l'absence d'allongement du muscle, par l'application d'une vibration au muscle lui-même ou à son tendon [2]. Dans ce cas, la décharge proprioceptive est interprétée par le sujet comme résultant d'un mouvement dans une direction telle qu'il provoquerait un étirement du muscle vibré. De fait la vibration d'un muscle fléchisseur de l'avant-bras chez un sujet dont le bras est immobilisé et caché à la vue, entraîne une forte impression de mouvement dans le sens de l'extension. Ces données constituent donc une preuve de la contribution des fuseaux neuromusculairês au sens de la position.

Nous rapportons ici les effets d'une stimulation vibratoire des muscles de la nuque chez le sujet humain normal, sur la représentation centrale de la position de la tête. Nos

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résultats montrent que la vibration produit une modification du codage de la position de la tête par rapport au corps, qui se traduit en fait par une perturbation systématique de la localisation des objets dans l'espace extra-corporel.

La stimulation vibratoire a été réalisée à l'aide d'un vibrateur utilisé en physiothérapie, équipé d'un embout mousse de 1 cm de diamètre, et produisant une fréquence fixe de 100 Hz. Le stimulus était appliqué dans la région de la nuque délimitée par le bord postérieur de la mastoïde et par le rebord inférieur de l'os occipital. La complexité de la musculature à ce niveau interdit toute systématisation des muscles stimulés. Toutefois, la constance des effets observés laisse penser que les muscles rotateurs ipsiversifs ont été les plus fréquemment concernés. Les effets de la stimulation ont été observés dans l'obscurité. Le sujet se trouvait assis face à une lumière de faible intensité, de couleur rouge, représentant environ 1 mn d'angle visuel, et présentée à 70 cm dans le plan sagittal. Le sujet avait pour consigne de la fixer des yeux, et de rapporter ses impressions verbalement.

L'application de la vibration au niveau de la nuque provoque immédiatement une illusion de mouvement du point lumineux qui semble dériver lentement à vitesse constante. L'illusion est d'autant plus saisissante que l'impression de mouvement ne s'accompagne que d'un faible déplacement apparent : le point, tout en se mouvant constamment reste en permanence visible. La direction du mouvement varie systématiquement en fonction de la zone stimulée, mais reste constante tant que le même point est stimulé. Les impressions les plus fréquemment rapportées par les sujets sont des mouvements horizontaux vers le côté opposé au côté stimulé, ou verticaux vers le haut. En déplaçant le vibrateur, une composante oblique peut également être obtenue.

L'effet dure aussi longtemps que la vibration est maintenue. L'arrêt de la stimulation est suivi au bout de quelques secondes d'un effet consécutif sous la forme d'une impression transitoire de mouvement en sens inverse. L'effet, ainsi que l'effet consécutif peuvent être reproduits de nombreuses fois en répétant la stimulation, sans habituation apparente.

EXPLICATIONS DE LA PLANCHE

Fig. 1. — Déviation systématique vers la droite des pointages dirigés vers une cible placée dans le plan sagittal lors de la vibration des muscles postérieurs gauches de la nuque, chez 6 sujets. A, Position des pointages chez le sujet JHC. On constate qu'en condition de contrôle (sans vibration) les pointages dirigés vers le stimulus placé dans le plan sagittal (0°) sont groupés légèrement à droite de la position du stimulus. Lors de la vibration, les pointages sont systématiquement décalés d'environ 8° vers la droite. B, Valeurs moyennes de la position des pointages avant (en blanc) et pendant (en noir) la vibration, chez les six sujets. La. différence est significative chez tous les sujets sauf le sujet CU. Valeurs positives, décalage vers la droite. Valeur négative, vers la gauche.

Fig. 1. — Systematic déviation to the right ôf pointings directed at a target in the mid-sagittal plané during vibration of left posterior neck muscles, in six subjects. A, Position of pointings before and during vibration in subject JHC. B, Mean values of pointing positions before (white boxes) and during (blaçk boxes) vibration in the six subjects. Positive values, déviation to thé right, négative, to the left.

Fig. 2. — Effets de la vibration des muscles de la nuque sur le pointage vers une cible placée dans le plan sagittal, chez le sujet CU. En blanc : erreur constante moyenne pour les 10 pointages de la condition de contrôle (c). Valeurs positives, décalage vers la droite. Valeur négative, vers la gauche. En noir : erreur constante de chacun des 10 pointages effectués sous vibration (1-10). Noter l'important effet de la vibration au cours des premiers pointages, et sa disparition par la suite.

Fig. 2. — Effects of neck muscle vibration on pointing toward a mid-sagittal target in subject CU. Whitê box: mean position ofthe 10 pointings executed before vibration. Black boxes: position ofthe ten individual pointings made under vibration (1-10).


PLANCHE 1/PLATEI

BENJAMIN BIGUER

Fig. 1

Fig. 2



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Enfin, l'illusion tend à disparaître dès lors que l'obscurité n'est plus complète et que les contours de la pièce deviennent visibles.

Il nous a paru important d'éliminer, l'intervention possible, dans la production de cette illusion de mouvement, de déplacements de la tête ou des yeux. La vibration, en déclenchant une contraction réflexe du ou des muscles stimulés aurait pu en effet provoquer un déplacement de la tête vers le côté stimulé, déplacement interprété par le sujet comme un mouvement du point lumineux. Tel n'est cependeant pas le cas. Nous avons en effet constaté la persistance de l'illusion chez deux sujets dont la tête était fixée de manière rigide grâce à une empreinte dentaire.

La contribution de mouvements oculaires a par ailleurs été éliminée de deux façons. L'enregistrement des mouvements des yeux par la méthode électro-oculographique (EOG) n'a pas montré de déplacement systématisé du regard au cours de la stimulation vibratoire. La méthode EOG, toutefois, est sujette à des dérives électriques spontanées qui auraient pu masquer d'éventuels mouvements oculaires. Une autre-méthode nous a paru plus convaincante. Le sujet, dans l'obscurité, fixait le point lumineux à travers une fente verticale de 1 mm de large, placée à 2 cm d'un oeil (l'autre oeil étant occlus). La vibration était appliquée en un point entraînant une illusion de mouvement dans le plan horizontal. Tout mouvement de l'oeil dans ce plan aurait inévitablement conduit le sujet à perdre de vue le stimulus lumineux. Au lieu de Cela, une forte illusion-de mouvement était perçue pendant toute la durée de la stimulation, ce qui démontre que la fixation des yeux sur le point lumineux était maintenue.

En vue de quantifier l'effet produit par la vibration des muscles de la nuque sur la détermination de la position d'un point dans l'espace, nous avons réalisé l'expérience suivante sur six sujets adultes normaux. Les sujets étaient assis face à un écran où apparaissait le stimulus lumineux décrit précédemment. La position du stimulus sur l'écran correspondait au plan sagittal passant par l'axe vertical du corps du sujet, dont la tâche consistait, dans l'obscurité complète, à pointer l'index en direction du stimulus lumineux. Le sujet pointait sur une table horizontale placée devant l'écran, et recouverte d'un matériau isorésistif. .Lorsque l'index, équipé d'un dé métallique, entrait en contact avec la surface de la table, sa position était enregistrée à un demi-degré près.

La position de l'index du bras droit a été mesurée au cours de pointages effectués pendant la vibration des muscles postérieurs de la nuque du côté gauche, ainsi que dans une condition de contrôle sans vibration. Dix essais ont été réalisés dans chaque condition. Au cours de la vibration tous les sujets ont perçu l'illusion de mouvement du stimulus lumineux dans le plan horizontal vers la droite Chez un sujet (CU) l'illusion n'a été perçue qu'au début de la vibration, ce qui nous paraît s'expliquer par un déplacement du vibrateur en cours d'expérience.

La figure 1 a montre les résultats obtenus chez l'un des sujets (JHC) sous la forme d'un diagramme où apparaît la position des pointages avant et pendant la vibration. Avant la vibration, les pointages sont groupés légèrement à droite (position moyenne, 2,0°) de la position objective du point lumineux (0°). Pendant la vibration, les pointages sont systématiquement décalés plus loin vers la droite (position moyenne, 10,5°). La figure le montre l'ensemble des résultats chez les six sujets. Cette figure confirme chez cinq des six sujets, le léger biais vers la droite (M = 2°, déviation standard, 2,25) de la détermination de la position « droit devant » avec le bras droit. Une étude complémentaire sur un plus grand nombre de sujets devra déterminer s'il s'agit là d'un fait général ou d'une particularité des sujets de notre groupe. De même, la figure le confirme l'effet de


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la vibration des muscles postérieurs gauches de la nuque. En effet, tous les sujets à l'exception du sujet CU ont présenté un décalage systématique de leurs pointages dans la direction attendue, sans recouvrement avec la position des pointages avant vibration. Chez ces cinq sujets, la position moyenne des pointages sous vibration est décalée de 5,0° (déviation standard, 2,1) par rapport à la position de contrôle. Chez le sixième sujet (CU), les populations de pointage obtenues dans les deux conditions se recouvrent en partie. En fait, l'étude des pointages successifs réalisés par ce sujet au cours de la vibration nous a révélé l'existence d'un décalage important des pointages au début de l'expérience, suivi d'une disparition de cet effet (fig. 2). Ce fait est à rapprocher de l'impression rapportée par ce sujet qui avait déclaré n'avoir perçu l'illusion de mouvement qu'au début de la vibration.

Des effets du même ordre que ceux que nous observons ici ont été rapportés par Lackner. La vibration d'un muscle du bras immobilisé provoque non seulement une impression de mouvement du bras; un point lumineux fixé à l'extrémité du membre semble lui aussi se déplacer par rapport au sujet. Lackner avait interprété ce résultat comme la conséquence d'une modification de la « position de référence » des yeux par rapport à la tête, elle-même induite par l'impression de déplacement du bras et de la cible visuelle qui y était attachée [1]. Dans nos expériences, la vibration unilatérale des muscles de la nuque produit une illusion de mouvement d'une cible visuelle située dans l'espace extra-personnel, ainsi qu'un décalage des mouvements de pointage dirigés vers cette cible. En d'autres termes, la distorsion systématique par la vibration, du message proprioceptif en provenance des muscles de la nuque, conduit le système nerveux central à une interprétation erronnée de la position réelle de la tête par rapport au corps.

Reçue le 17 février 1986, acceptée le 28 avril 1986.

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BIOLOGIE MOLÉCULAIRE.—Un cas de chevauchement de cadres de lecture chez Escherichia coli. Note de Robert Aufrére, Mare Tempête et Jean-Pierre Rohin, présentée par Rotr Slonimski.

Les deux promoteurs et les 65 premiers nucleotides d'un gène lié à l'opéron rrnB sont situés dans la séquence codante du genebtuB.

MOLECULAR BIOLOGY. — Overlapping reading frames in Escherichia coli.

The two promoters and the first 65 nucleotides ofa gène related to the rrnB operon are localized in the coding - séquence of the btuB gene.

La première étape du transport actif de la vitamine B12 chez Escherichià coli est la fixation de la vitamine sur un récepteur protéique situé dans la membrane externe ([1], [2]). Cette protéine sert en outre de récepteur au bactériophage BF23 et aux colicines du groupe E ([1], [2]). Le gène de structure de cette protéine, btuB, a été localisé sur le chromosome■ d'E. coli entre l'opéron arg ECBH à 89 mn et l'opéron rplKAJLrpoBC à 90mn. De nombreuses études génétiques ont été effectuées sur cette région du chromosome en tirant profit en particulier de l'existence de phages transducteurs spécialisés tels que darg13 [3] et drif 18 [4].

; Pour notre part nous nous sommés intéressés au clonage moléculaire du gène btuB, Ce gène étant présent dans l'insertion d'origine chromosomique de Xdarg 13, c'est partir de l'ADN de ce phage que nous avons réalisé son clonage sur un plasmide à copies multiples : pNF41 (décrit par ailleurs). Au cours de ce travail nous avons observé que la région immédiatement en aval de btuB (vers 90 mn) était très difficile à clonen Kadner et ses collaborateurs ont relevé également cette difficulté [5]. L'imprécision des données dé la carte génétique entre btuB et l'opéron rrnB ne permettait pas de prédire la nature de la région non clonable [6].

/-Nous eûmes recours à l'analyse assistée par ordinateur des banques de données concernant les séquences nucléotidiques d'E. coli (Centre intefuniversitaire de traitement de l'informations CITI2, Paris). Nous avons découvert que la séquence nucléotidique de la fin dû gène btuB [7] avait déjà été publiée en 1983, sans que les auteurs l'aient identifiée comme telle, dans un article concernant l'opéron ribosomiquèTrraS[8]. Rappelons que cet opêron'est organisé comme les six autres opérons des ARN ribosomiques d'E. coli. Il possédé deux promoteurs forts Px. et P2 à partir desquels a lieu une transcription antiterminée[9]. Ces promoteurs présents en aval de btuB sur Xdarg\3 correspondaient donc à la région difficilement clonable (.fig. 1). Ceci est confirmé par le fait que nous avons observé la stabilisation des plasmides portant cette région dans une souche possédant la mutation -nusB 5 qui supprime l'antiterminaison( 10). On peut en fait préciser que lé phage Xdarg 13 s'est très probablement inséré sur le chromosome au site d'attachement GCTTCTTTGCTGACG présent au début du gène de PARN16 S (positions 1 603 à 1617 dans [11]). Le site d'attachement de Xdrif 1%, GCTATTTTACCACGA, est situé dans lapartie codante de btuB= (comparer les séquences publiées dans [7], [8] et [H]). Ce fait ne doit pas étonner-puisque btuB était connu pour présenter des sites d'attachement secondaires pour les phages X et cp 80 [12].

Sur la base d'expériences de transcription in vitro Boros et coll. ont postulé l'existence dé deux promoteurs additionnels initiant la transcription de rrnB et situés à plus de 1000 nucleotides en amont de P1. Ils elonèrent et séquencèrént la partie du chromosome

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en amont du site d'attachement de Xrif IS (en fait une partie de btuB). Ces expériences les conduisirent à proposer qu'à partir des deux promoteurs additionnels P3 et P4 était initiée la transcription d'un ensemble comprenant l'opéron rrnB et un gène codant pour une protéine de poids moléculaire 31400 daltons (fig. 1). La fonction des cette protéine, dont la synthèse a été révélée dans des minicellules [13], reste totalement inconnue.

La comparaison des différentes séquences nucléotidiques publiées indique donc un chevauchement d'opéron puisque P3 et P4 sont dans la partie codante de btuB (200 à 240 nucleotides avant le codon TGA). Bien plus : les 65 premiers nucleotides du gène de la protéine inconnue appartienne également à la partie codante de btuB (fig. 2). Il y a donc chevauchement de deux cadres de lecture.

Nous avons confirmé cette surprenante observation en réalisant deux types d'expériences mettant en jeu le site de restriction Pst I situé dans la région de chevauchement (fig. 2). Le plasmide pNF 41 contient la totalité du gène btuB et les régions en aval présentes dans Xdarg 13. Ce plasmide permet une amplification de la synthèse du récepteur de la vitamine B12 (tableau). Une délétion de pNF41 a été réalisée in vitro à partir du site PstI mentionné ci-dessus (pNF42). Cette délétion élimine toute la région en aval. Elle inactive totalement le gène btuB (tableau). C'est une confirmation de l'observation de Heller et coll. [5] que ce site Pst I est situé dans la partie codante de btuB.

Un fragment de 610 pb EcoRI-PstI, situé en amont et borné par le site précédemment utilisé, a été clone dans l'un des 3 plasmides construits par Minton[14] qui permettent de réaliser in vitro des fusions de gènes en plaçant en phase une partie du gène d'intérêt avec le 8e codon du gène lac Z. L'obtention de fusions de gènes actives (Lac+) dans p NM 482 indique que la région clonée possède des signaux d'initiation de la transcription et de la traduction. De plus la fusion n'est pas réalisée en phase avec le gène btuB mais effectivement décalée d'un nucléotide (fig. 2) et donc en phase avec le gène de la protéine décrite par Boros et coll. Contrairement à ce qui est observé dans le cas de btuB (résultats publiés par ailleurs) l'expression de la fusion réalisée ici n'est pas soumise à la répression par la vitamine B12. L'activité de la protéine hybride reste d'environ 4300U (nmoles d'orthonitrophényl-p-D-galactopyranoside hydrolysées par minute et par milligramme de poids sec), lorsque les bactéries ont été cultivées en milieu minéral 63 [27], le glucose étant la seule source de carbone, que la vitamine B12 soit ou non présente à la concentration de 5.10~ 8 M. Le nombre de copies du plasmide estimé d'après l'activité P-lactamase était d'environ 100 [15]. On peut donc considérer que, dans ces conditions au moins, la protéine inconnue est faiblement exprimée (43 U par promoteur). La recherche des facteurs pouvant influencer l'expression de cette protéine est activement poursuivie dans notre laboratoire.

A partir d'un même site de restriction il est donc possible d'inactiver par délétion le gène btuB et d'obtenir une fusion de gènes active dans un cadre de lecture distinct de celui de ce gène. Ceci démontre sans ambiguité la réalité d'un chevauchement de cadres de lecture d'une ampleur jamais observée chez E. coli.

De nombreux cas de gènes chevauchants ont été trouvés, et étudiés de façon extensive, dans le génome de bactériophages et de virus animaux. Si quelques cas ont été décrits chez E. coli ce phénomène reste cependant rare (voir la revue de Normak et coll. [16]). Chez cet organisme on peut distinguer schématiquement deux types de chevauchements : celui d'unités de transcription et celui d'unités de traduction.

Au premier type on rattachera le chevauchement des opérons frd et amp C le promoteur du gène amp C est situé dans la séquence codant pour les dix derniers acides aminés du


PLANCHE I/JPLATEI

ROBERT AUFRÈRE

Fig. 1. — Carte génétique de la région autour de 89,5 mn. Les blocs noirs représentent les quatre ARN produits de l'opéron rrnB [9]. Pt et P2 représentent ses promoteurs principaux; Ta et T2 ses términateurs forts. P3 et P4, et la protéine inconnue ont été décrits par Boros et coll. [8]. La séquence nucléotidique de btuB a été établie par Heller et coll. [7] et par nous-mêmes. Nous avons déterminé la position du promoteur de btuB (article en préparation). Le gène trmA et'son promoteur ont été caractérisés par Lindstrom et coll. [26]. Lés flèches supérieures indiquent la limite et la direction de l'extension de l'insertion chromosomique de darg 13[3] et de XdriflS[4].

Fig. 1. — Geneticmap of the région around 89.5 min. The black boxes represent the four RNA products ofthe rrnB operon[9]. P1 and P2 represent its two main promoters; T1 and T2 its strong terminators. P3 and PA, and the uncharacterized protein were described by Boros et al. [8]. The nucleotide séquence of btuB was èstablished by Heller et al. [7] and by ourselves. We hâve determined the location of the btuB promoter (article in préparation). The trmA gène and its promoter were characterized by Lindstrom et al. [26]. The uppér arrows show limits and directions of extension of the chromosomal insert in dârgl3[3] and Adrif 18[4].

Fig. 2. — Séquence nucléotidique de la région de chevauchement des cadres de lecture. En haut : la ligne supérieure correspond à la traduction en acides aminés de la séquence du gène btuB; la ligne inférieure à celle du gène de la protéine inconnue. Le site de restriction PstI, dont l'utilisation est décrite dans le texte, est ici souligné. En bas, est rappelée la partie impliquée de la séquence nucléotidique du plasmide pNM482[14]. Sont indiqués les acides aminés impliqués dans la jonction avec la P-galactosidase. L'astérisque signale le 8e codon de lacZ.

Fig. 2. — Nucleotide séquence in the région of overlapping reading frames. Top: the upper Une shows the amino acid translation of the btuB gène séquence; the lower line shows the translation of the uncharacterized protein gène. The Pst I restriction site described in the text is underlined. Bottom: the relevant part of plasmid pNM 482 nucleotide séquence [14]. The amino acids implied in the junction with fi-galactosidase are shown. Tlie 8th codon of lac Z is indicated by an asterisk.



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53;

-TABLEAU'Amplification

-TABLEAU'Amplification la synthèse des récepteurs de la vitamine Bj2..

Amplification of vitamin B12 receptor synthesis.

Nombre de récepteurs Souche Génotype impliqué par bactérie

NFB.344 . . . . ; . btuB+ 420

NFB338..,.;. btuB 202 : Tn 10 .

NFB461 ...... NFB338/pNF41(btuB+) -'5300

NFB471 . .... NFB338/pNF42(btuB A Pst I) : - 0

"Les bactéries cultivées en bouillon nutritif LB [27] ont été collectées en phase exponentielle de croissance par centrifugation. Elles ont été lavées et remises en suspension dans du tampon Tris (50mM), NaN 3 (30mM), pH7,5. La fixation de cyanocobalamine 57Co (5.10-8M, 8750Ci par mole, Amersham) a été déterminée par filtration sur membrane Millipore (0,45 µm) [28].

: Bacteria grown in nutriènt broth LB [21] were collected by centrifugation during éxponential growth. They werè washed and resuspended in Tris (50mM), NaN3 (30mM), pHl:5. Binding of 51Co cyanocobalamin. (5xlO-8M, 8,750Ci per mole, Amersham) was determined by filtration through Millipore membranes 0.45µm).[28].

4e gène de l'opéron frd sans qu'il y ait de chevauchement des cadrés de lecture [16]. On ne connait pas de relation entre les fonctions de ces gènes (fumarate réductase et f3-lactamase). Cependant le chevauchement des unités de transcription produit un lien de régulation, le terminateurde frd agissant comme atténuateur de amp C [l6]. Le chevauchement des gènes de division cellulaire fis A et ftsZ est de même nature mais dans ce casles fonctions des deux gènes sont fortement apparentées [17]. Enfin dans le cas des gènes; dnaQ et rnh les fonctions sont apparentées (participation à la réplication du chromosome) mais les gènes étant convergents c'est au niveau de la fin de la transcription que se produit le chevauchement [18].

Le chevauchement d'unité de traduction n'a été décrit jusqu'à présent que pour des gènes appartenant au même opéron : trp[19], his [20], gal [21], frd [22] et tox [23]. Dans ces cas les signaux d'initiation de la traduction d'un gène sont situés avant les signaux? de terminaison du gène précédent. Lé cas extrême consiste en l'appartenance des 8 nucleotides terminaux dugène frd A, au début de la séquence codante du gène frd B [22],

Une caractéristique commune à ces diverses situations de chevauchement est leur implication, démontrée ou suggérée, dans des processus de corégulation transcriptionnelle: ou traductionnelle suivant le cas.

Dans le cas que nous décrivons ici les deux types de chevauchement coexistent. On ne trouve évidemment pas dans la séquence nucléotidique en aval de btuB l'indication de la présence d'un terminateur indépendant du facteur rho. On ne peut cependant pas exclure , qu'il y ait un terminateur dépendant du facteur rho. En l'absence de tout signal de terminaison la transcription initiée au promoteur de btuB devrait se poursuivre dansl'opéron 7-mB. Quoi qu'il en soit le chevauchement observé a vraisemblablement des conséquences sur la transcription et la traduction des deux gènes impliqués. ; Dans la mesure où la fonction du produit du gène chevauchant btuB est inconnue nous ne pouvons préciser s'il existe une relation fonctionnelle entre ces gènes. On imaginé , pourtant difficilement le lien qui pourrait exister entre le récepteur membranaire de la vitamine B12 et un opéron d'ARN ribosomique. Certes on sait depuis longtemps que des protéines ribosomiques sont impliquées dans la biosynthèse de la vitamine B12 ([24], [25]), Mais cela pourrait bien n'être qu'une coïncidence.


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Nous remercions M. J. Legault-Démare, Professeur, dans le laboratoire de qui ce travail a été effectué, pour l'intérêt constant qu'il a porté à nos recherches. Nous sommes redevables à M. C. Mugnier de son aide dans l'interrogation des banques de données.

Reçue le 10 mars 1986, acceptée le 12 mai 1986.

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Institut de Microbiologie, U.A. n° 136 C.N.R.S., Université .Paris-Sud, 91405 Orsay Cedex.


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;. BIOLOGIE MOLÉCULAIRE. — Interaction moléculaire entre spirobuténolides sy.nthé-. tiques et inhibiteur normal de la C± esterase. Note de Pascal Bador, Marie-Paule ©Hier-: Hartmann, Joëlle Paris et Lucien Hartmann, présentée par René Wurmser,

. Des études antérieures ont montré que des dérivés synthétiques de structure spirobuténolide avaient un . pouvoir inhibiteur vis-à-vis de la C1 estérase. A l'opposé certains dérivés, en présence dé sérum humain normal, iie possèdent pas une telle propriété, .et c'est au contraire une augmentation de l'effet estérasique que l'on observe. Il est montré dans la présente note que cet effet est dû à une interaction avec l'inhibiteur sérique. normal.

MOLECULAR BIOLOGY. — Molecular interaction between synthetic. spirobuténolides and C1 esterase normal inhibitor. .

Previously we have found that .spirobutenolide synthetic derivatives show an inhibiting effect on C, esterase. activity. In contrast to these compounds some derivatives in the same série réveal an esterasic activity when they are added to a C1 esterase préparation in présence of normal serum. The present work shows that this effect reflect an interaction with natural inhibitor Cl INH.

INTRODUCTION. — Lors de travaux antérieurs ([I], [2]) nous avons mis en évidence l'effet inhibiteur sur la C1 estérase de composés synthétiques de structure spirobuténolide. Il est possible qu'à l'avenir un: tel effet; inhibiteur soit mis à profit pour le traitement de l'oedème angioneurotique héréditaire (OANH), affection caractérisée biologiquement par le caractère afonctionnel de l'inhibiteur naturel, l'a2 neuraminoglycoprotéine ou inhibiteur de C1 éstérase (C1 INH). Cependant, au cours de ces travaux nous avons noté le comportement particulier de certains composés qui en présence de C1 estérase et de. sérum de sujets sains ne majorent pas l'effet de l'inhibiteur naturel mais au contraire augmentent l'activité esterasique.

L'objectif de notre travail est de connaître les raisons pour lesquelles des molécules de structures spirobuténolides proches les unes des autres ont des activités fonctionnelles différentes.

: MÉTHODES. —, Quatre dérivés.spirobuténolides sont étudiés, deux déjà décrits [2], les composés I et 2:

..Deux nouveaux composés 3 et, 4 sont préparés à partir de l'acide carboxy-3 cyclohexane spiro 4,4 butène-2 olide 4 et de ses.dérivés, dont nous avons décrit la préparation antérieurement ([2], [4]). .. La synthèse du composé 3 est obtenue selon un protocole que nous avons mis au point [2].

0249-6313/86703030055 $2.00 © Académie des Sciences


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La synthèse du composé 4 est opérée par aminométhylation de l'amide correspondant par action du formol et de la diéthyle aminé dans le tetrahydro furanne anhydre avec un rendement de 60 p. cent.

Les activités fonctionnelles des molécules 1 à 4 sont déterminées selon une technique que nous avons précédemment décrite ([1], [2], [4]). Les composés à concentrations de 1 à 4 mg/ml sont mis en présence de Ct esterase soit seule [5], soit additionnée de sérum de sujet sain, ou d'inhibiteur purifié. Cette préparation de C1 INH est pratiquée selon une technique antérieurement exposée [6].

RÉSULTATS ET DISCUSSION. — Les caractéristiques physico-chimiques des composés 1 et 2 ont été publiées (2), celles des composés 3 et 4 sont les suivantes :

Les propriétés fonctionnelles des quatre molécules sont définies par les résultats portés dans le tableau. Dans nos conditions expérimentales :

— le produit 2 manifeste un effet inhibiteur sur la Ct esterase modéré. Les composés 1, 3 et 4 sont sans effet, les valeurs —0,25 et +0,6 étant non significatives;

— pour les quatre composés, en présence de sérum normal, on enregistre des résultats semblables. Aucune activité inhibitrice n'est constatée. Au contraire celle du sérum normal a disparu, remplacée.par une activité estérasique augmentant avec les concentrations en dérivés synthétiques;


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TABLEAU

Effet de l'addition des composés R sur l'esterolyse du N-acétyl-L-tyrosine-ethyl-ester. Les valeurs positives correspondent aux effets inhibiteurs sur la Cl esterase, les valeurs négatives aux interactions avec l'inhibiteur sérique normal Cl INH.

Effect of adding R compounds on N-acétyl-L-Tyrosine-ethyl-ester esterolysis. Positive values apply to Cl esterase inhibition, négative to interactions with normal Cl INH.

. — en présence d'inhibiteur naturel Cx INH purifié, éliminant ainsi de nombreux facteurs d'interactions, les résultats sont du même ordre: aucun effet inhibiteur n'est enregistré.

L'analyse des résultats du tableau autorise à conclure que les composés synthétiques interfèrent avec l'inhibiteur naturel, au niveau du site actif de ce dernier et/ou par modification de la chaîne polypeptidique, et non avec d'autres protéases.

Dans une Note précédente [7] nous avons décrit un composé dont l'effet inhibiteur vis-à-vis de la, C1 esterase s'additionne à celui de l'inhibiteur naturel. Nous sommes donc en présence, dans la même série spirobuténolide, de deux groupes de composés possédant des activités fonctionnelles opposées. L'un pourrait être utilisé en guise de thérapeutique substitutive au cours de l'OANH, l'autre pour le traitement d'affections caractérisées par une activité protéasique.

Ce travail a été subventionné par le C.N.R.S, (ASP PIRMED n° 109). .Reçue le,-28 avril 1986.

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8, avenue Rockefeller, 69373 Lyon Cedex 08 ;

M.-P. O.-H. et L. H. : Laboratoire de Chimie clinique et Biologie moléculaire,

Institut biomédical des Cordeliers, Association Claude-Bernard, C 20, .

U 202 I.N.S.E.R.M., U.A.-C.N.R.S. n° 627,

15, rue de l'École-de-Médecine, 75270 Paris Cedex 06.


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MEDECINE ET THÉRAPEUTIQUE..— Augmentation de la rétraction de lattis de collàgène par des fibroblastes de malades atteints de sclérodermie. Note de Philippe Gillery, François-Xavier Maquart, Bernard Kalis et Jacques-Paul Borel, présentée par Paul Mandel.

Des fibroblastes humaines provenant de biopsies effectuées en peau lésée chez huit malades atteints de sclérodermie ont été ensemencés en lattis de collagène, et leur capacité de rétraction comparée à celle de fibroblastes de sujets normaux. Dans tous les cas étudiés, les fibroblastes des malades atteints de sclérodermie ont provoqué une rétraction des lattis de collagène plus précoce et plus intense que celle des fibroblastes témoins. Ce phénomène observé in vitro peut être rapproché de la rétraction cutanée constatée dans les lésions sclérodermiques in vivo.

MEDICINE AND THERAPEUTICS. —Increased retraction of collagen lattices by scleroderma fibroblasts.

Skin fibroblastsfrom eight scleroderma patients were seeded in collagen lattices, and their capacity of retraction was compared to that of fibroblasts from normal volunteers. In all cases; pathological fibroblasts retracted collagen lattices earlier and more intensively than controls. This in vitro feature may be related to the cutaneous retraction which characterizes scleroderma lesions in vivo,

Abréviations : DMEM, milieu de Eagle modifié par Dulbecco; SVF, sérum de veau foetal.

INTRODUCTION. — Les sclérodermies constituent un groupe de maladies caractérisées par des altérations localisées au niveau du tissu conjonctif et portant atteinte principalement au derme, à l'oesophage, au poumon et au rein. Elles se manifestent par une fibrose progressive des tissus associée à une accumulation de fibres de collagène [1]. Leur physiopathologie reste encore, à l'heure actuelle, inexpliquée:

Certaines anomalies métaboliques constatées in vivo ont pu être reproduites in vitro, comme par exemple la synthèse accrue de collagene par des fibroblastes de derme sclérodermique cultivés eh couche monocellulaire ([2], [3]). Par contre, aucun protocole expérimental n'a permis, jusqu'à présent, de mettre en évidence lés anomalies dynamiques du comportement des fibroblastes susceptibles d'être rapprochées des troubles constatés chez les malades.

En 1979, Bell et coll. [4] ont montré que des cellules de nature fibroblastique pouvaient être cultivées au sein d'un réseau tridimensionnel de fibrilles de collagène (lattis de collagène). Dans ce système, qui reproduit plus fidèlement les conditions physiologiques que les cultures en couche monocellulaire, les fibroblastes rétractent progressivement le lattis dans lequel ils ont été ensemencés. Nous avons utilisé ce modèle pour étudier les potentialités de fibroblastes provenant de peau sclérodermique et démontrons que ces cellules rétractent les lattis plus rapidement et de manière plus intense que les fibroblastes normaux.

MATÉRIEL ET MÉTHODES. — Les milieux et réactifs pour les cultures cellulaires ont été fournis par « Gibco », et les boîtes de culture par « FIow ». Le cytosine-arabinoside a été obtenu chez « Aldrich Chemical Company ». Les cultures dé fibroblastes ont été réalisées selon des techniques de routine [5], à partir d'explants obtenus par punch-biopsie (diamètre 9 mm). Ces prélèvements ont été effectués :

(1) En peau lésée, chez huit personnes atteintes de sclérodermie : huit femmes âgées de 20 à 72 ans, parmi lesquelles quatre sclérodermies généralisées et quatre sclérodermies localisées.

(2) Chez six volontaires normaux d'âges correspondants; ces personnes étaient informées du but de l'intervention et ont donné leur accord.

Après la mise en culture, les fibroblastes ont été maintenus en milieu minimal essentiel de Eagle contenant 20% de sérum de veau foetal (SVF) et 0,28 mM d'acide ascorbique. La stérilité des cultures a été régulièrement vérifiée, en particulier en ce qui concerne les mycoplasmes. Seules.des souches ayant subi 5 à 10 passages ont été utilisées pour les cultures en lattis. Dans tous les cas, les fibroblastes normaux et pathologiques utilisés

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dans une même expérience avaient subi le même nombre de passages. Le collagène digéré par la pepsine a été préparé selon la méthode de Fujii et Kühn, à partir de derme de veau [6]. Il a été stérilisé par trois lavages de 30 mn et maintien à 4°C dans l'éthanol à 70% puis rincé avec de l'eau distillée stérile et dissous à une concentration de 2 mg/ml dans une solution d'acide acétique 0,018 M stérile.

Les fibroblastes confluents ont été détachés de leur support par trypsinisation, recueillis par une centrifugation de 10 mn à 800 g et dilués dans du milieu de Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) à la concentration de 4 ou 10.105 cellules par millilitre, selon les cas.

Les lattis de collagène ont été préparés selon la méthode de Delvoye et coll., avec quelques modifications [7] : 3 ml de solution stock de milieu d'incubation (contenant 1,85 ml de DMEM 2,5 fois concentré, 0,5 ml de sérum de veau foetal, 0,4 ml d'eau bidistillée et 0,25 ml de soude 0,1 M) sont introduits dans une boîte de Pétri de 50 mm de diamètre et amenés à 37°C. 1,5 ml de la solution de collagène, conservée à 4°C, et 0,5 ml de la suspension de fibroblastes sont ensuite ajoutés dans cet ordre, de façon presque simultanée. Après agitation douce, le lattis se forme en moins de 5 mn à 37°C, par fibrillation du collagène. Le diamètre des lattis a ensuite été mesuré chaque jour, à l'aide d'une règle graduée, en plaçant le disque sur un fond noir.

Toutes les manipulations ont été effectuées en quadruple. L'analyse statistique des résultats a été effectuée par le test t de Student et le test U de Mann et Whitney [8].

RÉSULTATS. — Les fibroblastes de six malades sclérodermiques ont été ensemencés à raison de 200000 cellules par lattis. La courbe moyenne de rétraction pendant 7 jours, comparée à celle obtenue avec les fibroblastes de témoins normaux, est présentée dans la figure 1. La rétraction induite par les fibroblastes des malades est à la fois plus rapide et plus intense que celle provoquée par les fibroblastes de personnes saines. Cette rétraction est visible dès la 24e heure chez les malades atteints de sclérodermie et reste supérieure à celle des témoins pendant toute la durée de la culture. L'analyse statistique des résultats aux divers délais met en évidence, pour chaque mesure, une différence significative des valeurs obtenues avec les fibroblastes des malades et des personnes saines (p<0,01 par le test de t et le test de U).

Dans une expérience complémentaire, du cytosine-arabinoside à la concentration de 1 ug/ml a été ajouté au milieu de culture. Cette addition n'a entraîné aucune modification de la rétraction (fig. 2).

Nous définissons le temps de demi-rétraction comme le temps nécessaire pour provoquer une diminution de moitié du diamètre des lattis. Le tableau montre que le temps de demi-rétraction est réduit de 51 % dans le cas de fibroblastes de peau sclérodermique comparés aux fibroblastes témoins.

Les fibroblastes de deux autres malades et ceux d'un témoin d'âge correspondant ont été ensemencés dans les lattis à raison de 500 000 cellules au lieu de 200000 dans l'expérience précédente. Les courbes de rétraction correspondantes sont présentées dans la figure 3 : dans ces conditions, aucune différence n'est observée entre les 3 séries de lattis au 1er jour de culture. Par contre, dès le 2e jour, une rétraction significativement plus intense (p<0,05) apparaît dans les lattis contenant les fibroblastes provenant de malades atteints de sclérodermie. La différence entre les deux cultures s'accroît ensuite progressivement pendant toute la durée de l'expérience.

DISCUSSION. — Les lésions anatomo-cliniques observées au cours des sclérodermies, caractérisées par une rétraction progressive des tissus, touchent plus particulièrement le derme. Toutefois des organes internes tels que l'oesophage, le poumon, le rein peuvent également être atteints. Les lésions peuvent être soit localisées, soit généralisées, et leur évolution est très variable [1]. On constate au niveau des tissus atteints une accumulation de fibres de collagène. On ignore cependant la physiopathologie de l'affection. Des travaux portant sur des fibroblastes de derme sclérodermique cultivés en couche monocellulaire mettent en évidence des sécrétions accrues de collagène ([2], [3], [9]) et de


PLANCHE I/PLATE I

PHILIPPE GILLERY

TABLEAU

Mesure du temps de demi-rétraction de lattis de collagène ensemencés avec 200 000 fibroblastes dermiques (moyenne de six sujets sclérodermiques et de six témoins normaux, +1 erreur standard de la moyenne).

(*): p<0,01 par le test-t de Student et le test-U de Mann et Whitney.

Meaurement of the half-retraction time of collagen lattices seeded with 200,000 skin fibroblasts (mean of six scleroderma patients and six controls, ±1 standard error of the mean). (*): p< 0.01 by both Student's t-test

and Mann and Whitney's U-test).

Temps de demi-rétraction

(h)

Témoins. Malades

100,9 + 9,1 49,2 + 3,0 (*)

Fig. 1

Fig. 2

Fig. 3

Fig. 1.— Rétraction de lattis de collagène par des fibroblastes dermiques provenant de six sujets atteints de sclérodermie (O) et de six témoins normaux (O) : moyenne des six cas +1 erreur standard de la moyenne.

Les lattis étaient ensemencés avec 200000 cellules. Fig.1. — Retraction of collagen lattices by skin fibroblasts from six scleroderma patients (O) and six control subjects (O): mean of six cases± 1 standard error of the mean. Lattices were seeded with 200,000 cells,

Fig. 2. — Rétraction de lattis de collagène par des fibroblastes dermiques provenant d'un patient sclérodermique (A, A.) et d'un sujet normal (O, O) en présence (A, O) ou en absence (A, O) de cytosine-arabinoside (1 µg/ml). Les lattis étaient ensemencés avec 200000 cellules.

Fig, 2. — Retraction of collagen lattices by skin fibroblasts from a scleroderma patient (A, A) and a normal. control (O, ®) incubated with (A, @) or without (A, O) cytosine-arabinoside (1 µg/ml). Lattices were seeded with 200,000 cells.

Fig. 3. — Rétraction de lattis de collagène par des fibroblastes dermiques provenant de deux patients

sclérodermiques (O, V) et d'un témoin normal (©). Chaque lattis était ensemencé avec 500000 cellules. Les

résultats sont la moyenne d'expériences effectuées en quadruplicata, +1 erreur standard de la moyenne.

O, patient S.G., 20 ans; V, patient C.H., 20 ans; ©, témoin normal, 24 ans.

Fig, 3.— Retraction of collagen lattices by skin fibroblasts from two scleroderma patients(O, V) and a normal

control (®). Every lattice was seeded with 500,000 cells. Results are mean of quadruplicate experiment

+1 standard error of the mean. O, patient S.G., 20 years; V, patient C.H., .20 years; ©, control, 24 years.



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fibronectine [10], au moins pendant les premiers passages. Différentes hypothèses ont été proposées : activation des fibroblastes par certaines lymphokines ou monokines [11], présence d'une protéase circulante cytotoxique pour les cellules endothéliales et provoquant une réaction inflammatoire localisée ([12], [13]), sélection de clones de fibroblastes sécrétant des taux élevés de collagène [14], diminution de la rétro-inhibition de la synthèse du collagène par l'extension N-terminale du collàgène de type I [15], ou encore absence d'une glycoprotéine de structure régulatrice de la synthèse du collagène [16].

Les divers travaux, qui n'ont pas encore abouti à une conclusion définitive, ont porté sur des fibroblastes cultivés en couche monocellulaire. Il a été reproché à ces essais que l'absence de matrice extracellulaire — à laquelle les cellules sont normalement associées dans les tissus — modifie considérablement l'état de différenciation des fibroblastes cultivés [17]. De plus, cette approché est incapable de rendre compte d'anomalies de type dynamique pouvant affecter le comportement des cellules. Dans les cultures en lattis, au Contraire, les fibroblastes sont dispersés au sein d'un réseau tridimensionnel de fibrilles de collagène reproduisant grossièrement une situation proche de l'état physiologique. Ce phénomène de rétraction progressive, quantifié par la mesure du diamètre des lattis, permet d'évaluer l'intensité des tractions que les cellules exercent sur leur substrat [18].

Le mécanisme de la rétraction est encore mal expliqué. Il nécessite l'intégrité fonctionnelle du cytosquelette [4]. Il nécessite la présence de sérum ([19], [20]). En outre, nous avons montré la participation dans ce phénomène [21] de la fibronectine apportée par le sérum et/ou secrétée par les cellules.

Très peu de travaux ont été publiés sur la culture de fibroblastes pathologiques en lattis : Ehrlich et coll. ont montré une diminution de la capacité de rétraction des lattis de collagène par des fibroblastes de malades atteints d'épidermolyse bulleuse dystrophique récessive [22]. Cette capacité est totalement abolie dans le cas des fibroblastes cutanés de veau atteint de dermatosparaxie [7]. Nous apportons ici, pour la première fois, les résultats de cultures de fibroblastes de peau sclérodermique dans des lattis de collagène. La réalisation de cette étude nous a été suggérée par le fait que les lésions cutanées de cette affection se caractérisent avant tout par une rétraction évoluant vers la sclérose. Les résultats obtenus montrent qu' in vitro, les fibroblastes de malades sclérodermiques sont doués d'une capacité de rétraction accrue par rapport à celle dé fibroblastes de témoins normaux de même âge ayant subi le même nombre de passages en culture; un phénomène observé in vivo a pu ainsi être reproduit. Le temps nécessaire pour obtenir une réduction de moitié de la surface des lattis est d'environ 50% inférieur avec les fibroblastes pathologiques qu'avec les fibroblastes normaux.

L'augmentation de la capacité de rétraction est particulièrement nette lorsque les fibroblastes sont ensemencés à raison de 200000 cellules par boîte. Lorsque les cellules sont ensemencées à une densité de 500000 par boîte, la rétraction est très rapide dans les 24 premières heures, si bien qu'il est difficile de mettre en évidence une augmentation de l'intensité dé celle-ci avant la 48e heure. La rétraction est en effet d'autant plus rapide que le nombre de cellules ensemencées est plus grand ([4], [7]),

L'utilisation d'un inhibiteur de la multiplication cellulaire, le cytosine-arabinoside, a permis de démontrer que la rétraction accrue dans les cultures de fibroblastes sclérodermiques n'est pas liée à une augmentation de la prolifération cellulaire. Les mêmes résultats obtenus avec les cellules normales confirment les données publiées précédemment par Coulomb et coll. [23].

En somme, nos résultats démontrent que les fibroblastes provenant de derme de malades sclérodermiques rétractent les lattis de collagène plus vite que les fibroblastes


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d'un derme normal. Cette anomalie peut faire évoquer la responsabilité directe des cellules dermiques dans les phénomènes pathologiques observés in vivo. D'autres travaux sont en cours, portant sur d'autres caractéristiques de la maladie. Néanmoins, la capacité de rétraction des lattis de collagène par les fibroblastes cutanés pourrait être un index d'évolutivité de l'affection.

Les auteurs ont bénéficié du soutien financier de l'I.N.S.E.R.M. (CRE832 026 et CRE832022), du C.N.R.S. (U.A. n° 610) et de l'Université de Reims. Ils remercient Mlle Oudard pour la dactylographie du manuscrit.

Reçue le 3 mars 1986, acceptée après révision le 12 mai 1986.

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[23] B. COULOMB, L. DUBERTRET, E. BELL et R. TOURAINE, J. Invest. Dermatol, 82, 1984, p. 341.

Ph. G., F. X. M. et J. P. B. : Laboratoire de Biochimie, U.A.-C.N.R.S. n° 610,

Faculté de Médecine, 51, rue Cognacq-Jay, 51095 Reims Cedex;

B. K. : Service de Dermatologie, Hôpital Sébastopol,

48, rue de Sébastopol, 51092 Reims Cedex.


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ÉCOLOGIE GÉNÉRALE. —Essai sur une classification biologique et écophysiologique des Collemboles(Insectes) cavernicoles. Note de Jean-Marc Thibaud, présentée par Jean Dorst.

Pour caractériser les espèces cavernicoles chez les Insectes Collemboles, une connaissance précise de l'habitat et des caractères morphologiques n'est plus suffisante. Il est nécessaire d'étudier quelques caractères biologiques et écophysiologiques : productivité, teneur en graisse et en eau des tissus, pouvoir de régulation hydrique, métabolisme respiratoire et résistance au jeûne.

GENERAL ECOLOGY. — An attempt to a biological and ecophysiological classification of cavernicolous Collembola (Insecta).

Among Collembola (Insecta) in order to characterize the cavernicolous species of troglobics, a precise knowledge of the habitat and morphological characters is no longer sufficient. There is a need to evaluate several biological and ecophysiological characteristics: productivity, proportion of fat and humidity, water regulation, capacity respiratory metabolism and resistance to fast.

Les Collemboles sont des Insectes Aptérygotes de très petite taille (1 à 2 mm), les plus anciennement connus, puisque Rhyniella praecursor [1] date du Dévonien inférieur. Grâce à leurs grandes aptitudes écophysiologiques, ils ont traversé les ères géologiques tout en conservant, pour certains, l'aspect de leurs lointains ancêtres, et ont pu envahir tous les biotopes, puisqu'on les rencontre des bords de mer jusqu'aux neiges éternelles, sous tous les climats et sous toutes les latitudes. Ils vivent principalement dans le sol et ses annexes; certains se sont adaptés à la vie cavernicole, d'autres (la plupart des Symphypléones) ont envahi le milieu épigé.

Tout d'abord, pour classer les Collemboles « cavernicoles », nous avions adopté la classification, fondée sur l'habitat, établie par Schiner [2], modifiée par Racovitza [3], en troglobies (formes strictement inféodées aux grottes), troglophiles (formes vivant dans le sol et ses annexes, mais se rencontrant aussi dans les grottes) et trogloxènes (formes occasionnelles). Cependant nous pensions qu'il n'y avait pas lieu, chez les Collemboles, de différencier les troglophiles des trogloxènes. Nous avions recensé alors en Europe près de 32% d'espèces cavernicoles dont 16% de troglobies [4]. Nous pensons maintenant que ce critère; fondé sur l'habitat est nécessaire, mais insuffisant et parfois aléatoire, les connaissances biogéographiques sur ce groupe étant loin d'être complètes, même en Europe.

Nous avons montré ensuite que chez les Collemboles, la dépigmentation et la régression oculaire, allant souvent jusqu'à l'anophthalmie, ne se rencontrent pas seulement chez les formes troglobies, mais aussi chez les eu-édaphiques et même chez,certaines hémiédaphiques ([5] et [6]). En revanche chez certaines troglobies, les griffés sont plus longues et plus fines (Ongulogastrura, les Tritomurus et les Pseudosinella), ce caractère étant une adaptation à la marche sur l'eau ou sur un substrat humide. Les sensilles semblent aussi particulièrement développés chez certaines troglobies, tels Ongulogastrura longisensilla [7]. . Ainsi donc la morphologie ne permet pas à elle seule dé séparer nettement les troglobies des autres. La dépigmentation, l'anophthalmie, l'allongement des pattes, de leurs griffes

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et de certaines sensilles sont des caractères nécessaires, mais non suffisants, pour caractériser une espèce de « troglobie ».

Il semble bien établi maintenant que seule une connaissance précise de la biologie et de l'écophysiologie des espèces permet de les classer « écologiquement ». En fait les formes troglobies présentent :

(a) Une productivité plus faible que les formes de surface : par exemple, chez les Hypogastruridae, une femelle de Bonetogastrura balazuci, troglobie d'une grotte d'Ardèche, engendre 50000 descendants en 3 générations, en 3 ans, alors qu'une femelle de Ceratophysella denticulata, hémi-édaphique-troglophile, engendre 5 millions de descendants en 3 générations, en 2 ans seulement [5].

(b) Une tendance à augmenter la teneur en graisse de leurs tissus et à diminuer celle en eau : par exemple, parmi les Tomocerus, T. problematicus a une teneur en graisse de 18 à 32%, alors que T. minor, hémi-édaphique-troglophile, n'en a que 6 à 16%. Les teneurs en eau sont respectivement de 288 à 305%, et de 316 à 360% [8].

(c) Une diminution de leur pouvoir de régulation hydrique. Ces formes n'exercent aucun contrôle sur leur perte d'eau corporelle (type hygrophile) : toujours parmi les Tomoceridae, T. minor, hémi-édaphique-troglophile, appartient encore au type mésophile et est capable de maintenir son flux d'évaporation corporelle à un niveau stable; il en est de même pour T. problematicus, connue de quatre grottes des Pyrénées. En revanche, Tritomurus falcifer, connue de deux grottes de Haute-Garonne, T. scutellatus de plusieurs grottes de Yougoslavie et Tomocerus catalanus des grottes de Catalogne, sont tous, à des degrés divers, incapables de maîtriser leur perte en eau, et donc appartiennent au type hygrophile [9].

(d) Une diminution de leur métabolisme respiratoire : l'activité respiratoire d'une espèce cavernicole comme T. catalanus est très nettement inférieure à celle d'une espèce de surface comme T. minor (0,195 µl contre 0,292 ul par heure pour un poids sec de 0,250 mg) [11].

(e) Ces formes troglobies présentent aussi une plus forte résistance au jeûne : Tritomurus falcifer et Tomocerus problematicus résistent pendant 2 à 3 mois, alors que T. minor ne résiste qu'un mois [10].

Toutes ces caractéristiques mettent bien en évidence le ralentissement des activités vitales, de la productivité et donc la stratégie de type K employée par ces animaux troglobies.

En conclusion, nous pouvons dire que, chez les Collemboles, pour distinguer les troglobies de ceux qui vivent dans d'autres milieux, la connaissance de l'habitat et des caractères morphologiques ne suffit plus. Il faudra dorénavant recourir aux spécificités biologiques et écophysiologiques. Ceci est d'ailleurs valable pour la plupart des animaux troglobies, aériens ou aquatiques.

Reçue le 7 avril 1986.

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Muséum national d'Histoire naturelle, Laboratoire d'Écologie générale, 4, avenue du Petit-Château, 91800 Brunoy.



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EMBRYOLOGIE GÉNÉRALE. — Effet mitogène du sulfate de zinc envers les cellules germinales primordiales des embryons de Rana dalmatina (Amphibien Anoure). Note de Jean-Daniel Gipouloux, Colette Girard et Simone Gipouloux, présentée par Nicole Le Douarin.

Le traitement des embryons de Grenouille par le sulfate de zinc pendant la période de migration intraendodermique des cellules germinales primordiales a pour conséquence le doublement du nombre de celles-ci et la diminution de leurs dimensions. L'ion Zn2+ semble donc induire un cycle mitotique surnuméraire dans les cellules germinales en migration.

GENERAL EMBRYOLOGY. — Mitogenic effect of zinc sulphate on the primordial germ cells in Rana dalmatina (Amphibia Anura) embryos.

Frog embryos Were treated by zinc sulphate during the time of intraendodermic migration of the primordial germ cells. The treatment results in the doubling of the number of primordial germ cells and a significant decrease of their diameter. The Zn2+ ion thus seems to induce a supernumerary mitotic cycle in the migrating germ cells.

INTRODUCTION. — Au cours de leur migration intraendodermique, les cellules germinales primordiales (CGP) des embryons d'Amphibiens Anoures subissent des mitoses successives et vraisemblablement programmées ([1], [2]). Au terme de leur migration, les CGP colonisent les crêtes génitales où les divisions cellulaires s'arrêtent jusqu'à l'arrivée des constituants médullaires de l'ébauche gonadique ([3], [4], [5]). A leur arrivée dans les crêtes génitales, les CGP sont présentes en nombre sensiblement constant dans les espèces d'Amphibiens Anoures que nous utilisons couramment (Rana dalmatina et Bufo bufo). Il existe toutefois des variations de leur nombre: variations de faible amplitude entre individus provenant d'une même ponte, variations plus importantes entre individus de pontes différentes. De telles variations, étudiées récemment dans différentes souches de Xenopus laevis, sont attribuées initialement à des variations de la quantité de cytoplasme germinal disponible pour déterminer la qualité germinale des cellules qui le contiennent [6]. Toutefois, lorsque le cytoplasme germinal a été réparti entre un certain nombre de cellules, celles-ci constituent la souche unique dont dérivent, par mitoses successives au cours de leur migration, toutes les CGP [7]. La période de migration intraendodermique représente donc une période sensible dans l'évolution numérique des CGP. Il nous a paru intéressant d'éprouver cette sensibilité en utilisant comme stimulant éventuel de l'activité mitotique l'ion Zn2+. Celui-ci est connu pour favoriser la prolifération cellulaire ([8], [9], [10]) et, en particulier, la prolifération des cellules germinales chez certains Invertébrés qui est alors associée à la formation d'une lignée germinale surnuméraire, édifiée à partir d'éléments somatiques [11].

MATÉRIEL ET MÉTHODES. — Les embryons de Grenouille agile (Rana dalmatina Bon.) provenant d'une seule et même ponte sont choisis au stade du bourgeon caudal (stade 26 [12]) et placés dans de l'eau du robinet contenant du sulfate de zinc (40 mg de ZnSO4.7H2O par litre). La concentration ionique finale est de 9 mg Zn2+/1. Cette concentration optimale a été déterminée empiriquement, les concentrations plus faibles étant sans effet, les plus fortes étant toxiques. Les jeunes larves traitées, ainsi que des larves témoins provenant d'embryons de la même ponte mais placés dans l'eau pure, sont fixées au stade 36, stade auquel les CGP ont terminé leur migration et sont incluses dans lés crêtes génitales. Les larves sont débitées en coupes sériées de 7 µm d'épaisseur, colorées par l'hématoxyline et l'éosine. Les CGP sont identifiées sur les coupes grâce à leurs grandes dimensions et à la coloration pâle de leur noyau plurilobé. Elles sont alors dénombrées et le diamètre de toutes leurs sections est mesuré sur des dessins effectués à la chambre claire. A titre de comparaison, les cellules ont été comptées dans différents tissus non gonadiques (moelle épinière, musculature somitique, pancréas, épiderme ventral) selon la technique suivante: les noyaux cellulaires sont dénombrés dans des

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TABLEAU

Résultats du dénombrement et de la mesure du diamètre des sections des CGP chez les larves témoins et traitées par le Zn2+. Les résultats sont exprimés en moyenne + erreur standard. (a) différence hautement significative (P<0.01) des valeurs trouvées chez les larves traitées par rapport à celles observées chez les témoins.

Number and diameter of cross-sections of PGCs in control and Zn2+ treated larvae. Means + standard error. (a) highly significant differences (P<0.01) between control and treated values.

Diamètre moyen des sections Nombre de CGP par larve de CGP (en µm)

Larves témoins (n = 10) 32,70 + 1,00 41,95±0,46

Larves traitées par SO4Zn (n = 10). . 66,20±0,83 33,74+0,29

(a) (a)

surfaces arbitraires, mais constantes, définies par un réticule oculaire, sur cinq coupes transversales tirées au sort pour chaque animal étudié. Les dénombrements et mesures ont été pratiqués systématiquement sur 10 larves traitées et 10 larves témoins. La signification statistique des différences constatées a été évaluée par l'analyse de variance (test F de Fisher).

RÉSULTATS. — Le traitement par le sulfate de zinc n'entraîne aucun retard dans le développement des embryons : lors de la fixation les larves traitées et témoins ont atteint le même stade de développement; leur morphologie, leur anatomie et leur aspect histologique sont identiques. Le résultat des comptages concernant les cellules des tissus non gonadiques ne fait apparaître aucune différence significative de densité nucléaire entre les organes des larves traitées et des larves témoins.

Le résultat du dénombrement des CGP est exprimé dans le tableau. On peut y constater que le nombre des CGP des larves traitées est pratiquement le double de celui des CGP des larvés témoins, la différence observée étant hautement significative.

Le résultat des mesures du diamètre de la totalité des CGP est indiqué dans le tableau et l'histogramme. Il ressort de ces mesures que le diamètre mesuré des CGP est nettement plus petit chez les larves traitées par le Zn2+ que chez les larves témoins, la différence constatée étant hautement significative.

DISCUSSION. — Le traitement des embryons par le sulfate de zinc pendant la période de migration intraendodermique des CGP a pour conséquence une notable augmentation du nombre de celles-ci qui est multiplié par deux. Cette augmentation peut être attribuée à deux causes : ou bien le traitement suscite la formation de CGP surnuméraires « néoformées » à partir de cellules endodermiques non germinales, ainsi que cela se produit chez les Annélides Oligochètes [11], ou bien les CGP subissent, au cours de leur migration, une mitose supplémentaire sous l'effet du Zn2+.

La seconde hypothèse implique la formation de CGP de petite taille, puisque la division des cellules embryonnaires possédant une lourde charge vitelline n'est pas suivie d'une augmentation de volume des cellules filles. Si l'on assimile la forme d'une CGP à une sphère, lorsque celle-ci se divise, son volume est donc réduit de moitié et son diamètre

est réduit de 3/2. Si ce dernier coefficient est appliqué à la moyenne du diamètre des

CGP des larves témoins, on trouve une valeur théorique de : 41,95 µm/ 3/2 soit 33,31 µm. Cette valeur théorique est très voisine de celle observée pour la valeur moyenne du diamètre des CGP des larves traitées par le Zn2+ (33,74 µm). Cette constatation apporte un argument de poids à l'hypothèse selon laquelle les CGP, sous l'influence du Zn2+,


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subissent lors de leur migration intraendodermique une mitose surnuméraire responsable du doublement de leur nombre et de la diminution de leurs dimensions. Le cycle mitotique surnuméraire dont l'existence est constatée n'intéresse que les CGP puisque les tests de numération des noyaux cellulaires pour les différents organes non gonadiques choisis ne montrent aucune différence significative entre les larves traitées et témoins.

Le fait que seules les CGP intraendodermiques répondent à la présence du Zn2+ par une division mitotique (et pas les autres cellules de l'embryon), s'il n'a pas encore reçu d'explication satisfaisante, constitue toutefois un caractère intéressant de cette lignée cellulaire dont l'utilisation peut être profitable pour l'étude de la prolifération cellulaire des CGP aux stades précoces du développement embryonnaire. Reçue le 24 mars 1986, acceptée le 21 avril 1986.

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Laboratoire de Biologie animale, Université de Bordeaux-I, avenue des Facultés, 33405 Talence Cedex.

Répartition des diamètres des sections de CGP mesurés chez les larves traitées par le Zn2+ (—) et chez les larves témoins (---).

Distributionofdiameters of PGC cross-sections in Zn2+ treated (—) and control (---) larvae.



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ENDOCRINOLOGIE. — Un gel d'affinité à haute capacité pour la purification du récepteur testiculaire de la lutropine. Note de Bahija Jallal, Roland Salesse et Jean Garnier, présentée par Étienne-Émile Baulieu.

Le récepteur testiculaire porcin de la lutropine (LH) a été solubilisé par le Triton X-100 à 1%. Après centrifugation à 100 000 x g et concentration du surnageant sur membrane Amicon PM30, le récepteur a été retenu spécifiquement sur un gel d'affinité portant de là choriogonadotropine humaine (hCG) liée par sa partie glucidique de façon covalente.

Le gel d'agarose utilisé portait des bras espaceurs d'hydrazide de l'acide adipique (longueur : 6 carbones). Après pontage covalent des sous-unités de l'hCG par le 1-éthyl-3-(diméthylamino propyl). carbodiimide, nous avons fait réagir les groupements aldéhydes formés par oxydation périodique des acides sialiques avec les groupes hydrazides du gel.

90% du récepteur contenu dans la solution mise au contact de ce gel d'affinité a pu êtré élué à pH 3,2 avec un facteur de purification de plus de 700, contre un rendement de 26% et un facteur de purification de 40 pour un gel d'affinité où l'hCG était liée par les e-amines de ses lysines.

ENDOCRINOLOGY. — A high capacity affinity gel for the purification of the testicular lutropin receptor.

The lutropin (LH) receptor from porcine testes was solubilized with 1% Triton X-100. The final solution was centrifuged at 100,000 x g and the surpernatant was concentrated on a PM30 Amicon membrane. The concentrate was then specifically retained on an affinity gel with human choriogonadotropin (hCG) covalently grafted by its sugar moiety,

The agarose affinity gel beared adipic acid hydrazide spacer arms (6 carbon length). Prior to coupling, the subunits of hCG were crosslinked with 1-ethyl-3-(diniethylamino propyl) carbodiimide and the sialic acid residues were subjected to periodate oxidation to yield aldehyde groups which could react with the hydrazides of the gel 90% of the receptor contained in the solution incubated with this gel was retained and eluted at pH 3.2 with a purification factor greater than 700, versus a 26% yield and a purification factor of 40 with an affinity gel bearing hCG linked through its lysine e-amines.

INTRODUCTION. — L'interaction de la lutropine hypophysaire (LH) et de la choriogonadotropine humaine (hCG) avec leurs cellules cibles au niveau des gonades a lieu par l'intermédiaire d'un récepteur protéique membranaire de haute affinité ([l]-[2]).

Cependant ce récepteur est présent en quantité réduite (10-20 µg par kg de tissu [3]) aussi bien dans le testicule que dans l'ovaire. Plusieurs tentatives de purification ont eu lieu, utilisant un gel de chromatographie d'affinité sur lequel l'hCG était fixée par les e-amines des résidus lysines sur une résine activée ([4]-[6]). Dans ces conditions, la purification à abouti à des rendements faibles (on peut calculer 5% d'après [5]) dus vraisemblablement à la faible capacité du gel d'affinité : en effet, les gonadotropines sont très sensibles aux modifications chimiques de leurs groupements aminés qui entraînent une diminution de leur capacité de liaison [7].

Par conséquent, nous avons développé une nouvelle technique qui permet de lier l'hCG de façon covalente à une matrice d'agarose par la partie sucre au lieu des e-amines.

MÉTHODES. — L'hCG hautement purifiée nous a été donnée par le Centre de Recherche sur la Population, NIH (U.S. A., [8]), Nous avons également utilisé comme source d'hCG partiellement purifiée le Pregnyl acheté chez Organon. La solubilisation du récepteur et les dosages ont été faits en tampon fris (Tris-HCl 10 mM pH 7,4) supplémenté selon les cas.

Nous avons utilisé 100000 cpm de [125I] hCG comme traceur pour mesurer l'activité liante à différentes étapes de la préparation du récepteur avec 200 µl de solution à éprouver. Les concentrations en Mg++ et en-.-. Ca++ ont été ajustées à 10 mM. La fixation non spécifique a été déterminée en présence d'un excès de 16 µg d'hCG (Pregnyl). Après 1 h à température ambiante (ou toute la nuit à 4°C), on a ajouté au milieu d'incubation 100 µl de sérum de veau et 400 µl de polyéthylène-glycol 6000 (PEG 6000, Merck) à 30% dans le tampon Tris. Après 10 mn à 4°C, on a ajouté 1,5 ml dé tampon Tris et on a centrifugé10 mn à 3 000 x g. Le culot a été ensuite repris par 300 µl de tampon Tris, reprécipité dans les mêmes conditions parle PEG 6000, centrifugé et compté dans un compteur gamma.

Le récepteur a été préparé comme décrit précédemment ([5]-[6]) avec de légères modifications. Nous avons utilisé des testicules de porcs de 10-20 jours. Le tissu a été broyé au" hachoir à. viande et lavé trois fois par

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Mesure de la concentration et de l'affinité du récepteur de LH solubilisé et purifié par chromatographie d'affinité sur gel d'hCG-acide adipique-agarose. Représentation de Scatchard utilisant [125I]hCG comme traceur.

Measurement of the concentration and affinity constant of the soluble LH receptor purified by affinity chromatography on the hCG-adipic acid-agarose gel Scatchard plot with [125I]hCG as tracer.

centrifugation (4°C, 20 mn, 48000 xg) dans le tampon Tris contenant 2 mM de N-éthyl maléimide et 2 mM de fluorure de phenyl sulfonyle comme inhibiteurs des protéases. La solubilisation des protéines membranaires a été accomplie dans ce tampon Tris par addition de Triton X-100 (Packard) à la concentration finale de 1 %. Après 4 h sous agitation à 4°C, la solution a été diluée 10 fois avec le tampon Tris et centrifugée à 4°C pendant 1 h à 100 000 x g. Le surnageant a été ensuite concentré à 4°C jusqu'à 2-3 ml sous pression d'azote dans une cellule Amicon équipée d'une membrane d'ultrafiltration PM 30 avant incubation avec le gel d'affinité.

Pour préparer le gel d'affinité, les sous-unités de l'hCG native (0,5 mg/ml) ont été associées de façon covalente par le l-éthyl-3-(3-diméthylamino propyl) carbodiimide (Sigma) dans l'eau distillée de pH ajusté à 4,8-5 par HC1N, à température ambiante pendant 1 h [9]. Cette préparation a été ensuite dialysée à 4°C une nuit contre 1 mM HC1 puis 8 h contre du tampon phosphate 10 mM pH 7,2. Les résidus d'acide sialique de l'hCG ont été oxydés durant 15 mn à 4°C par le périodate de sodium 0,1 M dans le tampon phosphate 10 mM pH 7,2. On a alors fait réagir les groupements aldéhydes ainsi formés avec les groupements hydrazides d'un gel d'agarose-acide adipique hydrazide (PL Biochemicals) par incubation d'une nuit à 4°C sous agitation rotative.

La biotine hydrazide (10 mg/ml, IBF) a été également utilisée pour réagir avec les groupements aldéhydes de l'hCG traitée au periodate [10]. L'hCG-biotine a été ensuite liée à l'Avidine-Ultrogel (IBF) par une incubation de 30 mn à 24°C. Le complexe hCG-biotine conservait 50-90% d'activité de liaison de l'hCG suivant la préparation.

Dans les deux cas, le gel a été lavé trois fois avec le tampon phosphate 10 mM pH 7,2 et conservé à 4°C. Les deux types de gel ont retenu environ 1 mg d'hCG par millilitre de gel.

La préparation de récepteur soluble a été incubée avec 1-2 ml de gel d'affinité sous agitation rotative à 24°C pendant 2 h. Le gel a été ensuite lavé sur filtre avec 4 ml (premier éluat) puis 6 ml (rinçage) de tampon phosphate 10 mM pH 7,2. Le récepteur a été élue par 6 ml d'acide acétique 50 mM pH 3,2 et le gel enfin lavé avec 6 ml de phosphate 10 mM pH 7,2. Ces deux dernières fractions ont été immédiatement neutralisées avec de l'ammoniaque 1 M puis mélangées.

Après concentration de cette dernière solution sous pression d'azote sur membrane PM30, l'étape de purification peut être répétée sur le même gel.

RÉSULTATS. — Le tableau compare les résultats obtenus avec les deux gels liant l'hCG par les sucres et un gel liant l'hCG par les e-amines des lysines. Ce dernier gel a été préparé après couplage de l'hCG à un gel Aca-22 (IBF) activé par le glutaraldéhyde [10]. La liaison et l'élution du récepteur ont été faites de la même façon que pour les autres gels. On a dosé les protéines par la méthode à l'o-phtaldialdéhyde [11].


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TABLEAU

Comparaison des rendements et des facteurs de purification du récepteur testiculaire porcin de LH selon le gel d'affinité.

Après solubilisation, centrifugation à 100000xg et concentration, 2 ml de solution du récepteur ont été incubés avec 1 ml de chaque gel. Les gels ont été ensuite déposés sur filtre et élués dans les mêmes conditions.

Le tableau montre la répartition des protéines et de l'activité liante pour [125I] hCG (en % du récepteur total) dans les différentes fractions recueillies, ainsi que le rendement et le facteur de purification obtenus sur les différents gels; Comparison of the yields and purification factors obtained for the porcine testicular LH receptor through the use of different affinity gels.

The receptor was solubilizedand centrifuged at 100,000 xg and the surpernatant concentrated to 2 ml before incubation with 1 ml of each gel. After that, the gels were deposited on filters and eluted each in the same conditions.

The table shows the [125I]hCG binding activity (% of total receptor content) and the protein concentration in the four different fractions collected, together with the total yield and purification factor for the three gels.

hCG-biotine- hCG-acide. hCG-glutaraldéhydeavidine-Ultrogel

hCG-glutaraldéhydeavidine-Ultrogel Aca 22

Elution % de % de % de

et récepteur récepteur récepteur

volume dans protéines dans protéines, dans protéines

(ml) l'éluat (mg/ml) l'éluat (mg/ml) : l'éluat (mg/ml).

I : Premier éluat (6ml). . . ., ,.... 1% 250 10% 180 49% 190

II: Rinçage phosphate (6ml)... . 0,4% 84 0,1% 144 25% 98

III : acide acétique (6 ml). ...... . 32% 2,1 14% 0,3 7% 1,8

IV : dernier rinçage (6 ml)... .. 66% 0,1 76% 0,1 19% 0,1

Rendement final ds III+IV. . .;. ............. . . 98% 90% 26%

Facteur de purif. ds III +IV.. ........ . . 118 729 40

Le rendement en récepteur après l'élution acide atteint 90% pour les gels fixant l'hCG par sa partie sucre, mais seulement 26% dans le cas du gel fixant l'hCG par les e-amines. Bien que le gel d'hCG-biotine donne le meilleur rendement, le facteur de purification reste assez faible. Ceci est dû vraisemblablement à une dissociation du complexe hCG-biotine de l'Ultrbgel-Avidine durant l'élution acide comme l'indique la quantité élevée de protéines dans l'éluat III.

Nous avons mesuré les caractéristiques hydrodynamiques et de liaison du récepteur purifié sur le gel hCG-agarose acide adipique. Le rayon de Stockes (6,24+0,4 nm) a été déterminé à l'aide d'une colonne (1x90 cm) d'Ultrogel Aca 34 (IBF) en phosphate 0,1 M pH 7,2 [12]. Le coefficient de sédimentation (S20, w=5,1+0,2) a été mesuré par ultracentrifugation analytique dans un gradient de saccharose 5-20% dans le même tampon phosphate [13]. Après pontage covalent par le glutaraldéhyde 5 % (incubation 1 h), le complexe [125I]hCG-récepteur a été analysé par électrophorèse en milieu SDS dénaturant : on a trouvé un poids moléculaire de 140 000 ±15 000, soit environ 1000000 daltons pour le récepteur. La constante dé dissociation mesurée avec [125I]hCG (fig. 1) ou avec [125I]pLH a été de 0,13+0,02 nM.

CONCLUSION. — Cette technique de préparation permet donc une purification rapide du récepteur gonadique de LH avec un rendement et un facteur de purification élevés. La préparation du gel est simple. L'utilisation de l'hCG au lieu de la LH pour le gel d'affinité se justifie par la stabilité de l'hCG lors de l'oxydation périodique, alors que ce traitement fait perdre à la LH une grande partie de son activité. Le récepteur purifié conserve une affinité élevée pour les deux hormones, identique à celle observée sur homogénat testiculaire [14]. Les mesures des paramètres moléculaires aussi bien sur gel d'électrophorèse que sur colonne de tamis moléculaire ou en ultracentrifugation analytique


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ont donné des résultats en accord avec ceux précédemment publiés [6] et laissent supposer que le récepteur de LH est constitué d'une chaîne polypeptidique de poids moléculaire environ 100000.

Ce travail a été soutenu en partie par la Fondation pour la Recherche médicale. Reçue le 14 avril 1986, acceptée le 12 mai 1986.

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NEUROBIOLOGIE. — Conditions d'utilisation d'anticorps spécifiques pour la visualisation immunohistochimique de la sérotonine et de la mélatonine dans la glande pinéale du mouton. Note de Yves Tillet, Jean-Paul Ravaolt, Claude S.elve, Geneviève Evin, Bertrand Castro et Maurice P. Dubois, présentée par Michel Jouvet.

Après avoir obtenu des anticorps dirigés contre la sérotonine et la mélatonine, les auteurs montrent sur un matériel de choix, la glande pinéale (qui contient ces deux indolamines), que les conditions de leur utilisation en immunohistochimie sont différentes. En effet, l'antisérum dirigé contre la 5 HT reconnaît la molécule qui résulte de la condensation du formol sur la 5HT, et ne sera donc utilisable que pour révéler la 5HT sur du tissu fixé au formol. Au contraire, dans le cas de l'antisérum dirigé contre la mélatonine, l'indolamine «native» est reconnue, et l'immunohistochimie donne donc des résultats positifs sur du tissu frais.

NEUROBIOLOGY. — Irnmunohistochemical visualization of serotonin and melatonin in the sheep pineal gland using specifie antibodies.

Having prepared antisera to serotonin and to melatonin, the authors were able to show that, in the pineal gland, the behaviour of these two antisera in immunohistochemical studies differs. The antiserum ràised against 5HT, actually bound to the molecule formed by condensation of formaldehyde on 5HT and therefore could be used to reveal 5HT in tissue fixed with formaldehyde. On the other hand, the anti-melatonin antiserum bound to melatonin, and could therefore be used to reveal its presence in fresh tissue.

Abréviations. — NAS: N acétyl-sérotonine; SAB : Sérum albumine bovine; SAH: Sérum albumine humaine; SLN : sérum de lapin normal.

Un consensus s'est établi sur les conditions nécessaires à la démonstration de la sérotonine (5HT) au sein du tissu fixé par le formol (coupé en congélation où inclus en paraffine ou résine): a, l'intégrité du -OH en C5, nécessaire à l'immobilisation de 5HT au sein du tissu fixé, b, la cyclisation de la chaîne latérale de l'amine en présence de formol, aboutissant à une 6-OH terra. 1, 2, 3, 4 hydrobétacarboline (TH (3C). Celle-ci est stable et bien reconnue par les Ac. correspondants, présents dans les sérums obtenus à partir d'immunogènes associant la 5HT à une protéine porteuse en présence de formol ([1] à [7]).

L'existence d'un O-CH3 en C5 sur la Mélatonine (Mel.) s'oppose à son immobilisation au sein des tissus fixés par le formol: tous les résultats immunocytochimiques de la littérature sur sa mise en évidence ont été obtenus sur tissu frais, congelé et coupé au cryostat. Dans ces conditions, le méthoxy (C5) et l'acétylation de l'amine terminale, constituent des déterminants antigéniques nécessaires à la spécificité de la réaction immunocytochimique.

Selon les équipes, les immunogènes utilisés dans l'obtention de sérums destinés à l'immunocytochimie de la Mel. sont divers: NAS/Formol/SAB ([6], [8], [9], [10]), 5 HT/Formol/SAB (9), N-succinyl 5-méthoxy tryptamine/SAB ([11], [12], [13]), 5-méthoxy N-acétyl tryptophane/carbodiimide/SAB ([14], [15], [16]), Mel/Formol/SAB ([17], [18], [19]), Mel-diazo para-aminobenzoïc acid/carbodiimide/SAB ([20], [21]), Mel.-N p-carboxybenzyly/carbodiimide/SAB ([22], [23]), N-l (amino-3) propyl-Mel/glutaraldéhyde/SAH [24].

Nous avons utilisé les sérums déjà mis; à profit dans la mise en évidence de la Mel.

[24] et les avons appliqués, conjointement avec l'anti-5HT, à l'épiphyse du mouton.

MATÉRIEL ET MÉTHODES. — 1. L'anti sérotonine (anti 5HT). — La 5HT est couplée à la BSA par le formol selon la méthode de Grota et Brown [6] [rendement molaire (5HT/SAB) : 70]. L'immunisation des lapins est effectuée par injections intradermiques répétées de l'immunogène en solution émulsifiée par l'adjuvant complet de Freund. Les caractéristiques des anticorps dans les sérums obtenus ont été étudiées en microfixation du complément [25] (fig. 1) et par test ELISA, utilisant comme antigène la 5HT couplée avec l'ovalbumine (5HT-OV.). Dans les conditions de l'expérience, le point 50 % de la courbe de titrage de l'antisérum correspond à une dilution de 1/50000 (fig. 2). En titrage d'Ag., en présence du sérum dilué à 1/16000 (80 % de liaison avec l'Ag. de référence 5HT-ov.), les compétitions entre la 5HT-ov, la 5HT non couplée, les analogues éprouvés de la 5HT, d'une part, et, de l'autre, l'Ag. adsorbé sur les tubes,. Sont exprimées sur les figures 3, 4, 5. Maximum pour la 5HT-OV., cette compétition s'exprime par des droites de titrage dont la;pente est de 50 à

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70 % inférieure à celle de la droite de référence (5HT-ov.) pour les 5HT non couplées, les dérivés de la tryptamine substituée en C5 et le dérivé soluble de la Mel. (fig. 4, 5); pour ces dérivés, l'intersection des droites de titrage avec le point 50 % correspond à des concentrations 103 à 105 supérieures à celle de la 5HT-ov. La compétition est nulle dans les conditions et les limites de l'expérience pour les dérivés du tryptophane, les dérivés alcooliques (famille du tryptophpl) et acides (famille de l'acide indol acétique) de la tryptamine (fig. 5).

2. L'anti mélatonine (anti-Mel). — La Mel., peu hydrosoluble et dépourvue de -NH2 terminale a été transformée en un dérivé soluble comportant une chaîne latérale accessoire terminée par une amine primaire [26] elle-même couplée à la SAH par le glutaraldéhyde et l'immunisation à partir de cet immunogène réalisée sur lapin dans les mêmes conditions que précédemment. Les sérums obtenus ont été étudiées en essai radioimmunologique utilisant la 3H-Mel. comme «traceur»: (a) 90 % de 3H-Mel. sont liés en excès d'Ac, (b) en titrage d'Ag, 2 pg sont détectés. Seules la 6-OH Mel. et la NAS font compétition significativement avec la 3H-Mel (respectivement aux taux de 2 et 1,5 % par rapport à la Mel. «froide») (fig. 6, 7, 8).

3. Préparation des tissus. — Les épiphyses et le noyau du raphé dorsal de mouton adulte sont utilisées : (a) soit à l'état frais, non fixées, congelées et coupées au cryostat, (b) Soit prélevées sur des têtes perfusées par voie intracarotidienne avec le paraformaldéhyde (4 % en tampon phosphate 0.1 M pH 7.4); post fixées dans le même fixateur, elles sont incluses en paraffine, ou préparées pour l'obtention de coupes en congélation (coupes flottantes) selon une technique précédemment décrite [27].

4. Réactions immunocytochimiques. — Elles sont effectuées en immunofluorescence indirecte sur les 3 catégories de coupes avec chacun des antisérums, anti-5HT et anti-Mel., en incubation courte (tissu frais) ou longue (tissu fixé), les dilutions étant fonction de la durée d'incubation en présence des antisérums.

EXPLICATIONS DES PLANCHES

Planche I

Fig. 1. — % fixation du complément par l'anti 5HT-SAB en présence: (a) de 5HT-ov., (b) d'ovalbumine seule. Fig. 1. — % complement fixation by anti 5HT-BSA in the presence of: (a) 5HT-ov., (b) ovalbumin only. Fig. 2. - Test ELISA: % liaison 5HT-ov. (phase solide), anti 5HT-SAB (50 % : dilution 1/50000). Fig. 2. - ELISA test: % binding 5HT-ov. (solid phase)!anti 5HT-BSA (50%: dilution 1/50,000).

Fig. 3. - Test ELISA: % d'inhibition par la 5HT-ov. de la liaison [5HT-ov. (phase solide)-anti 5HT-SAB (1/16000)] (50 % correspond à 6:4 ng de 5HT-ov., en ng d'ovalbumine; rapport molaire 5HT/ov. = 70).

Fig. 3. - Test ELISA: inhibition of the binding of 5HT-ov. to anti-5HT-BSA (diluted 1/16,000) by 5HT-ov. (solid phase) (50% inhibition is obtained with 6.4 ng of 5HT-ov., in ng of ovalbumine; molar ratio 5HT/ov. = 70).

Fig. 4. - Test ELISA: Inhibition de la liaison (5HT-ov.-anti 5HT-SAB) par la 5HT créatinine sulfate (I), la

5HT hydrochlorure (2), la 5HT oxalate (3). R: courbe de référence (cf. fig. 3). Fig. 4. - Test ELISA: Inhibition of the binding of 5HT-ov. to anti 5HT-BSA by 5HT creatinin sulfate (1), 5HT

hydrochloride (2), 5HT oxalate (3). R: Référence curve (as for Figure 3).

Fig. 5. - Test ELISA: Inhibition de la liaison (5HT-ov. anti- 5HT-SAB) par les analogues de la 5HT. (4): tryptamine; (5): 5-méthyltryptamine; (6): 5-méthoxy tryptamine; (7): mélatonine (dérivé hydro-soluble); (8): N-acétyl sérotonine; (9): tryptophane; (10): 5-hydroxy tryptophane; (11): 5-méthoxy tryptophane; (12): acide indolacétique; (13): acide 5-hydroxy indolacétique; (14): acide 5-méthoxy indolacétique; (15): tryptophol; (16): 5-hydroxy tryptophol; (17): 5-méthoxy tryptophol; (18): 6-hydroxy mélatonine; (19): phényl alanine. R: courbe de référence (cf. fig. 3).

Fig. 5. - Test ELISA: Inhibition of the binding of 5HT-OV. to anti-5HT-BSA by 5HT analogous. (4): tryptamine; (5): 5-methyl- tryptamine; (6): 5-methoxy tryptamine; (7): melatonin (hydro-soluble derivative); (8): N-acetyl sérotonin; (9): tryptophan; (10): 5-hydroxy tryptophan; (11): 5-methoxy tryptophan; (12): indol acetic acid; (13): 5-hydroxy indol acetic acid; (14): 5-methoxy indol acetic acid; (15): tryptophol; (16): 5-hydroxy tryptophol; (17): 5-methoxy tryptophol; (18): 6-hydroxy melatonin; (19): phenyl alanine. R: Référence curve (as for Fig. 3).

Fig. 6. - Test radioimmunologique: % liaison (3H-Mel.-anti-Mel.) (50% : dilution 1/20000). Fig. 6. - Radioimmunoassay: % binding (3H-Mel-anti-Mel.) (50%: dilution 1/20,000).

Fig. 7. — Test radioimmunologique: % d'inhibition par la Mel. de la liaison [3H-Mel.-ariti-Mel. (1/18000)]

(50 % correspond à 50 pg de Mel.). Fig. 7. — Radioimmunoassay: inhibition of the binding of 3H-Mel. to anti-Mel (diluted 1/18,000) by melatonin

(50% inhibition is obtained with 50 pg of Mel).

Fig. 8. — Test radioimmunologique: inhibition de la liaison (3H-Mel.-anti-Mel.) par les analogues de la Mel.

(identiques à ceux utilisés pour la 5HT, figures 4 et 5). Fig, 8. — Radioimmunoassay inhibition of the binding of 3H-Mel. to anti-Mel, by Mel analogous (identical with

those used for 5HT investigations, figures 4 and 5).


PLANCHE I/PLATE t

YVES TILLET


PLANCHE II/PLATE II


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81.

Planche II

Fig, 9. — Immunpcytochimie : Spécificité de l'anticorps anti-5HT sur la glande pinéale (9 a—c) et sur le noyau; du Raphé dorsal (9d) du mouton, fixés par le paraformaldéhyde. 9a: Anti-5HT seul. 9b: Anti-5HT + 5HT

ov. (identique à THBC) équivalent à 10- 7 M de 5HT. 9c: Anti-5HT + Mel. (dérivé hydrosoluble) 10-7M.

9d: Anti-5HT+NAS 10-7M (9, a-c: Gx500; 9d: Gx780). Fig. 9. — 5HT immunocytochemical staining on sheep pineal gland (9, a—c) and nucleus Raphe dorsalis (9d)

fixed using paraformaldehyde. 9a: Ant-5HT alone. 9b: Anti-5HT+5HT-ov. (idem to THBC) équivalent to

10-7 M of 5HT. 9c: Anti-5HT+Mel. (hydrosoluble derivative) 10- 7 M. 9d: Anti-5HT+NAS 10- 7 M (9, a-c. M x 500; 9d: Mx780).

Fig. 10. — Immunocytochimîe : spécificité de l'anticorps anti-Mel. sur la glande pinéale de mouton non fixée;

coupée au cryostat (10, a-d: Gx780). 10a: Anti-Mel. seul 10b: Anti-Mel+Mel (dérivé soluble) 10- 1 M.

10c: Anti-Mel. + 5HT 10- 7 M. 10d. Anti-Mel.+N acétyl sérotonine 10- 1 M. 10 d: Anti-Mel+NAS 10- 7 M. Fig. 10. —Melatonin immunocytochemical staining on sheep pineal gland unfixed and cut using cryostat

(10, a-d, Mx780). 10a: Anti-Mel. alone. 10b: Anti-Mel+Mel. (hydrosoluble derivative) 10-7M. 10c:

Anti-Mel.+5HT 10- 1 M. 10d: Anti-Mel.+NAS 10- 1 M.

En plus des contrôles habituels, chacun des antisérums est éprouvé après préincubation en présence de 5HT, de 5HT-ov., de NAS ou de Mel, (dérivé soluble) comparativement avec l'utilisation de l'antisérum seul.

RÉSULTATS. — 1. Anti 5HT. — (a) Sur coupes de tissu frais: L'image obtenue sur l'ensemble de la coupé est constamment négative.

(b) Sur coupes de tissu fixé l'abondance des cellules immunoréactives contraste avec la rareté des fibres 5HT (+).. La réaction est totalement inhibée par la 6 OH-TH P C (sous la forme de 5HT-ov.), incomplètement par la 5HT non couplée malgré des concentrations accrues de 103 à 104. Ni la NAS, ni la Mel. (dérivé soluble) ne sont inhibitrices (fig. 9 a-d).

2. Anti Mel. — (a) Sur coupes de. tissu frais, de nombreuses cellules immunoréactives apparaissent régulièrement dispersées dans le parenchyme. La réaction est totalement inhibée par le dérivé soluble de la Mel. mais non par la 5HT ni la NAS(fig. 10a—d). (b) Sur coupes de tissu fixé aucune réaction n'est détectable.

DISCUSSION. — 1. L'immunocytochimie de la 5HT et de la Mel. au sein de la pinéale pose le difficile problème de l'identification immunocytochimique d'haptènes de structure très voisine. Les tests que nous avons effectués montrent que les antisérums obtenus, reconnaissent bien leur immunogène respectif, que les analogues de la 5HT et de la Mel. étudiés font peu ou ne font pas de compétition avec ces aminés, couplées à un « carrier ».

2. Le couplage joue peu sur les propriétés de l'anti-Mel., étudié dans un essai radioimmunologique en présence de 3H-Mel. Mais il est essentiel pour ce qui a trait à la 5HT,

et nos résultats sont en accord avec les données citées plus haut ([1], [2], [3]): les tests ELISA réalisés montrent que : (a) les anti 5HT utilisés ont le maximum d'affinité (pente maximale, concentration inhibitrice efficace minimale : cf. fig. 2, 3) pour la 6 OH-TH (3 C, résultant du couplage par le formol de la 5HT à une protéine, (b) que la 5HT non couplée ne fait compétition avec la 6 QH-TH PC au taux de 50 % que pour des rapports molaires (5HT/6 OHTH pC) de l'ordre de 103 à 104.

Cette spécificité se retrouve sur les coupes de tissu fixé par le formol : ne réagit en présence de l'anti-5HT que la 5HT transformée en 6 OH-TH pC et immobilisée au sein des tissus par le fixateur. Contrairement à la 5HT, aucun des analogues ne satisfait à cette doublé exigence qui implique: (a) l'immobilisation au sein du tissu fixé de l'amine (dérivé ou analogue) qui ne se fait bien que par l'-OH intact en C5, ce qui exclut la Mel., (b) la cyclisation sous l'effet du formol de la chaîne latérale, exigeant l'intégrité de cette partie de la molécule, notamment le —NH2 terminal, ce qui exclut NAS et Mel.

3. Inversement, la spécificité de l'anti-Mel. utilisé ici est liée à l'intégrité de la Mel. au sein de l'immunogène préparé (N—1 amino 3-propyl Mel./gluta/SAH) et dans lequel une


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chaîne latérale accessoire, greffée sur le NH du noyau indole de la Mel. porte une aminé primaire terminale couplée avec un «carrier». Cette transformation qui accroît l'hydrosolubilité de la Mel. ne modifie pas son immunoréactivité, conservant intact le — OCH3 en C5 et l'acétylation de l'aminé terminale. C'est ce que montrent: (a) la liaison de la 3H-Mel. et de l'anti Mel., (b) la compétition faible ou nulle des analogues éprouvés dans cette liaison, (c) l'inhibition par le dérivé soluble de la Mel., à l'exclusion de tout autre analogue (dont la 5HT et la NAS), de la réaction immunocytochimique observée en présence d'anti Mel. sur coupes de pinéale non fixée coupée au cryostat.

4. Parmi les résultats de la littérature, seuls les antigènes dans lesquels le — OCH3 en C5 et la chaîne latérale acétylée sont conservés ([20], [22]) ont permis l'obtention d'antiMel. dont le comportement ait été similaire à ce que nous avons obtenu avec les nôtres [24].

Sur le plan immunocytochimique, l'inventaire des travaux publiés montre l'absence trop fréquente des tests d'inhibition mettant en jeu, au minimum, la 5HT, la 6 OH-TH p C, la NAS et la Mel., comme nous l'avons fait pour discriminer, en cas d'images positives, la reconnaissance de l'une ou l'autre de ces molécules par l'antisérum utilisé. Reçue le 20 janvier 1986, acceptée le 7 avril 1986.

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Y. T., J.-P. R. et M. P. D. : I.N.R.A., Station de Physiologie de la Reproduction,

Centre de Recherches de Tours, 37380 Monnaie;

C. S., G. E. et B. C. : Centre pharmacologique et endocrinologique,

rue de la Cardonille, B.P. n° 5055, 34033 Montpellier.


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PATHOLOGIE ANIMALE. — Toxicité relative de la destruxine E pour le Lépidoptère Galleria mellonella L. Note de Jacques Fargues, Pierre-Henri Robert,; Alain Vey et Mary Païs, présentée par Constantin Vago.

L'activité toxique de la destruxine E pour les larves de Galleria mellonella L. est comparée à celle des destruxines A et B. Les essais par immersion ou par application topique confirment l'absence de toxicité des destruxines par contact. Administrées par injection ou par ingestion forcée, les destruxines A, B et E sont toxiques. Dans les deux cas, l'analyse des doses létales 50% montre que la toxicité de la destruxine E est aussi élevée que celle de la destruxine A et très supérieure à celle de la destruxine B. Enfin, on note que per os les destruxines E et A restent toxiques.

ANIMAL PATHOLOGY. — Relative toxicity of destruxin E to Galleria mellonella larvae.

This study was conducted in orderto evaluate the relative toxicity of the recently isolated destruxin E (DE) in comparison to the activities of destruxin A (DA) and destruxin B (DB). Purified products were administrated to 7 th-instar larvae of G. mellonella in using four procedures: intrahaemocoelic injection, immersion and forced ingestion of aqueous suspensions and topical application of methanolic solutions..

Investigations carried out by topical application (at 100 µg/g concentration) and by immersion (for 1 min, in 100 p.p.m. suspension) did not show any toxic action (paralysis or mortality). of these destruxins as contact poisons. On the other hand, the susceptibiliiy of larvae to injected destruxins (at 100 µg/g) varied with the chemical nature of these mycotoxins. Interestingly, DE was as toxic as DA and more toxic than DB. Forced ingestion tests (at 100 µg/g) allowed us to demonstrate that the respective effects of DE and DA, administered per os, were similar to those observed in injection tests.

Dose-mortality experiments were carried out by injection and by forced ingestion in testing ranges of doses of crystallized destruxins either from 25 to 100 µg/g (for DE and DA) or from 50 to. 400 µg/g (for DB). The LD 50 of injected DE (49.3 µg/g was about the same as that of DA (49.9 µg/g) while that of DB was greater (about 130 µg/g). When tested by forced ingestion, DE and DA showed a high toxicity (32.8 and 34.6 µg/g, respectivelly) while DB was less active (about 181 µg/g).

These results demonstrated the high toxicity of destruxin E by ingestion as well as by intrahaemocoelic injection..

L'hyphomycète entomopathogènè Metarhizium anisopliae (Metsch.) Sor. produit des cyclodepsipeptides, les destruxines, dont la toxicité pour les insectes est connue depuis les; premiers travaux de Kodaira [1] et de Roberts [2]. Paradoxalement, les essais réalisés avec des composés purifiés sont peu nombreux et, dans la plupart des cas, le mode de traitement des insectes est l'injection intracoelomique [3]. C'est pourquoi nous avons comparé l'activité de la destruxine E, récemment isolée et purifiée par Païs et coll. [4], avec celle des destruxines A et B appliquées sur les larves de Galleria mellonella L. soit par immersion, soit par application topique, soit par injection ou par ingestion.

MATÉRIEL ET MÉTHODES. — La destruxine A (C29H47N5O7. C6H6), la destruxine B (C30H51N5O7,) et la destruxine E (C29H47N5O8) diffèrent dans leurs structures par la nature de l'acide a-hydroxylé, qui présente : soit une double liaison entre les carbones y, 5(DA), soit un groupement méthyle en y (DB), soit un cycle époxyde en y, 8 (DE) [4].

Les essais de toxicité de ces produits purs, sous forme cristallisée, ont été conduits sur des larves du 7e stade suivant quatre modes d'administration ; par injection intracoelomique dans le planta gauche de la seconde paire de fausses pattes, par ingestion forcée dans l'oesophage à l'aide d'une aiguillé à extrémité rodée, par immersion pendant 1 mn des insectes maintenus dans un sac de mousseline et par application topique de gouttelettes sur le tergite du second segment thoracique. Dans ce dernier type d'essai, les destruxines ont été dissoutes dans du méthanol, alors que dans les trois autres, elles ont été diluées dans de l'eau distillée stérile. Par ailleurs, les volumes injectés, ingérés ou déposés ont été ajustés au poids de chaque larve, soit entre 5 et 7 µl.

Au cours d'une première série expérimentale les chenilles ont été traitées avec une dose unique de 100 ppm de produit pur (essais par immersion) ou de 100 µg de toxine cristallisée par gramme de poids frais d'insecte (trois autres variantes).

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TABLEAU I

Sensibilité des larves du 7e stade de Galleria mellonella aux destruxines A, B et E administrées par injection intracoelomique,

par ingestion forcée, par immersion et par application topique : mortalités relevées le 4e jour des essais.

Relative toxicity of destruxins A, B and E to 7 th-instar larvae of Galleria mellonella by intrahaemocelic injection,

by forced ingestion, by immersion of by topical application: mortality response, after 4 days.

Mortalité après 4 jours (y) Mode de traitement (x) Concentration DA DB DE

Injection intracoelomique (a) 100 µg/g 72,1±12,5 (91%) 36,0 + 8,0 (35%) 76,1± 9,3(94%)

Ingestion forcée (b) 100 µg/g 84,4± 7,4 (99%) 38,2±6,9 (38%) 76,9 + 10,1(95%)

Immersion (c) 100 ppm 0 0 0

Application topique (d) 100 µg/g 3,2±6,5 (1,3%) 0 0

(x) Mode d'application des destruxines pures à l'état de cristaux éprouvées en suspensions aqueuses [(a), (b), (c)] ou en solution méthanolique

(d).

(y) Mortalité au bout de 4 jours. Quatre répétitions des essais réalisés à raison de 20 larves par lot. x + S.D. moyenne des mortalités

exprimées en valeur angulaire; mortalité dans les lots témoins inférieure à 5 %; analyse de variance à deux voies : effet « toxines »

(a) F = 8,73 significatif à 1%, (b) F = 37,76 significatif à 1 °/00.

(x) Administration procedure of pure crystallized destruxins tested as aqueous suspension [(a), (b), (c)] or as methanolic solutions (d).

(y) Mortality response after 4 days. Four replicated experiments of 20 7 th-instar larvae per replicate per treatment variant. x + S.D., mean of angular transformed mortality data (%); check lots, less than 5% mortality; two way analysis of variance yields: toxin effect (a) F=8.73 significant at 0,01, (b) F= 37.76 significant at 0,001.

TABLEAU II

Sensibilité des larves du 7e stade de Galleria mellonella aux destruxines A, B et E administrées par 1 ingestion

forcée : relations dose-mortalité [(x), (y)] établies à partir des taux de mortalité relevés le 4e jour des essais.

Relative toxicity of destruxins A, B and E E to 7 th-instar larvae of Galleria mellonella by forced ingestion:

dose-mortality response [(x), (y)] after 4 days.

Doses létales 50 et 90% (µg/g)

Equations Intervalle Intervalle

Destruxines de régression DL 50 de confiance DL 90 de confiance

DA (a). y=3,35x-0,16 34,6 29,8-40,2 83,5 65,3-107,0

DB (b) y (b) (181) (752)

DE (c) 7 = 2,64 x + 1,00 32,8 27,7-38,8 100,3 75,6-133,1

(x) Quatre répétitions des essais réalisés à raison de 20 chenilles par lot.

(y) Analyses de régression de la mortalité probit en fonction du logarithme de la dose (mortalité dans les lots témoins inférieure à 5%). (a), (c) tests de linéarité avec x2 non significatif : DL 50 et DL 90 calculées avec leurs intervalles de confiance à 95 %; (b) Test de linéarité avec x2 significatif : DL 50 et DL 90 estimées graphiquement.

(x) Four replicated experiments of 20 7th-instar larvae per replicate per treatment variant.

(y) Regression analysis of probit mortality and log dose (check lots, less than 5% mortality). (a), (c) x2 test of lineratity non significant; calculated LD 50 and LD 90 values with their respective 95% confidence limits; (b) x2 test of linearity significant; graphically estimated LD 50 and LD 90 values.

Dans la seconde série expérimentale les destruxines ont été éprouvées par injection intracoelomique et par ingestion forcée d'une gamme de doses croissantes de 25 à 100 µg/g (pour les composés DA et DE) ou de 50 à 40 µg/g (pour le composé DB).

Les chenilles ont été observées pendant les 3 h qui ont suivi leur traitement afin de noter l'apparition de la paralysie tétanique, symptôme caractéristique utilisé par Roberts [2] comme critère de détection des destruxines non purifiées dans des essais réalisés par injection. Ensuite, les insectes ont été mis en élevage à 25° + 1°C, les contrôles quotidiens de mortalité étant assurés jusqu'à la mue imaginale.


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TABLEAU III Sensibilité des larves du 7e stade de Galleria mellonella aux destruxines A, B et E administrées par injection

intracoelomique : relations dose-mortalité [(x), (y)] établies à partir des taux de mortalité relevés le 4e jour

des essais.

Relative toxicity of destruxins A, B and E to 7 th-instar larvae of Galleria mellonella by intrahaemocelic injection :

dose-mortality response [(x), (y)] after 4 days.

Doses létales 50 et 90 % (µg/g)

Équation Intervalle Intervalle

Destruxines de régression DL 50 de confiance DL 90 de confiance

DA (a).. y=3,27x-0,56 49,9 41,8-59,5 129,9 101,8-148,3

DB (b) .............. y (b) (130) (240)

DE (c). .................. y=2,89 x + 0,10 49,3 35,3-47,6 84,1 73,4-96,6

(x) Quatre répétitions des essais réalisés à raison de 20 chenilles par lot.

(y) Analyses de régression de la mortalité probit en fonction du logarithme de la dosé (mortalité dans les lots témoins inférieure à 5%). (a), (c) tests de linéarité avec x2 non significatif : DL 50 et DL 90 calculées avec leurs intervalles de confiance à 95 %; (b) test de linéarité avec x2 significatif: DL 50 et DL 90 estimées graphiquement. (x) Four replicated experiments of 20 7 th-instar larvae per replicate per treatment variant.

(y) Regression analysis of probit mortality and log dose (check lots, less than 5% mortality). (a), (c) x2 test of linerity non significant; calculated LD 50 and LD 90 values with their respective 95% confidence limits; (b) x2 test of linearity significant; graphically estimated LD 50 and LD 90 values.

RÉSULTATS ET DISCUSSION. — Administrées par application topique (100 µg/g) ou par immersion (100 ppm), les trois destruxines éprouvées ne provoquent ni la paralysie, ni la mort des chenilles de G. mellonella (tableau I), ce qui confirme les observations originales de Kodaira [1] sur l'absence de toxicité par contact des destruxines sur le ver à soie, Bombyx mori L.

En revanche, par injection mtrahémocoelique (100 µg/g) ou par ingestion forcée (100 µg/g) on constate dans tous les cas une paralysie tétanique immédiate des insectes. Ce symptôme peut être réversible et les résultats indiquent que l'effet létal consécutif a l'intoxication varie suivant la nature chimique du composé éprouvé, il est significativement plus élevé avec les destruxines E et A qu'avec la destruxine B (tableau I).

L'analyse des doses létales caractéristiques montre que les destruxines E et A sont sensiblement plus actives lorsqu'elles sont introduites per os (DL 50 de 32,8 µg/g et de 34,6 µg/g respectivement) (tableau II), que lorsqu'elles sont injectées dans l'hémolymphe (DL 50 de 49,3 µg/g et de 49,9 µg/g) (tableau III).

Les données concernant la destruxine B (DL 50 de 181 µg/g par ingestion forcée et de 130 µg/g par injection) (tableaux II et III) sont approximatives, car la mauvaise dissolution dans l'eau du produit pur, cristallisé, à partir de 200 ppm n'a pas permis d'obtenir une relation linéaire entre le logarithme de la dose et la mortalité-probit.

Ces résultats précisent les observations de Roberts [3] sur la sensibilité des chenilles de G, mellonella aux destruxines A et B administrées par injection. Par ailleurs, ils démontrent la toxicité per os des destruxines, en soulignant les potentialités insecticides du composé récemment isolé, la destruxine E.

Le Dr D. W. Roberts du Boyce Thompson Institute (New York) a fourni la souche de Metarhizium anisopliae à partir de laquelle Mlle Païs et M. Escaut de l'Institut de Chimie des Substances naturelles du C.N.R.S. ont extrait et purifié les destruxines A, B et E utilisées dans ces expériences.

Reçue le 28 avril 1986.


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RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES

[1] Y. KODAIRA, J. Facult. Text. Sci. Technol, Sinshu Univ., Sericult., 5, 1961, p. 1-68. [2] D. W. ROBERTS, J. Invertebr. Pathol, 8, 1966, p. 212-221.

[3] D. W. ROBERTS, in Microbial control of pests and plant diseases 1970-1980, H. D. BURGES éd., Academie Press, New York, 1981, 949 p. [4] M. PAÏS, B. C. DAS et P. FERRON, Phytochemistry, 20, 1981, p. 715-723.

J. F. et P.-H. R. : I.N.R.A., Station de Recherches de Lutte biologique,

La Minière, 78280 Guyancourt; A. V. : I.N.R.A.-C.N.R.S., Station de Recherches de Pathologie comparée,

30380 Saint Christol; M. P. C.N.R.S., Institut de Chimie des Substances naturelles,

91190 Gif-sur-Yvette.


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MORPHOLOGIE VÉGÉTALE. — Anemopsis californica (Saururaceae) : interprétation de la fleur. Note de Jean-François Leroy, +présentée par Paul Ozenda.

Le modèle théorique dans la famille est à base de 2-mérie (cyclisation de 2 phyllomes alternes) et donc de 4-mérie (fusion de deux cycles). La 3-mérie est atteinte par le moyen de phénomènes d'avortement congénital, auxquels s'ajoute un autre phénomène, chez Anemopsis, où les microsporophylles apparaissent comme des phyllomes théoriques, composés de sous-unités autonomes (cas aussi chez Saururus, et peut-être, chez Gymnotheca). Un diagramme floral nouveau est donné pour Houttuynia et pour Anemopsis.

PLANT MORPHOLOGY. — Anemopsis californica (Saururaceae) : interpretation of the flower.

Flowers of Saururaceae are naked (there is neither a calyx, nor a corolla), <$ and distributed in either a terminal spike or raceme. They show several other salient or extraordinary features, which also have a special theoretical ihterest. In Anemopsis californica we have particularly to account for 3-merous flowers, stamens by pairs, pairs opposite the carpels, posterior position of one of the three carpels. Here is the theoretical model we propose to explain this floral organization: there are 4 altemate cycles, each of them being theoretically 2-merous. The outer cycle is transverse, with 2 stamen pairs. The second one consists of 2 pairs in the median plane. its stamen pairs are altemate with the precedent one and with the two following carpels. The floral organogenesis ends with a cycle of 2 median carpels. In fact, each anterior part of the cycles, near the bract, fails to be initiated. The second and fourth cycles are reduced to only one posterior stamen pair and one posterior carpel. So a 3-merous flower, with the stamen pairs opposite the carpels, is produced. Each stamen pair is considered here as representing a compound theoretical phyllome with 2 autonomous subunits. The bilateral floral symmetry, in Anemopsis, is to be explained in the light of congenital missing phenomena (the bilateral symmetry in Saururus is to be explained by another way). Eichler's diagrams are rejected. New diagrams for Anemopsis and Houttuynia are proposed.

De façon générale, les Saururacées (Pipérales) sont considérées comme une famille archaïque relativement à tout un ensemble de caractères (présence de perforations indifférenciées, parfois multiples, ponctuations aréolées; gynécée apocarpe; pollen anasulqué [1 a]; graines albuminées; genres profondément différenciés mono- ou bitypiques; distribution géographique fortement discontinue,...), mais — vue que nous rejetons catégoriquement — compte tenu du caractère achlamydé des fleurs, elles n'en seraient pas moins un groupe dit dérivé par rapport à l'ensemble des Magnoliales : dérivation évidente à la fois pour Takhtajan [2] et pour Cronquist [3], lesquels décrètent, selon les propres termes de celui-ci, que « la souche des Pipérales (Saururacées comprises) doit être recherchée dans les Magnoliales ». Dérivation évidente aussi pour Walker et Walker (1b) et pour Hutchinson (4) qui voit en cette famille la plus grande réduction des fleurs et la plus grande spécialisation des familles issues des Ranales. Malgré les études particulières ([5] à [8] et, notamment, en organogénétique, celles de S. C. Tucker depuis 1975 ([9], [10]), On n'est pas parvenu encore à comprendre, dans son unité, l'organisation fondamentale de la famille, objectif qui est proprement le nôtre depuis plusieurs années. Les Saururacées (5 genres, 7 espèces), famille qui semble avoir des rapports remarquablés avec les Monocotylédones (Emberger la considérait comme voisine des Arales [11]), sont des plantes herbacées, pérennes, aromatiques, vivant généralement dans les milieux marécageux d'Asie orientale et d'Amérique du Nord : les fleurs en sont <$, nues, épigynes (sauf chez Saururus), disposées en épis ou racèmes terminaux; à androcée de 3-6 (-8) étamines; à gynécée de 4 carpelles, presque apocarpe chez Saururus, de 3 carpelles et syncarpe chez les autres genres (fig. 1).

La fleur des Saururacéés présente plusieurs singularités de très grand intérêt théorique. Nous en retiendrons 4 chez Anemopsis californica : la 3-mérie, la disposition par paires des étamines, l'opposition des paires d'étamines aux carpelles, la position postérieure de l'un des carpelles (fig. 5). Chez un genre voisin, Houttuynia (fig. 1), la fleur est également 3-mère, mais à étamines solitaires (et seulement à demi-épigynes). Chez Saururus les

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étamines, hypogynes, sont le plus souvent au nombre de 6 (disposition que nous interprétons comme étant celle de 2 phyllomes théoriques en 1 cycle, le gynécée étant de 2 cycles 2-mères). Pour Eichler [12], l'androcée chez Saururus et Houttuynia serait composé théoriquement de 2 cycles 3-mères d'étamines l'un des cycles étant avorté chez Houttuynia (fig. 2). Nous avons [13], après Nozeran [7], qui se réfère aux travaux de Quibell [6], rejeté la conception d'Eichler. En effet, Quibell a parfaitement établi que chez Anemopsis les 6 étamines ne sont nullement disposées en 2 cycles de 3, mais en 1 cycle de 3 paires oppositicarpelles. « Pour que l'opinion d'Eichler sur Houttuynia cordata soit exacte, écrit justement Nozeran, il faudrait admettre chez Anemopsis californica, en plus du cycle staminal existant, un cycle d'étamines alternicarpelles avortées. Rien né nous permet de penser que cela soit exact ». Critique à laquelle s'est rallié Raju [8]. Le diagramme d'Eichler ne rend compte au mieux, et sans preuve, que d'une des 4 singularités que nous avons retenues. Nous fondant sur l'analyse de l'inflorescence et de la fleur chez Saururus et Houttuynia [14], nous avons été amené à poser l'hypothèse suivante :

Le modèle théorique de la fleur d'Anemopsis est construit par le jeu de cycles 2-mères alternes, le cycle externe étant à étamines transverses, et la partie antérieure des cycles (étamine du 2e cycle, carpelle du 4e cycle; site organogénétiquement terminal dans une fleur latérale, proche de la bractée et semblant être peu propice à une occupation) (fig. 4) étant congénitalement avortée (cas aussi de Houttuynia). On peut penser que les 3 premiers cycles (théoriquement 2-mères) ne sont pas suffisamment rapprochés entre eux pour que se produise le changement phyllotaxique qui amènerait les carpelles en position alterne par rapport aux étamines : le degré — que l'on peut taxer de floral avancé — de fusion des cycles, n'est atteint qu'au cours de la carpellogenèse et donc reste sans incidence phyllotaxique.

Quant à la disposition par paires des étamines : c'est une singularité capitale qui nous ramène au cas de Saururus. Chaque paire d'étamines, chez Anemopsis, occupe ce qui est le site d'une étamine chez Houttuynia : il n'y a, à la base, qu'un seul faisceau vasculaire ([6], [7]). Il faut admettre qu'il y a 3 microsporophylles, chacune constituée de 2 étamines. En d'autres termes, le phyllome sporogène est une unité théorique composée en fait de 2 sous-unités.

Chez Houttuynia, la microsporophylle est simple (fig. 1, 3). Cette conclusion confirme le bien-fondé de la notion d'autonomie des faisceaux que nous avons formulée pour rendre compte de l'extraordinaire organisation de l'inflorescence et de la fleur chez Saururus [14]. Le fait que dans nombre de cas — nous l'avons remarqué [15], après

EXPLICATIONS DE LA PLANCHE

1, Houttuynia cordata : fleur (prise dans la partie moyenne d'un épi); 2, diagramme floral, d'après Eichler; 3, idem, selon Leroy; la ligne en tirets indique le plan de symétrie théorique; 4, 5, 6, 7, 8, Anemopsis californica : 4, modèle théorique (inconnu dans la nature); il y a 4 cycles 2-mères, le premier (1-1') étant transverse; la partie antérieure, hachurée, avorte congénitalement; 5, diagramme floral, selon Leroy (homologue de celui de Houttuynia); 6, 7, 8, fleur avant l'initiation des carpelles; la symétrie bilatérale est évidente (préparations aux M.E.B., d'après Tucker, Amer. J. Bot., 1985; P, primordium d'une paire d'étamines; E, étamine; Br, bractée; échelle : 50 µm); 9, 10, diagrammes floraux de Saururus et Houttuynia d'après Burger (et Raju).

1, Houttuynia cordata : flower (from middle part of spike); 2, floral diagram after Eichler; 3, idem, according to Leroy; the dash line indicates theoretical symmetry plane; 4, 5, 6, 7, 8, Anemopsis californica: 4, theoretical model (unknown in nature); there are 4 2-merous cycles, the first one (1-1') being transverse; the anterior part, which is hachured, fails to be initiated; 5, floral diagram, according to Leroy (homologous to that of Houttuynia); 6, 7, 8, flower before initiation of carpels; the bilateral symmetry is evident (SEM preparation, after Tucker, Am. J. Bot., 1985; P, common primordium of a stamen pair; E, stamen: Br, bract; (Bar=50 µm); 9, 10, floral diagrams of Saururus and Houttuynia, after Burger (and Raju).


PLANCHE I/PLATE I

JEAN-FRANÇOIS LEROY

C. R., 1986, 2e Semestre (T. 303)

Série III — 8



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Melville [16], dans le genre Cercidiphyllum (Cercidiphyllacées) — des groupés d'étamines soient homologables à une seule étamine a été bien mis en relief par Stebbins [17]. Et cet auteur a même été jusqu'à penser que l'androcée originel des Angiospermes a pu être constitué de microsporophylles (ou autres structures) composées. L'évolution du « pseudoracème » de Saururus [14] s'est faite vers les autres genres de la famille selon des voies divergentes mais tout à fait comparables. Dans l'épi d'Houttuynia et d'Anemopsis, il y a eu incorporation, à des degrés différents, des fleurs à l'axe commun. Anemopsis (fleurs épigynes, profondément immergées dans l'axe) marque un progrès évolutif de certains caractères floraux par rapport à Houttuynia, mais non en ce ; qui concerne l'androcée, lequel est resté plus proche de celui de Saururus [14]. Globalement la fleur d'Anemopsis comme celle d'Houttuynia,construite sur un modèle à cycles 2-mères encore décelables, semble de ce fait très primitive et ne permet, par ailleurs, aucune observation qui pût la faire considérer comme dérivant d'un type chlamydé (conclusion généralisable à la famille toute entière).

Notre interprétation de la fleur d'Anemopsis, et cela nous paraît être d'importance décisive, est en parfaite harmonie avec les observations ontogéhétiques toutes récentes de Tucker [10]. D'après cet auteur : (1) la fleur d'Anemopsis, étudiée ontogéhétiquement, se révèle être à symétrie bilatérale, le plan étant antéro-postérieur (=médian). La symétrie radiale, généralement admise, par exemple par Meeuse [18], n'est, dans ce cas particulier, qu'un faux-semblant propre à la fleur adulte. Notons en passant que l'un et l'autre types de symétrie peuvent donc être, contrairement à ce que l'on pense généralement, à peu près au même niveau d'évolution. (2) Les primordia des deux paires d'étamines latérales se forment d'abord (la fleur est une pousse « axillaire » : les deux premiers phyllomes, ici les étamines, étant cyclisés, sont normalement transverses), suivis du primordium postérieur (qualifié d'antérieur par Tucker (comme chez Houttuynia). En d'autres termes, le 1er cycle (2-mère et transverse) et le 2e cycle (1-mère et médian) ne forment pas un verticille parfait. (3) La cyclisation des 3 carpelles (en 1 seul verticille) est très poussée. (4) Les figures (ici, fig. 6, 7, 8) données par Tucker sont particulièrement remarquables, non seulement en ce qu'elles montrent la symétrie bilatérale et l'ordre d'organogenèse, mais en ce qu'elles révèlent aussi, au niveau des primordia staminaux, une lacune médiane antérieure, laquelle ne se retrouve pas, pratiquement, entre le primordium postérieur et les primordia latéraux. Tucker emploie même la notion d'arche pour désigner l'ensemble dès 3 primordia, à un certain stade de l'organogenèse : « The flower becomes somewhat arched over thé bract ». Il semble qu'il y ait là trace de l'extinction congénitale touchant le méristème dans sa partie antérieure. Tout se passe exactement comme chez Houttuynia, à cette différence près que, dans ce dernier genre, chaque phyllome staminal théorique est classiquement une unité simple (devenue simple). Nous sommes loin du diagramme d'Eichler (fig. 2), lequel est encore pris en compte dans le plus récent ouvrage de Cronquist, en 1981 [3], où l'on peut lire que, chez les Saururacéés, les étamines sont au nombre de 6-8 en 2 verticilles alternes, ou 3 en 1 seul verticille (ce qui implique l'avortement de 1 cycle).

Dans l'interprétation (spéculativement intéressante) de Raju [8], fondamentalement différente de la nôtre, la fleur des Saururacéés est un pseudanthe composé selon une spirale de 3-4 fleurs, dites en ligne (par Burger) et simples, lesquelles seraient constituées chez Saururus de 2; étamines plus 1 carpelle, la dernière fleur, terminant la spirale, étant réduite au seul carpelle (non accompagné de ses 2 étamines) (fig. 9, 10). Hypothèse d'un type de pseudanthe appuyée ici (par Raju) sur des faits controuvés, en particulier par


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Tucker [10]. La spirale de Raju pourrait répondre à une nécessité théorique dans la

mesure où les Saururacéés ont une phyllotaxie alterne, mais en fait, au niveau floral, la

spirale est indécelable, les phyllomes étant plus ou moins cyclisés : d'où la négation de

l'existence de la disposition spiralée par Tucker. Raju n'explique pas la double polarisation

des étamines dans le plan médian chez Saururus, non plus que la présence générale des

paires d'étamines chez Anemopsis. Par ailleurs, la prétendue absence d'étamines en

position postérieure (fig. 9) n'a pas été confirmée. Les diagrammes floraux de Saururus

et Houttuynia (fig. 9, 10) présentés par Burger [19] à la suite des travaux de Raju [8], et

re-présentés récemment [20] se fondent sur des faits controuvés, anatomiques ([7], [14],

[21]) et ontogénétiques [9]. L'hypothèse de Raju n'en a pas moins inspiré, dans un

premier temps, un essai (d'ailleurs fort intéressant à plusieurs égards) de Burger [19] sur

l'ancestralité des plantes à fleurs en ligne, fleurs ô* (telles celles de Chloranthus ou

Sarcandra dans les Chloranthacées) qui semblent en fait [22] résulter de l'évolution

inflorescentielle à partir d'éléments unisexués. Une hypothèse comparable à celle de Raju

concernant Houttuynia a été proposée depuis [23].

Je remercie les Dr P. Raven (Missouri Botanical Garden) et S. Carlquist (Claremont, Californie) qui m'ont procuré du matériel frais d'Anemopsis. Collaborateurs techniques : Jacqueline Lemeux, Joëlle Rameau, M. Chalopin.

Reçue le 28 avril 1986.

RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES

[1] (a) J. W. WALKER, in C. B. BECK éd., Origin and early évolution of angiosperms, Columbia University Press, New York, 1976, p. 241-299; (6) J. W. WALKER et A. G. WALKER, Ann. Missouri Bot. Gard., 71, 1984, p. 464-521.

[2] A. TAKHTAJAN, Flowering Plants, Orgin and dispersal, Traduction de C. Jeffrey, Smithsonian Institution Press, Washington, 1969.

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[10] S. C. TUCKER, Amer. J. Bot., 72, (1), 1985, p. 20-31.

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[15] J.-F. LEROY, Comptes rendus, 290, série D, 1980, p. 679-682.

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[22] J.-F. LEROY, Comptes rendus, 296, série III, 1983, p. 747-752.

[23] T. YAMAZAKI, Bot. Mag. Tokyo, 91, 1978, p. 69-82.

Laboratoire de Phytomorphologie, E.P.H.E., Laboratoire associé au C.N.R.S. n° 218 et Laboratoire de Phanérogamie, Muséum,

16, rue Buffon, 75005 Paris.


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PHYSIOLOGIE VÉGÉTALE (BIOCHIMIE CELLULAIRE). — La méthionine adénosyltransférase des végétaux : mise en évidence de 3 formes. Note de Odette Dogbo et Bilal Camara, présentée par Alexis Moyse.

L'activité méthionine adénosyliransférase (MAT) mesurée à partir de la fraction soluble de fruits verts de poivron (Capsicum annuum L. cv Yolo wonder) est la résultante du fonctionnement dé 3 différentes enzymes, que nous avons dénommées MATI, MATII et MATIII. Ces 3 formes ont été séparées par chromatographie sur support hydrophobe. Ces 3 enzymes diffèrent par leur thermostabilité, leur sensibilité au diméthylsulfoxyde et à l'acide abscissique.

PLANT PHYSIOLOGY (CELLULAR BIOCHEMISTRY). — Plant methionine adenosyltransferase: evidence for thé existence of 3 forms.

Through the use of hydrophobic chromatography, the total soluble methionine adenosyltransferase (MAT) from green pepper fruits has been fractionated into 3 different enzymes that we have termed MATI, MATII, MATIII. These forms have different thermostabilities, sensibilities to dimethysulfoxide and abscisic acid.

With the demonstration that S-adenosyl methionine is the methyl donor involved in terpenoid biosynthesis, attempt has been made to study its formation through the activity of the soluble ([1]-[5]) methionine adenosyltransferase (MAT) in green pepper fruits. S-adenosyl methionine was purified according to ([6]-[8]) and proteins were estimated according to Bradford [9].

The bulk of activity precipitated at 40 to 60% saturation with ammonium sulfate. The reaction was linear up to 1 hr. By plotting the saturation curve according to michaelis equation, a straight line was not observed. This deviation from normal michaelis kinetic, though not excluding a cooperative effect and the participation of S-adenosyhnethionine to different pathways, made the existence of several forms of methionine adenosyltransferase, a reasonable hypothesis. Therefore, use has been made of different procedures in the fractionation of the soluble extract. After chromatography on several supports including Sephacryl S-300, DEAE Sephacel, Blue Sepharose CL-6 B and Phenylsepharose, three forms were obtained. The fallacy of an artifact is weakened by the fact that (1) protease inhibitor was added during the extraction procedure (2) similar work up of more than five different batches of fruits gave exactly the same profile. For convenience we term these different forms MATI, MATII and MATIII. Their existence gained added support in the sense that they have different properties: only MATIII was stimulated at 20% dimethylsulfoxide concentration in the incubation medium. In addition, after exposure at 55°C for 5 min., the activity pf the I and II forms were 100% and 10% preserved, while that of the III was completely lost. Furthermore at 10 µM abscisic acid concentration, only the II and III forms were stimulated.

INTRODUCTION. — La méthionine adenosyltransférase (ATP-L-méthionine S-adénosyltransférase, EC2. 5.1.6) catalyse la formation de la S-adénosylméthionine qui, chez les végétaux, intervient dans la synthèse des polyamines, des acides nucléiques, de l'éthylène... et des terpénoïdes (chlorophylles et plastoquinones) dont les; dernières étapes comportent plusieurs C-méthylations. A notre connaissance, la méthionine adénosyltransférase a été peu étudiée chez les végétaux ([1]-[5]).

Dans le cadre de notre travail sur l'organisation et la régulation des enzymes impliquées dans la biogenèse des terpénoïdes plastidiaux, nous avons, pour la première lois, mis en

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évidence et caractérisé 3 formes de cette enzyme. Nous présentons brièvement les résultats obtenus au cours de ce travail.

MATÉRIEL ET MÉTHODES. — Le péricarpe des fruits verts de poivron est broyé (1g de matière fraîche pour 2 ml de milieu) pendant 5 x 10 s dans le milieu comprenant : Tris-HCl 50 mM, EDTA 2mM, de phénylméthylsulfonyl de fluor 3µM, 2-mercaptoéthanol 20 mM, pH final 8. L'extrait est filtré à travers 4 épaisseurs de toile Blutex et centrifugé à 20 000 x g pendant 20 mn. Les protéines du surnageant sont précipitées après addition de sulfate d'ammonium selon le nomogramme de Dixon. Les culots de précipitation sont repris par le tampon : Tris-HCl 10 mM, DTT2mM, glycérol 20%, pH7,8 et dialysés contre ce même tampon.

L'activité méthionine adénosyltransférase est déterminée dans le milieu (0.6ml volume final) contenant : Tris-HCl 10mM, 3-414C, L-méthionine (C.E.A., France 7,4kBq, 1665 MBq/mmole), ATP5mM, MgCl2, 20 mM, KC10,1M, DTT 2mM, pH final 8. L'incubation se déroule à 37°C. Le milieu réactionnel est plongé dans la glace pour arrêter la réaction. Une fraction aliquote est déposée sur une rondelle de papier échangeur d'ions Whatman P81. Après séchage, la rondelle est lavée dans différents bains d'une solution de formiate d'ammonium 100 mM, pH3 pendant 10, 10 et 5mn. Elle est ensuite plongée dans de l'éthanol absolu, puis dans l'éther éthylique, avant d'être séchêe et comptée dans le mélange scintillant (0,1g POPOP, 4gPPO, 300 ml éthanol et 11 de toluène). Cette méthode, inspirée de celle précédemment décrite ([6], [7]), permet un taux de récupération de la S-adénosylméthionine supérieur à 80%. La pureté de la S-adénosylméthionine formée est vérifiée par chromatographie liquide haute performance (HPLC) sur colonne de partisil 10 SCX [8].

Les protéines ont été dosées selon la méthode de Bradford [9]. Les supports chromatographiques ont été fournis par Pharmacia France.

RÉSULTATS ET DISCUSSION. — Mise en évidence de l'activité méthionine adenosyltransférase et étude de quelques facteurs. — L'extrait soluble est obtenu par broyage et centrifugation. Au cours de la saturation par le sulfate d'ammonium, la majeure partie de l'activité est récupérée dans la fraction qui précipite entre 40 et 60% de saturation. Nous l'avons utilisée pour la première partie du travail.

TABLEAU

Effet de la concentration en ATP et en MgCl2 sur l'activité de la méthionine adénosyltransférase.

Effect of ATP and MgCl2 concentrations on the activity of methionine adenosyltransferase.

Concentration en ATP ou MeCl2, (mM)

Conditions 1 2 3 4 5 10 15 20 30

Radioactivité en DPM (%)

ATP 5 mM MgCl2 variable - - - - 18 22 19 27 14

ATP variable MgCl2, 20 mM .......... 12 16 17 18 18 14 4 1

Fig. 1

Fig. 2

Fig. 1. — Effet de la teneur en protéines sur l'activité de la méthionine adenosyltransferase, (O) témoin bouilli.

Fig. 1. — Effect of protein content on the activity of methionine adenosyltransferase, (O) boiled control.

Fig. 2. — Formation de la S-adénosylméthionine en fonction du temps.

Fig. 2. — Time Course of S-adenosylmethionine formation.


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La courbe (fig.1) montre que l'activité de cette enzyme augmente en fonction de la teneur en protéines de l'extrait soluble. On n'observe aucune synthèse de S-adénosylméthionine lorsque le milieu réactionnel est dépourvu d'ATP, L'influence conjuguée de la concentration en magnésium et en ATP est présentée dans le tableau I. L'optimum se situe à une valeur du rapport Mg2+/ATP=4. Cette valeur confirme celle précédemment obtenue par Aarnes [4]. La zone optimale de pH de la réaction se situe dans la zone basique (8-8,2). La cinétique de la réaction est présentée dans la figure 2. La décroissance observée à partir de 1 h d'incubation pourrait être due à une dégradation en pH basique de la S-adénosylméthionine formée.

L'activité de l'enzyme est fortement inhibée par le tripolyphosphate et la cycloleucine (fig. 3). En revanche, le diméthylsulfoxyde stimule considérablement l'activité méthionine adénosyltransférase.

La courbe de saturation vis-à-vis de la méthionine ne suit ; pas une cinétique michaelienne (fig. 4).

Mise en évidence de différentes formes de la méthionine adénosyltransférase. — Sans exclure un phénomène de coopérativité, et compte tenu de l'utilisation de la S-adénosylméthionine dans différentes voies du métabolisme, la cinétique non michaelienne pourrait être due à l'existence d'isoformes de la méthionine adenosyltransférase.

Pour éprouver cette hypothèse, nous avons soumis l'extrait obtenu entre 40 et 60 % de saturation à différentes chromatographies sur des colonnes de Sephacryl S-300, DEAE Sephacel, Blue Sepharose CL-6B et Phenylsepharose. Nous observons dans ces conditions l'existence de 3 pics d'activité (fig. 5).

Dans nos conditions expérimentales, l'addition d'inhibiteurs de protéases au cours de l'extraction de l'enzyme nous permet d'affirmer que ce phénomène n'est pas lié à l'action de protéases endogènes. Par ailleurs, nous observons le même profil après extraction de plus de 5 lots différents de fruits. Nous concluons que ce résultat met en évidence l'existence de 3 formes de la méthionine adénosyltransférase, que nous appellerons MAT I,

Fia. 3

Fig.4

Fig. 3. — Régulation de l'activité méthionine adenosyltransférase par le tripolyphosphate, la cycloleucine et le diméthylsulfoxyde.

Fig. 3. — Regulation of methionine adenosyltransferase activity by tripolyphosphate, cycloleucine and dimethylsulfoxide.

Fig. 4. — Effet de la concentration en méthionine sur l'activité de la méthionine adénosyltransférase (représentation selon la méthode de Lineweaver et Burk).

Fig. 4. — Effect of methionine concentration on the activity of methionine adenosyltransferase (graphic data presented according to Lineweaver and Burk).


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MATII et MAT III. Ces données sont corroborées par les faits suivants :

— A 20% de diméthylsufoxyde dans le milieu réactionnel, seule la forme III est stimulée.

— Après préincubation à 55°C pendant 5 mn, l'activité des différentes formes MATI et MATH est conservée à 100% et 10%. En revanche, l'activité de la forme MATIII est totalement perdue.

— En présence de 10 µM d'acide abscissique, seules les formes II et III sont stimulées.

CONCLUSION. — Ce travail met en évidence pour la première fois l'existence de 3 formes de la méthionine adénosyltransférase chez les végétaux. Une étude plus détaillée portant sur les propriétés de ces 3 formes et leur compartimentation cellulaire sera fournie. Reçue le 28 avril 1986.

RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES

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Laboratoire de Biochimie du Développement végétal, Équipe de l'U.A.-C.N.R.S. n° 1180, Université Pierre-et-Marie-Curie (Paris-VI), Tour n° 53, 4, place Jussieu, 75230 Paris Cedex 05.

Fig. 5. — Profil d'elution des différentes formes de la methiomne adénosyltransférase sur colonne de Phénylsépharose. La forme I est éluée par le tampon de base (Tris-HCl 10 mM, DTT 2mM, EDTA 1mM, MgCl2 2mM, glycerol 20%, pH7,2) contenant du KCl, 0,3 M; la forme II, par le tampon de base sans KCl et la forme III par le tampon de base contenant 40% de diméthylsulfoxyde.

Fig. 5. — Elution profile of the different forms of methionine adenosyltransferase on Phenylsepharose column. The 1 form was eluted with the basic buffer (10mM Tris-HCl buffer, 2mMDTT, 1 mM EDTA, 2mMMgCl2, 20% glycerol, pH 7.2) containing 0,3 M KCl; the II form with the same buffer depleted of KCl, and the III form with the basic buffer containing 40% dimethylsulfoxide.


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AGRONOMIE.— Mise en évidence de l'activité par contact et endothérapie du carbendazime sur la pénétration et le développement endoradiculaire des nématodes à kystes de la pomme de terre, Globodera rostochiensis Woll. et G. pallida Stone. Note de Alain Cavelier, Didier Mugniery et Nathalie Le Garjean, présentée par Constantin Chararas.

Une nouvelle;méthode in vitro permet de en évidence avec précision l'effet d'un toxique sur la

pénétration dès nématodes à kystes dans les racines de la plante-hôte et sur le développement endoradiculaire. de ces parasites. Un benzimidazole, le carbendazime, a réduit notablement la pénétration des nématodes exposés au toxique par contact et s'est avéré un puissant inhibiteur du développement endoradiculaire par voie endothérapique.

AGRONOMY. — Evidence of contact and systemic effect of carbendazim on the potato cyst-nematodes (Globedera rostochiensis, Woll,, G. pallida, Stone) penetration and endoradicular development.

A new in vitro method allows accurate evidence of a poison effect on cyst-nematodes penetration into host-plant roots, and on the endoradicular development of these animals. A benzimidazole, carbendazim, significantly reduced the penetration of nematodes exposed by contact, and proved to be a potent inhibitor of their endoradicular development by systemic way.

INTRODUCTION. — Les nématicides non-fumigants employés dans la pratique agricole sont soit des carbamates (aldicarbe, carbofuran, oxamyl), soit des organophosphorés. (éthoprophos, phênamiphos). Malgré les propriétés systémiques de certains d'entre eux, et une activité endothérapique réelle [1], ces produits n'agissent de façon significative au plan agronomique que par contact, en solution dans le sol, en limitant temporairement la pénétration des larves infestantes: dans les racines des plantes-hôtes ([2] à [5]). La famille des benzimidazoles, de son côté, est représentée en médecine humaine et vétérinaire par de nombreux antihelminthiques (cypendazole, fenbendazole, mébendazole, thiabendazole, p. ex.) et en agronomie par des fongicides systémiques (bénomyl, fénazaflor, fubéridazole, thiabendazole) Ces derniers sont des précurseurs de l'acide benzimidazole carbamique, connu comme fongicide sous le nom de carbendazime.

Nos investigations sur le mode d'action des nématicides non-fumigants nous ont

conduits à éprouver cette dernière famille et à mettre en évidence des effets inconnus ou

peu connus jusqu'à présent: Nous rendons compte ici de nos essais avec le carbendazime.

MATÉRIEL ET METHODE. — Rappelons que les nématodes à kystes se conservent dans le sol sous forme de larves du deuxième stade contenues en grand nombre dans des kystes protecteurs. Elles éclosent lorsque les. conditions sont favorables et pénètrent dans les racines des plantes-hôtes où elles se nourrissent; elles subissent plusieurs mues avant d'atteindre le stade adulte et de se reproduire.

La méthode a consistée à scinder l'étude du mode d'action du carbendazime en une série d'expériences conçues en fonction des différentes phases du comportement des nématodes à l'égard de la plante-hôte. Nous avons eu recours pour cela aux techniques d'élevage mises au point antérieurement [6] : des plantules de tomate sont cultivées sur gélose en boîtes de Petri et inoculées par des larves infestantes. A la fin du développement complet des nématodes dans les boîtes témoins, soit 15 à 16 jours après inoculation, on dissèque les racines pour déterminer les proportions relatives des stades endoradiculaires L2, L3, les stades L4 et adultes étant dénombrés ensemble.

Les essais ont porté sur l'une ou l'autre des espèces Globodera rostochiensis et G. pallida en fonction des larves dont nous disposions; ils différaient en outre par les modalités d'exposition au toxique

1. mise en évidence de la toxicité par contact: des L2 ont été immergées dans une dispersion du carbendazime. pendant 12 h, puis.lavées et inoculées sur plantules cultivées sur gélose à 15 pour 1000 d'agar-agar, non traitée. Nous avons observé la pénétration et le développement endoradiculaire des nématodes.

2, mise en évidence de la toxicité endothérapique : des L2 non traitées ont été inoculées sur des plantules cultivées comme ci-dessus. Après la pénétration des larves, on a transféré les plantules dans des boîtes de Pétri contenant de la gélose à 11 pour 1000 d'agar-agar, traitée. La pénétration des larves s'échelonnant Sur 7 h, le transfert a eu lieu à la fin de ce délai si l'on désirait agir au stade L2 endoradiculaire ou après 6 jours, si l'on désirait agir au stade L3, avant l'apparition des premières L4. Les effets observés portaient sur le développement endoradiculaire des nématodes.

Les gammes de concentrations du carbendazime ont été choisies en fonction des résultats d'épreuves préliminaires pour assurer les réponses convenables eu égard aux effets à mettre en évidence.

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TABLEAU I

Effet du carbendazime, appliqué par contact à diverses concentrations, sur la pénétration et le développement

endoradiculaire de G. pallida sur plantules de tomate (inoculation de cinq larves par plantule; une plantule

par boîte; 40 boîtes par traitement). Effect of carbendazim, applied by contact at various concentrations, on the penetration and the endoradicular

development of G. pallida on tomato plantlets (five larvae for one plantlet; one plantlet in one dish; 40 dishes

per treatment).

%

de nématodes Répartition des stades endoradiculaires en % de leur total

Concentrations n'ayant pas _

(mg/kg) pénétré L2 L3 (L2+L3) Mâles Femelles

0 , . 38 a 1,3 a 15 a 4,6 79

10 77 6 67 b 33 b 0 0

50 65 b 75 b 25 6 0 0

250 98 c 40 b 60 b 0 0

N.B. : les valeurs affectées de lettres identiques ne sont pas significativement différentes.

TABLEAU II

Effet du carbendazime, appliqué par voie endothérapique au stade des L 2 endoradiculaires à diverses concentrations, sur le développement endoradiculaire de G. rostochiensis sur plantules de tomate (inoculation de huit larves par plantule; une plantule par boîte; 40 boîtes par traitement).

Effect of carbendazim, applied systemically at the L2 endoradicular stage at various concentrations, on the endoradicular development of G. rostochiensis on tomato plantlets (eight larvae for one plantlet; one plantlet in one dish; 40 dishes per treatment).

Répartition des stades endoradiculaires en % de leur total

Concentrations ——— indice

(mg/kg) L2 L3 (L2+L3) Mâles Femelles andrique

0 2,2 a 9,6 a 8,2 80 a 10,0 a

0,03. . . 13 6 24 b 10 53 6 0,18 ab

0,08 67 c 10 b 6 17 c 0,39 b

0,19 97 d 3 c 0 0 d

0,47 . 99 d 1 c 0 0d

N.B. : Les valeurs affectées de lettres identiques ne sont pas significativement différentes.

RÉSULTATS. — Dans les tableaux qui suivent, tous les critères sont comparés au moyen

du test non-paramétrique 21 de Kullbach [7]. Nous situons les significations au seuil

p=0,05. Les critères sont les suivants :

nombre de nématodes endoradiculaires

effet sur la pénétration =

nombre de L 2 n'ayant pas pénétré

effectif des L 2 endoradiculaires

blocage du développement en L2=

effectif total des stades ultérieurs à L 2

effectif des L2 endoradiculaires + L3

blocage du développement jusqu en L3=

effectif total des stades ultérieurs à L 3

nombre de femelles formées

effet sur la formation des femelles =

effectif des autres nématodes endoradiculaires

nombre de mâles

indice andrique = .

nombre de femelles


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TABLEAU III

Effet du carbendazime, appliqué par voie endothérapique au stade des L3 à diverses concentrations, sur le développement endoradiculaire de G. rostochiensis sur plantules de tomate (inoculation de 8 larves par plantule; 1 plantule par boîte; 40 boîtes par traitement).

Effect of carbendazim, applied systemically at the L3 stage at various concentrations, on the endoradicular development of G. rostochiensis on tomato plantlets (8 larvae for 1 plantlet; 1 plantlet in 1 dish; 40 dishes per treatment).

Répartition des stades endoradiculaires en % de leur total

Concentrations

(mg/kg) . L2 L3 (L24+L3) Mâles ' Femelles

0. . 1 a 9 a 14 76 a

0,3. 18 b . 77 b. 3 . 2 b

0,9. 216 74 . b. 2 3 b

2,7. . . ...... . 24 b. 76 c 0 0 b

N-B. : Les valeurs affectées de lettres identiques ne sont pas significativement différentes.

Pour une meilleure compréhension, les tableaux ne font état que des structures des populations retrouvées lors des dissections; ces structures sont exprimées en pourcentages. Les effets « produits-doses », calculés à partir des résultats; bruts, ne figurent pas dans les tableaux mais sont commentés ci-dessous..

1. Toxicité par contact (tableau I). — L'effet sur la pénétration rend compte à lui seul de l'effet-dose qui apparaît à l'analyse de tous les effets confondus. Par rapport au témoin, la réduction de la pénétration était de 50 à 95 % selon la dose.

Aucun individu n'est parvenu au stade adulte dans les lots traités, 69 % en moyenne des nématodes endoradiculaires restant bloqués dès le stade L2, sans différence perceptible entre les doses pour ce critère.

2. Toxicité endothérapique, — (a) Exposition de la plantule au stade L2 endoradiculaire du nématode (tableau II). — L'importance du blocage en L2 s'est accru avec la dose. A partir de 0,08 mg/kg ce blocage explique la plus grande partie de l'effet sur le développement.

37 à 100 % des nématodes n'ont pas atteint le stade adulte, le maximum ayant été obtenu pratiquement dès 0,19 mg/kg.Cette réduction a intéressé la formation des femelles dans la proportion de 34 % par rapport au témoin.

Considérant les doses qui autorisent la formation des adultes, il n'est pas impossible qu'autour de 0,08 mg/kg intervienne un effet sur le rapport des sexes.

(b) exposition de la plantule au stade L3 du nématode (tableau III). — La persistance de larves L2 reflète un retard naturel de développement qui est un phénomène constant chez les nématodes phytoparasites, A toutes les doses le carbendazime a bloqué lé développement de ces L2 retardataires dans un rapport allant de 16/1 à 26/1 en comparaison du témoin mais sans différence significative entre elles.

La quasi-totalité de la variabilité.des réponses repose sur le nombre de nématodes qui n'ont pas pu dépasser le stade L 3 : 95 à 100 % des animaux traités n'ont pas atteint le stade adulte, contre 10 % dans le témoin.

La réduction de la formation des femelles était de 96 à 100 % par rapport au témoin, et bien que les valeurs ne soient pas statistiquement différentes, la suppression totale des femelles à 2,7 mg/kg a une signification biologique non négligeable (aptitude à la reconstitution des populations).


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CONCLUSION. — Au moyen de cette nouvelle méthode d'appréciation des effets des nématicidés non fumigants in vitro, nous avons pu mettre en évidence la puissance et l'originalité de l'activité biologique du carbendazime sur les nématodes à kystes de la pomme de terre.

— Puissance car, à quelques centièmes de milligramme de toxique par kilogramme dé substrat (gélose), on obtient une limitation importante du développement des nématodes et de l'évolution de leurs populations

— Originalité car, contrairement aux nématicidés non fumigants classiques, ce benzimidazole agit sur le développement endoradiculaire, notamment par voie endothérapique, à des doses très faibles, alors qu'une bonne maîtrise de la pénétration ( > 90 %) par contact requiert des doses environ 1000 fois plus fortes. Cela laisse entendre qu'en conditions agronomiques favorables (milieu peu adsorbant en particulier) l'action sur la pénétration pourrait être prolongée par l'action sur le développement, aboutissant à une réduction finale de la population des nématodes. Ceci n'est généralement pas le cas avec les autres nématicides dont l'effet temporaire sur la pénétration, s'il protège la plante jeune, ne parvient pas à réduire les populations infestantes en fin de culture.

Quelques auteurs ([1], [8], [9], [10]) se sont penchés spécifiquement sur divers aspects de l'efficacité des benzimidazoles vis-à-vis de divers Tylenchidae phytoparasites. Nos résultats complètent l'explication des phénomènes qu'ils ont observés et permettront peut-être de renouveler l'intérêt que l'on pourrait porter à cette famille chimique. Reçue le 5 mai 1986.

RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES

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I.N.R.A., S.R.I.V., B.P. n° 29, 35650 Le Rheu.


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RADIOBIOLOGIE. — Effets biologiques de faibles doses d'irradiation gamma. Mise en évidence d'un effet de l'irradiation du milieu seul sur la croissance d'une cyanobactérie Synechococcus lividus. Note de Annie Conter et Hubert Planel, présentée par Théodore Monod.

Dans le but de descrimiher les effets directs au niveau cellulaire des effets indirects se produisant par l'intermédiaire du milieu de culture, de l'irradiation gamma fournie à faible débit de dose, nous avons réalisé des expériences dans lesquelles la croissance de culture de Synechococcus réalisées dans du milieu préalablement irradié, était comparée à celle de cultures réalisées dans du milieu non irradié. Ces cultures étaient placées dans des conditions de culture rigoureusement identiques. Une stimulation de croissance a été observée au 7e jour après l'inoculation des cultures réalisées avec des cellules en phase de décélération. A l'opposé, des cellules exponentielles ont été inhibées quand elles étaient réalisées dans du milieu préalablement irradié. L'addition de catalase (100 U/ml) fait apparaître la radiostimulation mais non.Tinhibition provoquée par la pré-irradiation du milieu de culture. Ces résultats démontrent que l'effet des faibles doses est essentiellement un effet indirect, impliquant le peroxyde d'hydrogène, mais que d'autres produits radioformés doivent également intervenir pour expliquer les phénomènes observés.

RADIOBIOLOGY. — Biological effects of low doses of ionizing radiations. Evidence of effect of preirradiation of culture medium on subsequent growth in Cyanobacterium Synechococcus lividus in culture.

In order to distinguish the direct effects of low dose of ionizing radiations at the cellular level from those indirect through the culture medium, we have compared proliferation of Synechococcus lividus grown in preirradiated medium to proliferation of cultures grown in non-irradiated medium, A stimulation of growth was observed at the 7th day in cultures inoculated with cells selected in deceleration phase, while an inhibition occured in cultures inoculated with exponential growing cells. Addition of catalase (100 U/ml) counteracted the stimulating effect but did not change the inhibiting effect induced by pre-irradiated medium. Results demonstrated the indirect effect of low dose of irradiation, implying hyarogen peroxide, but let us to think that others radioproduced products could be also involved in the mechanism.

INTRODUCTION. — Des expériences précédentes ont montré que l'irradiation ionisante naturelle ou à très faible débit de dose peuvent stimuler la prolifération de la Cyanobactérie Synechococcus lividus [1]. Des recherches antérieures ont également montré que plusieurs facteurs tels que « l'âge » des cellules utilisées pour l'inoculation du milieu ([2]-[3]), les conditions d'éclairement [4] peuvent modifier la réponse : des conditions qui entraînent un ralentissement du taux de croissance et une augmentation des activités des enzymes de défense contre les peroxydes : superoxyde dismutase et glutathion reductase, accroissent l'amplitude de la radiostimulation. A l'opposé, des cellules à forte activité prolifératrice présentant de faibles activités des enzymes de défense contre les peroxydes sont inhibées sous irradiation [3]. Enfin, une augmentation de l'activité de ces enzymes était observée sous irradiation [5]. L'ensemble de ces résultats d'une part, l'hypothèse émise par Croute sur le mécanisme de radiostimulation observée chez la Paramécie [6] d'autre part, nous ont amené à penser que le mécanisme d'action des faibles doses pouvait être lié, chez Synechococcus à un effet indirect par l'intermédiaire des peroxydes radioformés dans le milieu de culture.

Partant de ces considérations, nous avons effectué des expériences dans lesquelles la croissance dé cultures réalisées dans du milieu préalablement irradié était comparée à celle de cultures réalisées dans du milieu non irradié.

PROTOCOLE EXPÉRIMENTAL. — Les conditions de culture ainsi que le dispositif expérimental sont les mêmes que ceux précédemment décrits [1].

1. 31 de milieu de culture (milieu C de Kratz et Myers [7]) sont préparés stérilement et placés pendant 21 jours dans la chambre contenant une source d'irradiation faite de nitrate de thorium délivrant la dose de 21 mGy/an. 31 de milieu sont préparés extemporanément, juste avant l'inoculation.

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TABLEAU I

Influence de l'addition de 100 U/ml de catalase active (Cat. a) ou inactive (Cat. i) sur les populations cellulaires obtenues au 7e jour dans des cultures réalisées à partir de cellules exponentielles ou en phase de décélération dans du milieu témoin ou irradié (pendant 21 jours). Chaque valeur est la moyenne de 10 cultures ± l'intervalle de confiance. *n. 106 cellules ml- 1, ml : milieu irradié; mT : milieu témoin.

Effect of pre-irradiation of medium, addition of inactivated catalase (Cat. a) or active catalase (Cat i) at the 7 th day after inoculation with cells selected in exponential or deceleration phase. Each value expressed as 106 cells. ml' 1 ± confidence interval is the mean of 10 cultures: ml (irradiated médium); mT (control medium).

Catalase Catalase Cat. a/

Contrôle inactive Cati/ T active Cat. i

Cellules exponentielles :

milieu témoin 26,4*±2,60 31,4 + 2,14 1,19 47,1 ±3,20 1,50

milieu irradié 20,3 ±1,03 24,1 ±1,03 1,19 37,7 ±1,99 1,55

ml/mT 0,77 0,77 0,80

Cellules en phase de décélération :

milieu témoin 21,7 ±0,33 27,1±1,58 1,25 22,10±2,2 0,82

milieu irradié. 32,3 ±2,90 40 ±2,50 1,24 22,7 ±1,90 0,57

ml/mT 1,49 1,48 1,03

2. L'inoculation des milieux est réalisée à l'aide des mêmes cellules prélevées soit dans une culture en phase exponentielle (7 jours) soit en phase de décélération (18 jours), à la concentration de 3.106 cellules/ml. Les milieux sont alors agités et distribués par volume de 50 ml dans des flacons de type Erlenmeyers de 100 ml. Des lots de 15 cultures de chaque milieu et de chaque type de cellule sont ainsi réalisés.

3. La catalase « beef liver » est utilisée. La catalase est inactivée par chauffage à 120°C pendant 20 mn. La catalase est ajoutée juste après l'inoculation à la concentration de 100 U/ml.

4. La croissance est estimée par comptage à l'hématimètre sur des échantillons de chaque culture prélevés au 7e jour après l'inoculation, conformément à la méthode précédemment décrite [1]. Les données sont analysées statistiquement par l'analyse de la variance en utilisant des plans expérimentaux d'analyse à trois facteurs croisés.

RÉSULTATS. — Le milieu irradié entraîne une stimulation de croissance des cultures réalisées à partir de cellules en phase de décélération et une inhibition de croissance des cultures réalisées avec des cellules exponentielles. En effet, les populations cellulaires au 7e jour diffèrent significativement à la fois avec l'âge des cellules et avec le milieu de culture (tableaux I et II).

L'addition de catalase inactivée par la chaleur entraîne une stimulation de la croissance de l'ordre de 20 à 25 %. Cette augmentation significative ne dépend ni de l'âge des cellules ni du milieu utilisé pour l'inoculation (tableau II). L'addition de catalase active est suivie d'une stimulation de croissance des cellules exponentielles et une inhibition des cellules en phase de décélération. De plus l'addition de catalase fait disparaître la stimulation produite sur les cellules en phase de décélération par la pré-irradiation de milieu tandis qu'elle ne modifie pas l'inhibition produite sur les cellules exponentielles, comme en témoigne l'interaction de 2e ordre entre les facteurs catalase active, milieu et âge.

DISCUSSION. — Nos résultats indiquent que l'irradiation du milieu peut à lui seul modifier la croissance cellulaire, d'une manière similaire à celle de l'irradiation chronique à faible débit des cultures. Ces résultats confirment l'hypothèse d'une action indirecte des faibles doses par l'intermédiaire du milieu de culture.

Ces modifications dépendent de l'âge des cellules utilisées pour l'inoculation et peuvent de ce fait être reliées à des modifications du métabolisme se produisant au cours des différentes phases de croissance : les cellules en phase exponentielle ont un métabolisme


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TABLEAU II

Analysé de variance par un plan d'ordre III des populations cellulaires du tableau I, (a) des lots catalase

inactive et témoins; (b) des lots catalase active et inactive. Analysis of variance by a three-way layout with 10 repetitions for cell numbers at the 7th day reported in

Table 1. (a) for sets of control cultures and inactivated catalase treated cultures; (b) for sets of inactivated

catalase treated cultures and activated catalase treated cultures.

Source

de variation S.C.E. d.d.l. CM. F. p

(a)

Catalase inactive 603,35 1 603,35 77,95 < 0,001

Age 444,93 1 444,93 57,48 <0,001

Milieu ..... 125,75 1 125,75 16,25 <0,001

Cat. i x âge...... , 25,367 1 25,367 3,28 N.S.

Cat î x milieu 1,5985 1 1,5985 0,206 N.S.

Age x milieu ... . 1711,477 1 1711,477 221,12 < 0,001

Cat. î x âge x milieu 12,048 1 12,048 1,56 N.S.

Résiduelle 557,584 72 7,74

Totale 3482,104 79

(b)

Catalase active 61,6 1 61,6 8,41 <0,01

Age 1012,464 1 1012,464 138,31 <0,01

Milieu 13,284 1 13,284 1,81 N.S.

Cat. e x âge 3 330,78 1 3 330,78 455,02 <0,001

Cat. a x milieu. 259,921 1 259,921 35,51 <0,001

Age x milieu . . 1144,585 1 1144,585 156,36 <0,001

Cat. a x âge x milieu 129,54 1 129,54 17,7 <0,001

Résiduelle 527,120 72 7,32

Totale 6479,294 79

principalement photosynthétique, tandis qu'en phase de décélération elles présentent un métabolisme principalement respiratoire, en catabolisant les sucres de réserve par la voie des pentoses phosphate et de fortes activités d'enzyme de défense contre les peroxydes (superoxyde dismutase, glutathion réductase) [3]. La disparition de la stimulation après addition de catalase nous permet de conclure que le peroxyde d'hydrogène présent dans le milieu irradié est responsable de la stimulation de croissance produite quand celui-ci est utilisé.

À l'opposé, le fait que la catalase n'ait pas d'effet sur l'inhibition de croissance observée sur les cellules exponentielles laisse supposer que d'autres radicaux libres pourraient être impliqués dans le mécanisme d'action des faibles doses. Différents auteurs ont conclu à la nécessité d'interactions entré les différents radicaux libres (O2, H2O2, OH) pour expliquer les dommages causés par de fortes doses d'irradiation sur les spores bactériennes ([8], [9], [10]).

Participation aux expériences : Michelle Murat, Guy Farré, René Rousselle et Rosita Jourdan. Reçue le 28 avril 1986.

RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES

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Laboratoire de Biologie médicale, Faculté de Médecine, Toulouse-Purpan,

37, allée Jules-Guesde, 31000 Toulouse.


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GÉNÉTIQUE. — Absence de liaison entre la maladie d'Alzheimer et le système HLA. Note de Jean-Yves Muller, Sylvie Clémenceau, Jean-François Foncin, Denise Salmon, Liliane Hallé, Françoise Castellano et Charles Salmon, présentée par Jean-François Bach.

L'étude d'une famille dans laquelle de nombreux cas de maladie d'Alzheimer ont été observés fournit un moyen précieux pour préciser la transmission génétique de cette maladie et son éventuelle liaison avec un marqueur génétique. La détermination du groupage HLA des membres d'une branche de cette famille dans laquelle 10 cas de MA ont été observés permet de conclure qu'il n'y a pas de rapport génétique simple entre cette affection et le système HLA. Une liaison avec un locus unique responsable d'une maladie se transmettant sur un mode dominant peut être exclue. Par contre une influence plus complexe de la région HLA dans la survenue de la maladie ne peut être totalement éliminée.

GENETICS. — Absence of lintage between the Alzheimer's disease and the HLA System.

The study of a family in which multiple cases of Alzheimer's disease occured in several generations offers the opportunity to test the genetic transmission of this disease. The HLA grouping of the members of a pedigree containing 10 affected members allowed to demonstrate that the disease is not due to a single dominant gene linked to the major histocompatibility complex. Although a more complex involvemènt ofthe major histocompatibility complex cannot be totaly ruled out it is obvious that a strong linkage does not exist between Alzheimer's disease and HLA.

INTRODUCTION. — L'étiologie de la démence progressive décrite en 1907 par Alzheimer [1] demeure mystérieuse. A partir d'un même tableau neuropathologique de la maladie d'Alzheimer (MA) On distingue les formes précoces de la quarantaine, des formes tardives qui correspondent à la démence sénile du type Alzheimer, de loin la plus fréquente des démences de l'âgé avancé. Et on oppose aux cas sporadiques les formes familiales qui semblent se transmettre sur un mode autosomique dominant ([3], [4]). Nous rapportons ici une étude de liaison avec le complexe majeur d'histocompatibilité (CMH).

MATÉRIEL ET MÉTHODES. — La famille étudiée est d'origine calabraise et a des ramifications en France et en Amérique du nord [5]. Les branches américaines et européennes furent décrites respectivement par Féldman et coll. en 1963 [6] et Foncin et Supino-Viterbo en 1973 [7]. Ce n'est qu'ultérieurement que ces deux pedigrees furent rapprochés. Notre étude repose sur la partie de cette famille représentée dans l'arbre généalogique de la figure. Tous ses membres descendent d'un ancêtre commun (I1) grand-père de la proposante (IIIl3) décédé comme elle de MA- Seules les générations I, II, III sont informatives pour ce qui est de la MA; par contre les générations IV et V permettent de préciser les haplotypes HLA. Les sujets mformatifs pour la MA sont : 1° à la première génération I1; ancêtre commun décédé de MA; 2° à la deuxième génération trois sujets atteints et décédés 2, 4, 6. A cette même génération un malade et cinq sujets biens portants n'ont pu être examinés. Aucun des sujets de la première et de la deuxième génération atteints n'a été groupé mais leur génotype a été reconstitué à partir des spécificités transmises à leur descendance. Par contre le phénotype de II5 a été déterminé. Dans la troisième génération les sujets 2, 4, 5, 7, 8, 9, 10 et 14 ont été groupés. C'est essentiellement sur les descendants de II6 que l'étude de liaison avec le système HLA a pu être menée car deux malades vivants ont été phénotypés (IIIg et III10). Le diagnostic de MA a été retenu sur les critères suivants: 1° cliniques et ànatomiques pour III13 10 8; 2° cliniques pour III11> 1, 6; 3° anamnestiques pour les patients des générations I et IL Pour la plupart d'entre eux le diagnostic est fondé sur l'observation clinique recueillie à l'hôpital psychiatrique dé Girifalco.

RÉSULTATS, - Les résultats sont résumés dans la figure et le tableau J. L'ensemble des membres des générations II et III sont nés avant 1933 et étant donné l'âge habituel d'éclosion de la maladie dans cette famille, on peut avoir la certitude que les deux sujets non atteints de ces deux générations seront indemnes. L'examen de cette généalogie suggère une transmission génétique dominante autosomique. L'examen de la descendance de II6 à elle seule permet d'établir l'indépendance de la maladie et du système HLA. En effet II6, qui possède les haplotypes HLA a/b, a transmis alternativement à ses descendants l'haplotype a ou l'haplotype b indépendamment de la MA. Deux de ces descendants ont

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pu être phénotypés directement alors que les phénotypes des autres ont été déduits. Un seul des haplotypes de II2 et II4 a pu être établi. Cet haplotype est a pour l'un et b pour l'autre; on ne peut exclure que l'un et l'autre ne soient pas génotypiquement a/b, et leur étude n'apporte pas d'information supplémentaire. Le phénotype de trois de leurs descendants a pu être déterminé. Les deux descendants de II4 : III4 indemne et III6 atteint, ont probablement reçu de leur parent atteint Fhaplotype b. De toutes façons ils sont HLA phénotypiquement et probablement génotypiquement identiques. Il est probable que III2 indemne a reçu de son père II2 atteint l'haplotype a ce qui est contre une liaison.

DISCUSSION. — L'existence d'une association des formes sporadiques de MA avec l'antigène HLA-B7 a été suspectée [8]. Cette association n'a pas été confirmée [9]. L'étude des formes familiales a également donné lieu a des conclusions discordantes ([2], [9]). Les résultats que nous rapportons ici montrent que dans la famille étudiée il n'y a pas de liaison étroite entre cette maladie et le CMH. En outré parmi les sujets atteints aucun ne possède l'antigène HLA-B7. Les discordances observées entre les résultats des différentes équipes pourraient être dues à l'existence de formes différentes de la maladie. Il est également possible que le déterminisme génétique des formes familiales et celui des formes sporadiques ne soient pas identiques. Enfin la consanguinité de certaines populations ou


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TABLEAU I

Diagnostic Année

,————— de Haplotype

Sujet Numéro 1 2 3 Atteint naissance Sexe Décès HLA

I^. ........... 108 + + 1864 M + ND

I2 . 109 - 1866 F + ND

II1 153 - 1893 F -f ND

II2 ...... 154 + + 1891 - M + (a/?)

II3. 161 - 1893 F + ?

II4 162 + + 1894 M + (b/?)

II5 165 1893 F - c/d

II6. 166 + + 1895 M + (a/b)

III1 228 + - 1922 F + ND

III2 233 - 1930 M - (a/x)

III3 . . . . 1572 - 1938 F + ND

III4 236 - 1916 F - (bjx)

III5. :. 1418 - ? F - ?

III6.. 237 + + 1917. M + (bp.)

III7, 1201 - 1937 F - e/f

III8■'. . . . 250 + + 1933 M - blc

III9. ....:......,... . 1191 - 1935 F - g/h

III10 249 + + 1931 M - a/c

III11.. 246 + + 1926 F + (a/1)

III12... . . . 1177 - ? M - ?

III13 247 + + 1928 F + (b/c)

III14 1211 - 1925 M - j/k

IV1 1651 ? ? M - (a/x

IV2 - 1439 ?_ 1955 F b/x

IV3 1438 ? 1951 M - ?

IV4 1437 ? 1949 F - b/x

IV5 1205 ? 1967 M - e/c

IV6 1203 ? 1964 M - f/b

IV7 1202 ? 1962 F - e/b

IV8. . .1195 ? 1966 F - g/c

IV9 ... 1194 ? 1965 M - h/a

IV10 ... 1193 ? 1962 M - g/c

IV11 1185 ? 1950 F a/c

IV12 1212 ? 1965 M - b/j

IV14 1213 ? 1954 M - c/j

IV16 1216 ? 1961 M — b/j

IV17.. .....:.... . 1214 ? 1956 M - b/k

IV19 .... 1217 ? 1965 M - b/j

IV20.. . 1218 ? 1970 F - c/k

IV21 1219 ? 1972 F - b/k

V1 1434 ? 1977 . M - b/x

V2.. . . . . 1436 ? 1981 F - j/x

V3. 490 ? 1981 M - k/x

La colonne « n° » correspond au numéro de chaque sujet dans l'arbre généalogique informatisé. La colonne « diagnostic » correspond :

— pour 1 : à un diagnostic anamnésique;

— pour 2: à un diagnostic clinique;

'— pour 3 : à un diagnostic clinique et anatomique.

Les « ?» de la colonne « atteint » signifient que les sujets n'ont pas atteint un âge suffisant pour affirmer qu'ils sont indemnes de la maladie d'Alzheimer. La signification des lettres de la colonne « haplotype » est donnée dans le tableau II. In the column "No." is given the number of each individual in the computer file. In the column "diagnostic":

— 1 indicate an ànamnestic diagnosis;

— 2 a clinical one;

— 3 a clinical and an anatomical one.

In the column "atteint" the "?' means that the individual has not y et reached an age allowing to insure that he will be free of disease. The meaning of letters in the "haplotype column" is given in Table II.

familles étudiées complique souvent l'interprétation des faits. La transmission de la maladie dans notre famille est clairement indépendante du système HLA, cette indépendance a été constatée par d'autres [9] par contre les familles dans lesquelles une liaison


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TABLEAU II

Haplotypes présents dans la famille

HLA haplotypes found in the studied family

HLA A B DR HLA A B DR

a= , 1 W47 1 g= 3 W55 2

b= 1 38 W6 h= 24 44 7

c= 3 35 W6 i= W33 35 . 4

rf= W33 - 8 j= 2 39 6

e= 24 49 W6 k= 24 14 W6

f= 2 35 4

est suspectée ne sont pas absolument démonstratives. On ne peut toutefois exclure, comme le suggère Weitkamp et coll. [2] que les formes familiales ne soient elles mêmes hétérogènes et que parfois le CMH puisse jouer un rôle. En effet l'excès de cas observés dans certaines familles consanguines suggère une transmission plus complexe qu'une simple hérédité mendélienne dominante. Dans la fratrie présentée ici il n'y a pas de consanguinité connue. Toutefois l'ensemble de cette famille est originaire d'une zone géographique limitée et l'on ne peut exclure l'existence d'une endogamie sous-jacente. L'ensemble de nos observations est en faveur d'une transmission dominante indépendante du CMH. Reçue le 7 avril 1986.

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Centre national de Transfusion sanguine, Institut,

Laboratoire d'Immunologie,

6, rue Alexandre-Cabanel, 75015 Paris.


C, R. Acad Paris, t 303, Série III, n° 4, 1986

109:

IMMUNOLOGIE—Absence de fixation in vivo de l'acide désoxyribonucléique sur la^z membrane basale glomérulaire chez la souris C57BL/6. Note de Rosa Cukier, Marie Osborne-Pellegrin et François Trou, présentée;par Jean-François Bach.

L'injection par voie : aortique de l'acide d.ésoxyribonucléique (ADN) radiomarqué chez la souris normale - C57BL/6 ayant reçu 48 h auparavant une injection de lipopolysaccharides bactériens induit un dépôt rénal d'ADN comme cela a été précédemment rapporté. L'étude autoradiôgraphique des reins des souris ainsi traitées n'a pas permis de démontrer que l'ADN radiomarqué localisé dans le rein se fixe de façon élective sur la membrane basale glomérulaire. Ces résultats pourraient faire reconsidérer l'hypothèse de la formation in situ. des complexes immuns ADN-anti-ADN récemment proposée comme le mécanisme lésionnél au cours du lupus èrythémateux disséminé.

IMMUNOLOGY. —Absence of in irào DNA binding to the glomerular basai membrane in CS7BL/6 mice.

The intradortic injection of radiolabeled deoxyribonuclëic acid (DNA) into C57BL/6 mice treated with bacterial lipopolysaccharides 48 hrs. before, induced the renal deposition of DNA, as previously reported.

Autoradiographic studies of the kidneys obtained from such mice did not demonstrate a selective binding of radiolabeled DNA to the glomerular basal membrane. These results argue againsl the in situ formation of DNA: ; anti-DNA immune complexes which is a proposed mechanism in the development of tissue lesions in the course of systemic lupus erythematosus.

INTRODUCTION. — Le lupus èrythémateux disséminé (LED) est une affection Caractérisée par la production d'autoanticorps et le dépôt tissulaire d'immunoglobulines. Les lésions rénales sont fréquentes, principalement glomérulaires. Leur mécanisme reste encore inconnu. Les travaux de Koffler chez l'Homme [1] et ceux de Lambert et Dixon chez la souris (NZB x NZTW) F1 modèle murin de LED [2] suggèrent que ces lésions sont induites par lé dépôt glomérulaire de complexes immuns circulants formés d'acide désoxyribonucléique (ADN) et d'ânticorps anti-ADN.

Des données expérimentales récentes ([3], [4]) ont conduit à proposer que les dépôts glomérulaires d'ADN et d'anti-ADN sont issus non pas de complexes circulants mais de ; complexes formés localement après que l'ADN se fixe sur la membrane basale glomérulaire. »

Récemmeht, nous avons tenté de vérifier l'hypothèse de la formation in situ de complexes ADN-anti-ADN. Des souris normales C57BL/6 ont reçu successivement par voie vasculairede l'ADN dans des conditions permettant sa localisation rénale [3] et des anticorps monoclonaux murins anti-ADN obtenus par hybridation cellulaire à partir de rate de souris B/W [5]. Aucun dépôt glomérulaire d'immunoglobulines n'a été observé [6].

Dans ce modèle, l'un des facteurs pouvant rendre compte des résultats négatifs observés est l'absence de dépôts glomérulaires de l'ADN pourtant localisé dans le rein. Nous avons donc étudié par autoradiographie, la topographie intrarénale de l'ADN localisé dans le rein après son injection mtraaortique chez la souris normale C57BL/6.

^MATÉRIEL ET MÉTHODES. — Souris. - Les expériences ont été réalisées chez des souris femelles C57BL/6 âgées de 5 semaines (18-20 g) (C:E.A.L.-C-N,R.S;, Orléans-La Source, France).

Lipopolysaccharides. — Du lipopolysaccharide (LPS) de Salmonella typhimurium lyophilisé (Laboratoires DIFCO, Détroit, Michigan) est dissous dans du sérum-physiologique dilué à la concentration de 500 ug/ml. 200 ni sont injectés aux souris C57BL/6 par voie.intrapéritonéale.

ADN, — Les ADN radiomarqués utilisés sont le 3H-ADN double brin du bactériographe lambda (ds ADN A,) dont l'activité spécifique est de 5,6 uCi/mple et le 3H-ADN simple brin du virus fd (ss ADN fd) dont l'activité spécifique est de 20,5 uCi/mole P (Miles, Ehlkart, U.S.À.).

Protocole d'injection du LPS et de VADN radiomarqué. — 48 h après une injection intrapéritonéale de LPS, les souris C57BL/6 sont ànesthésiées au pentobarbital sodique. Après ouverture de la cavité abdominale, l'aorte

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TABLEAU

Localisation rénale de l'ADN radiomarqué injecté par voie intraaortique chez la souris C57BL/6.

Rénal localization of3H-DNA administered into the aorta in LPS primed C57BL/6 mice.

Nombre

de reins Temps Résultats

Groupe étudiés Dose/souris (b) (c)

l ,UJ A™ 4 3000° 2 4100 + 8245

3H"dsADN 4 30000 6 5592±1302

LPSC)

IV *™ 2 3000° 6 6322

1 3H-ss ADN 2 450000 20 52070

( . 3H-ds ADN 4 30000 6 2530+552

Sans LPS

( BBS. . . 8 0 20 1247+125

(a) 100 ug de lipopolysaccharide de Salmonella typhimurium ont été injectés par voie intrapéritonéale au jour 0. Les injections intraaortiques ont été faites deux jours plus tard.

(b) Temps séparant l'injection d'ADN radiomarqué de la fixation à la glutaraldéhyde.

O Quantité de cpm par gramme d'organe (moyenne ± une déviation standard) après perfusion par la solution de glutaraldéhyde à 5 %.

C) 100 ug of S. typhimurium lipopolysaccharides were injected intraperitoneally on day 0. Intraaortic injections were performed on day 2.

(b) Time separating 3H-DNA injections from glutaraldéhyde fixations.

(c) cpm per gr of kidney (mean + S.D.) after the glutaraldéhyde fixation.

est disséquée et isolée au-dessus et au-dessous des artères rénales. Les artères hépatique et mésentérique supérieure sont ligaturées. L'aorte est clampée au-dessus de la naissance des artères rénales. Un cathéter héparinisé est introduit dans l'aorte et son extrémité placée au-dessus de l'émergence des artères rénales. 30000 cpm de 3H-ds ADN X (4 souris) ou de 3H-ss ADN fd (2 souris) ou 450000 cpm de 3H-ss ADN fd (4 souris) sont injectés par le cathéter. Immédiatement après l'injection le clamp aortique est levé et la circulation rétablie. Après 2, 6 ou 20 mn selon les animaux, l'aorte est reclampée et les veines rénales sectionnées. 10 ml d'une solution de Tyrode sont injectés par le cathéter afin d'éliminer la radioactivité présente dans la circulation. Puis 5 ml d'une solution de glutaraldéhyde à 5 % sont injectés afin d'obtenir une première fixation.

Pour chaque souris ainsi traitée, l'un des reins est prélevé pour évaluer la quantité de radioactivité rénale totale retenue. Brièvement, le rein est chauffé à 37°C pendant 20 mn, puis mélangé à 200 ul de soluène 350 (Packard). La suspension est maintenue 5 jours à 37°C, ce qui permet la dissolution complète du rein. 10 ml de liquide scintillant sont ajoutés et la solution est neutralisée par l'acide acétique. La radioactivité est évaluée dans un compteur à scintillation. Les résultats sont exprimés en cpm : gramme d'organe.

Le rein controlatéral est coupé en morceaux de 1 mm 3 et fixé dans une solution de glutaraldéhyde à 5 % pendant 45 mn. Après rinçage rapide par du tampon phosphate, une seconde étape de fixation est effectuée par le tétroxyde d'osmium à 2 % pendant 1 h. Le tissu est ensuite déshydraté et inclus dans 1' « Epon ». Des coupes de 1 um sont recouvertes d'émulsion Ilford KS et exposées en présence de P205 à la température ambiante pendant 5 à 8 semaines. Après développement et fixation, les coupes sont colorées par une solution de bleu de toluidine à 0,5 % et examinées en microscopie photonique.

RÉSULTATS. — Le tableau montre la quantité de radioactivité retenue au niveau du rein après injection de 3 H-ss ADN et de 3 H-ds ADN. L'augmentation du temps de circulation du 3 H-ss ADN, c'est-à-dire du temps séparant l'injection de 3 H-ds ADN de la fixation à la glutaraldéhyde ne permet pas.d'obtenir une augmentation significative du nombre de cpm par gramme d'organe.

En revanche, dans l'expérience utilisant le 3 H-ss ADN, l'augmentation de la quantité de radioactivité injectée et du temps de circulation de l'ADN radiomarqué permet d'obtenir une localisation rénale importante de radioactivité. Dans tous les cas, le nombre de cpm par gramme d'organe autorise une étude autoradiographique.


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L'analyse des coupes des reins des souris injectées avec le 3 H-ds ADN ou avec le 3 H-ss ADN n'a révélé aucun grain d'argent au niveau des structures glomérulaires, plus particulièrement au niveau de la membrane basale glomérulaire. Seuls quelques grains ont été observés au niveau des artérioles de moyen calibre; présentes sur différentes

coupes.

DISCUSSION. — Nous avons observé, comme cela a été, précédemment rapporté [3], qu'une partie de l'ADN injecté par voie vasculaire se dépose dans le rein chez la souris normale C57BL/6 traitée par le LPS. Cette observation, ainsi que lé modèle de glomérulonéphrite induite par l'injection isolée de LPS bactériens chez la souris normale [4] et la démonstration in vitro d'une affinité du ss ADN- pour le collàgène de la membrane basale glomérulaire (3), ont conduit à formuler l'hypothèse que la formation in situ des complexes immuns ADN- anti-ADN est un mécanisme possible des lésions glomérulaires au cours du LED. Cette hypothèse est aujourd'hui acceptée.

Dans cette étude, l'injection de l'ADN par voie aortique après ligature des artères hépatique et mésentérique supérieure empêche sa captation préférentielle par le foie et permet ainsi une circulation prolongée de l'ADN radiomarqué et le dépôt d'une quantité importante de radioactivité au niveau du rein. Ces conditions expérimentales, compte tenu de notre expérience antérieure [7], autorisent une analyse autoradiographique.

L'étude autoradiographique des coupes du rein n'a pas permis d'observer, malgré la quantité de radioactivité retenue par le rein, dé dépôt au niveau de la membrane basale glomérulaire ou du capillaire glomérulaire. Les rares dépôts observés au niveau des artérioles de moyen calibre témoignent de la validité de la technique utilisée.

Compte tenu de la sensibilité de la technique utilisée, il est légitime de considérer que si la quantité de radioactivité retenue par le rein était fixée de façon élective et massive au niveau de la membrane basale glomérulaire, la présence de grains d'argent aurait dû être observée au niveau de ces structures. La négativité de cette étude autoradiographique suggère une distribution plus diffuse de la radioactivité dans le parenchyme rénal, et dans les conditions expérimentales utilisées, l'absence de fixation in vivo d'ADN à la membrane basale glomérulaire.

Cette observation peut rendre compte des résultats négatifs dans notre modèle tentant de vérifier l'hypothèse de l'antigène planté ou l'injection successive, chez la souris normale traitée par le LPS, d'ADN et d'anticorps monoclonaux murins anti-ADN n'induit pas de dépôt d'immunoglobulines [6].

D'une façon générale, la présence d'ADN au sein des dépôts glomérulaires n'a jamais été démontrée de façon convaincante, tant chez l'homme atteint de LED qu'au cours des modèles expérimentaux spontanés ou induits faisant intervenir soit des complexes immuns circulants ADN - anti-ADN soit la formation in situ dé ces complexes.

Notre observation jointe à la démonstration récente qu'un anticorps monoclonal anti-ADN murin reconnaît une protéine, présente à la surface de certaines cellules ([8], [9]), et au niveau du glomérule normal [10] permet d'envisager un mécanisme pathogène nouveau pour les anti-ADN : leur fixation directe à Une structure glomérulaire sans dépôt préalable d'ADN. Reçue le 21 avril 1986.

RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES

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R. C. : Professeur à l'Université Fédérale de Rio de Janeiro, Brésil,

Boursière du CNPq, Brésil;

M. O.-P. : I.N.S.E.R.M. U n° 90, Hôpital Necker, 149, rue de Sèvres, 75015 Paris;

F. T. : I.N.S.E.R.M. U n° 25, Hôpital Necker, 149, rue de Sèvres, 75015 Paris.


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HÉMATOLOGIE. — L'anticoagulant circulant de type lupus, facteur de risque thrombotique par inhibition de l'activation de la protéine C. Note de Roger Cariou, Gérard Tobelem et Jacques Caen, présentée par Jean Bernard.

L'anticoagulant circulant de type lupus est un autoanticorps qui représente un facteur de risque thrombôtique imparfaitement compris. L'endothélium, surface non thrombogène, pourrait être la cible privilégiée de cet anticoagulant circulant.

Nous avons éprouvé l'effet des immunoglobulines G purifiées (IgG) de cinq patients ayant un anticoagulant de type lupus, sur l'activité de la thrombomoduline (TM) des cellules endothéliales humaines en culture, la TM étant un cofacteur indispensable à l'activation de la protéine C (PC) par la thrombine.

Le taux d'activation de la PC purifiée (30 nM) par les CE en présence de thrombine (0,1 U/boîte) était mesuré par méthode amidolytique (S 2366). Dans ces conditions, la PC activée était de 7,37+0,78 pmoles.ml-1.h- 1 en présence d'IgG de témoins (2 mg/boîte). Des agrégats d'ïgG témoins n'induisaient aucune inhibition. Par contre, les IgG de nos cinq patients inhibaient l'activation de la PC (4,86 + 1,04 pmoles,ml_i.h- 1; p<0,001), Les fragments Fab des IgG de deux patients ont induit le même , effet inhibiteur.

L'addition de phospholipides (70 % phosphatidyl choline, 30 % phosphatidyl serine) en excès aux IgG d'un : patient devait neutraliser cet effet inhibiteur.

L'activation de la PC a été étudiée en présence de thrombomoduline purifiée de lapin, et la même inhibition par les IgG des cinq patients fut retrouvée. La diminution de l'activation de la PC par les anticoagulants circulants de type lupus pourrait intervenir dans la pathogénie des thromboses.

HEMATOLOGY. — Lupus anticoagulant, risk factor of thrombosis by inhibition of protein C activation.

The lupus anticoagulant is a risk factor of thrombosis. The non thrombogenic endothelial surface could be a target for the lupus anticoagulant. We have investigated the effect of purified immunoglobulins G of five patients with LA on the thrombomodulin activity of cultured human endotheliàl cells from umbilical cord vein.

The rate of activation of purified protein C (PC) (30 nM) by the endotheliàl cells in thé présence of thrombih (0.1 U/dish) has been measured by hydrolysis of substrate S 2366. Activated PC has been 7.37+0.78 pmoles. ml' 1, h- 1 in the presence of buffer and 7.2 + 0.78 pmoles. ml' 1. h- 1 in the presence of control IgG (2 mg/dish). Beat aggregated IgG did not induce any significant change, Patient's IgG lowered significantly the rate of PC activation (4.86 ±1.04 pmoles.ml- 1 .h~x, p< 0.001). Fab fragment from two of these patient's . IgG displayed the same inhibition. Moreover neutralization of this effect was obtained by addition of phospholipids (70% phôsphatidylchôline, 30% phosphatidylserine) in excess to patient's IgG. Activation of PC has been also performed using purified rabbit thrombomodulin and a similar inhibition by patient's IgG was found. These results seem to indicate that antibodies present in the IgG fractions containing. LA could be directed against phospholipids associated to thrombomodulin activity. Reduction of PC activation if present in the patients with LA could play a role in the occurence of thrombosis.

Les anticoagulants circulants de type antiprothrombinase ou de type lupus (ACC) sont le plus souvent décelés dans la plasma de patients présentant une pathologie auto-immune [1], Ces anticoagulants paraissent dirigés contre des phospholipides et plus précisément un déterminant antigénique commun à plusieurs structures polynucléotidiques et phosphonpidiques [2]. La grande fréquence des manifestations thrombotiques lié à l'ÀCC fait de cette anomalie biologique, un état préthrombotique. Néanmoins le mécanisme des thromboses survenant chez ces patients demeure inconnu.

L'endothélium vasculaire qui joue un rôle antithrombotique [3] essentiel, pourrait être la Cible de ces anticorps responsable d'une fausse activité anticoagulante in vitro. Ainsi, une diminution de la synthèse de prostâcycline induite par les IgG de patients avec ACC a été mise en évidence [4]. Mais ces résultats sont aujourd'hui contestés ([5], [6]).

D'autres fonctions de la cellule endothéliale pourraient donc être concernées, comme la synthèse d'âctivateur tissulaire du plasminogène [10] et l'activité de la thrombomoduline [11].

Nous avons ainsi recherché un éventuel effet des fractions IgG de patients présentant un ACC sur les cellules endothéliales humaine en culture et la thrombomoduline purifiée de lapin.

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Dans ce travail, nous rapportons une réduction de l'activation de la protéine C dépendante de la thrombomodulirie.

MATÉRIEL ET MÉTHODES. — La protéine C bovine (PC) nous fut gracieusement donné par A. Bezaud et M. C. Guillin (Paris). La protéine C humaine provenait de G. Soff et U. Seligsohn (Tel Aviv) puis du laboratoire Stago (Asnières, France). La thrombomoduline (TM) fut isolée du lapin suivant la méthode décrite par Esmon [7].

La protéine A sépharose CL4B était un produit Pharmacia (Upsala, Suède). Le Lpyro glutamyl L propyl p nitroanilide hydrochloride (S 2366) et l'héparine étaient des produits kabi Vitrum (Môlndal, Suède). L'antithrombine III (AT III), le kaolin, la céphaline étaient fourni par le laboratoire Stago (Asnières, France). Le limulus test était un produit du laboratoire Bioproduce (Walkville, Ma).

Tests de coagulation et purification des immunoglobuline G. — Le sang veineux des témoins et des malades fut prélevé sur citrate trisodique 3,8 % (9:1, V: V) et centrifugé à 2500 g à 4°C durant 20 mn, permettant d'obtenir un plasma pauvre en plaquettes.

L'étude de la coagulation fut réalisée par l'utilisation des méthodes conventionnelles. L'existence d'un inhibiteur du temps de céphaline activé (TCA) fut décelé par la méthode modifiée décrite par Hardisty et Ingram [8].

L'activité anticoagulante était ensuite décelée dans la fraction immunoglobulines G purifiée (IgG) par un TCA modifié.

Les plasmas d'un « pool » de donneurs sains ou de nos patients présentant un ACC, furent utilisés pour la purification des IgG par chromatographie d'affinité sur protéine A sépharose CL4B [9].

Des fragments Fab furent préparés pour les IgG normales et de deux patients présentant un LED par digestion à la papaïne et chromatographie sur protéine A sépharose.

Des agrégats d'IgG furent préparés par chauffage des IgG purifiées à 63°C durant 20 mn.

L'absence d'endotoxine dans les milieux de culture et les préparations d'IgG fut vérifiée par la négativité du limulus test.

Cultive de cellules endothéliales. — Les cellules endothéliales humaines furent récoltées à partir de la veine du cordon ombilical par digestion à la collagénase et cultivées selon une méthode antérieurement décrite [10].

Activation de la protéine C par les cellules endothéliales. - Les cellules endothéliales confluentes étaient lavées trois fois avec le tampon PBS avant d'être incubées en présence de tampon ou des IgG (2 mg/boîtes). .Après 1 h d'incubation à 37°C, le surnageant était entièrement enlevé et trois autres lavages étaient effectués. L'activation de la PC humaine (30 nM) était réalisée en tampon (750 ul/boite) contenant 0,15 M NaCl, 20 mM Tris HC1, 5 mM CaCl, pH 7,4, albumine bovine 2 mg/ml en présence de Ha (0,1 U/boite, 1,2 nM). Le surnageant était recueilli après 1 h d'incubation à 37°C et centrifugé en tube de propylène. La thrombine était neutralisée par l'AT III et l'héparine en excès.

Activation de la protéine C par la TM de lapin et la IIa. — Les IgG des témoins ou des patients étaient incubées durant 6 h à 4°C avec la TM de lapin (2,9 mM) dans 200 ul de tampon pH 7,4, 0,15 M NaCl 20 mM Tris HC1. Puis la thrombine (0,1 U, 1,2 nM) et la PC bovine (0,5 ug, 30 nM) étaient ajoutées dans 40 ul de tampon pH 8,1, 0,1 M Tris HC1, albumine bovine 1 % 25 mM CaCl2. Après 2 h d'incubation à 37°C, la thrombine était neutralisée par un excès d'AT III et d'héparine.

Dans ces conditions expérimentales, le taux de PC activée était dépendant de la concentration de TM.

L'activation de la PC indépendante de la TM, fut réalisée en milieu dépourvu de calcium avec la throbine seule (0.1 U).

Dosage de la PC activée. — Le taux de PC activée fut déterminé par méthode amidolytique. A 800 ul de tampon pH 8,1, 0,15 M NaCl 20 mM Tris HCl 10 mM CaCl2 albumine bovine 1 %, furent ajoutés 100 ul S 2366 (concentration finale 275 mM) et 100 ul de l'échantillon à éprouver. Le taux d'hydrolyse du S 2366 était évalué par l'absorption à 405 nM de la paranitroamilide (pNa) libérée.

Les résultats étaient exprimés en pmoles. ml" 1. h"' de PC formée.

RÉSULTATS. — Étude des patients. — Cinq patients avec ACC ont été étudiés. Tous avaient présenté plusieurs épisodes thrombotiques. Trois d'entre-eux présentaient un lupus erythémateux disséminé (LED) défini par les critères de l'American Rhumatism Association. Deux patients présentaient une pathologie thromboembolique récidivante sans autre maladie sous-jascente.

Dans tous les cas, l'activité anticoagulante fut retrouvée dans la fraction IgG purifiée.


PLANCHÉ I/PLATE I

ROGER CARIOU

Fig. 1

Fig. 2

Fig. 1 — Effet des immunoglobulines G de témoins et de cinq patients présentant un ACC sur l'activation de la protéine C dépendante de la TM. Les. cellules endothéliales étaient préincubées durant 1 h avec le tampon (O), les IgG des témoins (©), des agrégats d'IgG (ES) et avec les IgG contenant l'activité anticoagulante (A) ou leurs fragments Fab (A). Chaque point est la valeur moyenne d'au moins trois déterminations. : Dans un cas, les IgG d'un patient furent incubées, avec des phospholipides avant application sur les cellules endothéliales (□).

Fig. 1. — Effect of control and patients IgG on the TM dependent Protein C activation. The endothelial cells..

were preincubated 1 hr. with buffer (O) control IgG (©), heat aggregated IgG (S) and patients IgG fraction

containing lupus anticoagulant activity (A) or Fab fragments (A) from patients IgG. Each value is the mean

of at least three déterminations. In one case patients IgG have been preincubated with phospholipids before

addition to endothelial cells (□)•

Fig. 2. — Effet des immunoglobulines G sur l'activation de la protéine C par le complexe solublé Ha —TM. La TM fut préalablement incubées avec le tampon (O), les IgG témoins (.©) ou des cinq patients (A)- Chaque point est la moyenne de deux déterminations.

Fig. 2. — Effect of IgG on Protein C activation induced hy the II a-TM complexe. TM has been preincubated with buffer (Q) control IgG (©) or patients IgG (A)- Each value is the mean of at least two determinations.



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Activation de la PC par les cellules endothéliales en présence de II a. — Le taux de PC activée fut de 7,37+0,78 pmoles, ml- 1, h- 1 en présence d'un tampon (fig. 1). Aucune modification ne fut observée avec les IgG de témoins (7,2+0,78 pmoles.ml- 1, h- 1) ou des agrégats d'IgG (6,5pmoles.ml- 1 .h-1). Une diminution significative des taux de PC activée fut notée en présence d'IgG des cinq patients éprouvés (4,78 + 0,95 pmoles.ml-1.h- 1 p<0,001). La valeur moyenne; de l'inhibition était de

■ La même inhibition fut obtenue (4,5 ±1,15 pmoles ; ml ^.h - 1) en. présence de fragments Fab (2 mg/boîte) préparés chez deux malades.

Dans toutes ces expériences, aucune variation du nombre ou de la viabilité des cellules endothéliales ne fut observée.

Activation 4e la PC par la TM de lapin en présence de Ha. — Le taux de PC activée obtenu avec la thrombine et l'extrait de TM de lapin était de 5,7+0,91 pmoles. ml" 1. h- 1 en présence de tampon ou des IgG témoins (fig. 2). Une diminution significative des taux de PC activée fut obtenue en présence des IgG de nos cinq patients (2,97 pmoles.ml- 1, h- 1) soit une inhibition de 48 % (p<0,001).

Dans un système d'activation de la PC indépendant du calcium et de la TM, aucune inhibition ne fut retrouvée en présence d'IgG des patients.

Enfin, aucune préparation d'IgG (incubée avec différentes sources d'IgG) ne modifiait Fhydrolysè du S 2366.

DISCUSSION. — Au cours du LED, la présence d'un ACC prédispose au risque de complications thrombotiques. Ces ACC sont des anticorps dirigés contre les phospholipides et de façon plus précise contre la liaison phosphodiester liée au groupe phosphate [2]. La phosphâtidyl serine serait la cible privilégiée de ces anticorps [12]. L'activité anticoagulante est supportée par la fraction IgG des immunoglobulines comme nous l'avons observé pour nos cinq patients. Elle a cependant, dans d'autres publications, été attribuée à une IgM ou aux deux types d'immunoglobulines [13].

Différents travaux ont permis d'établir une relation entre la thrombose et l'ACC ([1], [3]). Cependant le mécanisme par lequel l'ACC induit une pathologie thrombotique demeure inconnue. L'endothélium vasculaire joue un rôle antithrombptique majeur et des altérations de ces fonctions pourraient être responsable de complications thrombotiques. Cinès et coll. [5] ont ainsi démontré la présence d'anticorps dirigés contre la cellule endothéliale dans le sérum de patients présentant un LED Une diminution de la production dé prostacyclihè a été obtenue par les IgG d'une patiente présentant des thromboses multiples et des avortements à répétition [4]. Cependant d'autres travaux n'ont pas confirmé ces résultats ([5], [6]). Paradoxalement, une augmentation de la production de PGI2 à pu être induite par des IgG de lupiques et par des anticorps anti-cellules endothéliales ([5], [14]). Dans d'autres pathologjes avec complications thrombotiques, une souffrance de l'endothélium vasculaire s'accompagnait de la même élévation de sécrétion de PGI2 ([15], [16]).

La protéine C joue un rôle physiologique antithrombotique en inactivant les facteurs Va et VlII a [17], et peut-être en augmentant l'activité fibrinolytique [18]. La thrombine est le seul activateur physiologique connu de la protéine C dans un milieu dépourvu de calcium [19]. Esmon et Owen ont décrit un cofacteur membranaire, la TM, présent à la surface de l'endothéhum vasculaire catalysant l'activation de la PC par la thrombine. L'existence d'un déficit en protéine C constitue un facteur de risque thrômbotique [20]. Il est cependant difficile d'évaluer in vivo, les capacités d'activation de la PC. Seul le


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dosage du dodécapeptide libéré lors de cette activation par protéolyse permettrait d'apprécier l'activité in vivo du complexe II a-TM [21]. Jusqu'à présent, aucune pathologie thrombotique n'est attribuée à un déficit en TM. L'utilisation des cultures de CE humaines nous a permis d'éprouver l'activité TM en présence de l'ACC de cinq patients ayant présenté des épisodes thrombotiques. Nous avons retrouvé une inhibition des taux de PC activée témoignant d'une inhibition de la TM. Cet effet était anticorps dépendant puisque les fragments Fag de ces immunoglobulines induisaient la même inhibition.

Les mêmes résultats obtenus avec la TM extraite de poumon de lapin, permettait d'éliminer un éventuel effet cytotoxique des IgG. Les anticoagulants du lupus pourraient être dirigés contre la TM ou plus vraisemblablement contre les phospholipides nécessaires à son activité.

Des travaux récents ont insisté sur le rôle des phospholipides que nos résultats paraissent confirmer [22]. L'addition de phospholipides aux IgG de nos patients a permis d'ailleurs de neutraliser l'effet inhibiteur sur l'activation de la PC.

Ainsi une diminution de l'activation de la PC présente chez les patients porteur d'un LED, pourraient favoriser la survenue de thromboses. Reçue le 7 avril 1986.

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Hôpital Lariboisière, Service d'Angiohématologie, I.N.S.E.R.M. U n° 150, 2, rue Ambroise-Paré, 75475 Pans Cedex 10.


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ENDOCRINOLOGIE. — Effets de l'insuline et de la somatomédine C sur la fonction des cellules de Leydig en culture. Note de Michel Rernier, Pierre Chatelain, Jenny P. Mathèr et José M; Saez, présentée par Étienne-Émile Baulieu.

Les cellules de Leydig de porc cultivées en milieu chimiquement défini, sans sérum, perdent, en l'absence d'insuline et de somatomédine C (Sm-C) (Insulin-like growth factor I) une partie importante de leurs récepteurs à l'hCG ainsi que leur capacité de réponse à cette hormone (AMP cyclique et testostérone). L'insuline (50 ng/ml) ou la Sm-C (10 ng/ml) sont capables de prévenir complètement aussi bien la diminution du nombre dé: récepteurs à l'hCG que la réponse de l'AMP cyclique induite par l'hCG; la réponse stéroïdogénique à l'hCG est partiellement maintenue. Cette réponse fonctionnelle des cellules de Leydig à l'hCG resté maximale lorsque les cellules sont prétraitées soit avec Sm-C (10 ng/ml) et insuline (50 ng/hil), Soit avec l'insuline seule à fortes concentrations (5 ug/ml). Ces résultats montrent que la Sm-C et l'insuline ont un rôle important dans le maintien de la réponse stéroïdogène des Cellules de Leydig à l'hCG, en augmentant le nombre de récepteurs d'hGG eten améliorant une ou plusieurs étapes de la stéroïdogenèse localicées au-delà de la formation d'AMP cyclique.

ÉNDOCRINOLOGY. — Ëffects of insulin and somatomedin C on cultured Leydig cell functions.

Porcine cultured Leydig cells (LC) lose hCG receptors and hCG responsiveness (cAMP and testpstérone) when tliey are cultured for three days in a defined medium without insulin or somatomedin C (Sm-C) (Insulin-like growth factor I). In the presence of insulin (50 ng/mf) or of Sm-C (10 ngjmt) the loss of the hCG receptor number and the decreased cAMP response to hCG were prevented, but the steroidogënic response to hCG was only partiaUy prevented. This parameter became normal when cells were prëtreated with either Sm-C (10 ng/ml) plus insulin (50 ng/ml) or with insuline alone at high concentrations (5 iig/inî). These results indicate that both Sm-C and insulin acting ihrough their own recéptors increase Leydig cell steroidogënic capacity by increasing hCG receptor number and imprpving somestepbeyond cAMP formation.

Le rôle potentiel qu'exerce l'insuline sur la fonction des cellules de Leydig est suggéré par des données expérimentales multiples. Le testicule contient des récepteurs spécifiques à l'insuline [1] et ces récepteurs sont régulés de façon positive par les taux plasmatiques de LH ([2], [3]). Le diabète expérimental s'accompagne d'une diminution de la concentration plasmatique de testostérone [4], d'une diminution de la réponse stéroïdogénique à la stimulation par l'hCG [5] et d'une réduction du nombre de récepteurs LH/hCG dans le testicule [5]. L'administration d'insuline à des animaux diabétiques fait disparaître la plupart de ces anomalies testiculaires [5]. Des expériences ont montré que l'insuline exerce une action synergique avec l'hCG sur la production de testostéroné par des cellules testiculaires de rat en culture primaire ([6], [7]). Cependant, étant donné que les concentrations d'insuline requises dans ces derniers travaux étaient assez élevées (10~ 8 à 10~6M), on peut se demander si les effets ainsi induits par l'insuline étaient exercés par l'intermédiaire de ses propres récepteurs ou par l'intermédiaire des récepteurs à la somatomédine C/insulin-like growth factor I (Sm-Ç), lesquels sont capables de lier et répondre à l'insuline lorsque cette hormone est présente à des concentrations élevées ([S], [10]).

Dans ce travail, nous avons étudié les effets de l'insuline et de la Sm-C sur la fonction spécifique des cellules de Leydig de porc maintenues en culture dans un milieu chimiquement défini.

MÉTHODES. — Les cellules de Leydig ont été isolées [11] et purifiées [12] à partir de testicules de porcelets de 3 à 4semaines. Les cellules sont cultivées pendant 36 h dans le milieu basai suivant: HAMF-12/DME (1:1) contenant de la transferrine (5 ug/ml), de la vitamine E (200 ng/ml), milieu basai auquel on ajoute de l'insuline (5 ug/ml). Ensuite les cellules sont cultivées dans le milieu basai en absence ou en présence d'insuline ou de Sm-C pendant 3 jours. A la fin de chaque expérience, la liaison de l'hCG-125I [11] et la réponse aiguë (production d'AMP cyclique et de'testostéroné) à une concentration maximale d'hCG (10-9M) [12] ont été étudiées. La Sm-C a été purifiée à partir de plasma humain [13].

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RÉSULTATS. — Les cellules de Leydig cultivées dans le milieu F-12/DME basai en présence d'insuline (5 ug/ml) maintiennent pendant 1 semaine leurs récepteurs à l'hCG et leur capacité de réponse à cette hormone ([14], [15]). Au contraire, lorsque les cellules de Leydig, après une période initiale de 36 h, sont cultivées en milieu basal en l'absence d'insuline pendant 3 jours, le nombre de récepteurs à l'hCG et la réponse stéroïdogénique à cette hormone diminuent de façon très importante ( fig.). La diminution de liaison de l'hCG est due à une diminution du nombre de récepteurs sans modification de l'affinité de l'hormone pour son récepteur (KD = 2.10-10M contrôle et 3.10-10M sous insuline). De même, la diminution de la réponse stéroïdogène à l'hCG est due à une diminution de la réponse maximale, sans modification de l'ED50 (~10- 11 M).

Étant donné qu'aux concentrations élevées utilisées (5 ug/ml), l'insuline peut agir par l'intermédiaire des récepteurs à la Sm-C ([8]-[10]), nous avons étudié les effets respectifs de concentrations physiologiques d'insuline et de Sm-C (tableau). Les résultats montrent que la perte de récepteurs observée lorsque les cellules sont cultivées en absence d'insuline est prévenue par l'insuline et/ou la Sm-C. Les faibles concentrations d'insuline (50 ng/ml) sont aussi actives que les fortes doses (5 ug/ml). Par ailleurs, ces effets de l'insuline et de la Sm-C ne sont pas additifs. La production d'AMP cyclique, en réponse à l'hCG, par les cellules cultivées en absence d'insuline est très faible. Par contre la réponse à la forskoline n'est pas modifiée. Le traitement des cellules avec l'insuline et/ou la Sm-C rétablit la réponse à l'hCG, sans modifier la réponse à la forskoline. A nouveau aux concentrations physiologiques, l'insuline et la Sm-C n'ont pas d'action additive. La capacité stéroïdogénique des cellules incubées en absence d'insuline est très diminuée.

Jours de culture

Effet de l'absence d'insuline sur le nombre de récepteurs à l'hCG (©) et la réponse stéroïdogénique à cette hormone (A) des cellules de Leydig de porc en culture. Après 36 h de culture dans le milieu F-12/DME complet (J-0), les cellules sont cultivées dans le même milieu sans insuline. Le nombre de récepteurs à l'hCG et la réponse stéroïdogénique à cette hormone (10~9M) ont été mesurés tous les jours. Les résultats (moyenne ± erreur standard) sont exprimés en % du J-0.

Effect of the absence of insulin on hCG receptor number (©) and hCG steroidogënic responsiveness (A) of cultured pid Leydig cells. Cells were cultured for 36 hrs. in complete F-12/DME médium (J-0), then in the saine medium without insulin. The hCG receptor number (©) and the hCG-induced testostérone production were measured daily. The results (m±SEM) are expressed as % of day-0 (J-0).


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TABLEAU

Effets de l'insuline (In) et de la Sm-C sur les cellules de Leydig de porc :

Etude du nombre de récepteurs à l'hCG et de la réponse à l'hCG ou à la forskoline

Effects of insulin (In) and Sm-C on hCG receptor number and hCG or forskolin responsiveness of cultured pig Leydig cells

AMPc Testostérone

(pmoles/30 mn/106 cellules) (ng/4 h/106 cellules)

Conditions de culture (cpm. 10_4/106 cellules) Forskoline hCG Forskoline hCG

Milieu basal + 5 ug/ml In 13,2+1,2 28+2 55,4+5 76±6 110 + 7

Milieu basai-In. . 1,5 + 0,3 25 + 2 6,2+_0,2 23 + 2 10 + 2

(°) (a) (a)

Milieu basal + 50 ng/ml In. : 13,2±1,1 29 + 3 54 +3 40 + 5 61+4

(b) (b)

Milieu basal+10 ng/ml Sm-C. 11,6+1,2 26 + 4 52+3 66 + 4 79 + 6

( b) (b)

Milieu basal + 10ng/ml Sm-C+50 ng/ml In, 12,4+1,4 27 + 2 55+4 77 + 6 106 + 7

Les cellules ont été cultivées pendant 3 jours dans les conditions indiquées. La liaison de l'hCG-125I (10 9M) et la réponse à l'hCG (10 9M) et à la forskoline (10- 5 M) ont été mesurées. Chaque valeur représente la moyenne+erreur standard de trois puits.

Celles were cultured for three days in complete F-12/DME medium or in the same medium without or with the indicated concentrations of In and/or Sm-C. Then the binding of 125I-hCG (10~9M) and the acute response to hCG (10- 9 M) or forskolin (\0~ 5 M) were studied. The values are the mean+SEM of triplicate dishes.

(a)p< 0,0001 comparé aux cellules cultivées en F-12/DME complet. (*) p<0,05 comparé aux cellules cultivées en F-12/DME complet.

Cependant la réponse à l'hCG est alors beaucoup plus diminuée que celle à la forskoline. Le traitement par la Sm-C ou par l'insuline à faibles concentrations rétablit partiellement la réponse aux deux agents stimulants. Cependant une réponse normale est observée uniquement en présence de fortes concentrations d'insuline ou lorsque la Sm-C et l'insuline à faibles concentrations sont associées.

DISCUSSION, — L'insuline ou la Sm-C sont indispensables aux cellules de Leydig pour le maintien des récepteurs de Sm-C et la réponse de l'adénylate cyclase à cette hormone. Ces effets sont observés à des concentrations physiologiques, aussi bien pour l'insuline que pour la Sm-C. Des études complémentaires utilisant l'insuline et la Sm-C marquées nous ont permis de mettre en évidence l'existence dans les cellules de Leydig de porc de récepteurs spécifiques et distincts pour ces deux hormones [15]. Nos résultats suggèrent que, à la concentration utilisée, l'action biologique de Sm-C sur les cellules de Leydig passe par son propre récepteur. L'action de l'insuline sur le nombre de récepteurs d'hCG et sur la production d'AMP cyclique passe probablement par ses propres récepteurs car les effets maximaux sont observés à 50 ng/ml (8.10"9M), concentration qui est compatible avec le KD de l'insuline pour ses récepteurs testiculaires (KD = 10-9M) [1].

La diminution de la réponse stéroïdogénique à l'hCG des cellules de Leydig cultivées sans insuline est due d'une part à la diminution du nombre de récepteurs de l'hCG et à la faible production d'AMP cyclique, d'autre part à une ou plusieurs altération(s) localisée(s) au-delà de la formation de l'AMP cyclique. Ce deuxième aspect est suggéré par la diminution de production de testostérone après stimulation par le forskoline, alors que la production d'AMP cyclique induite par le forskoline est normale. Par ailleurs, les effets de la Sm-C et de l'insuline sur la production de testostérone sont plus complexes

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que sur les deux autres paramètres (liaison de l'hCG et production de cAMP). A de faibles concentrations, les effets de la Sm-C sont plus importants que ceux de l'insuline mais la capacité stéroïdogénique des cellules traitées avec de fortes concentrations d'insuline (5 ug/ml) est très supérieure à celle des cellules traitées avec de la Sm-C seule. D'autre part, les effets de la Sm-C (10 ng/ml) et de l'insuline (50 ng/ml) sur la réponse stéroïdogénique à l'hCG sont additifs, et l'intensité dé la réponse est alors similaire à celle observée après traitement avec de fortes doses d'insuline seule. Ces résultats suggèrent que chaque hormone agissant par son propre récepteur stimule un mécanisme localisé au-delà de la formation d'AMP cyclique; les effets sur ces mécanismes étant additifs : ces mécanismes sont donc probablement différents. L'insuline à de fortes concentrations agit probablement à la fois par son propre récepteur ainsi que par celui de la Sm-C ce qui expliquerait l'effet maximal observé.

Nos résultats montrent l'importance de l'insuline et de la Sm-C dans le maintien des fonctions spécifiques des cellules de Leydig et permettent de concevoir les mécanismes propres par lesquels les deux peptides régulent la réponse stéroïdogénique. Etant donné que les cellules de Sertoli sécrètent une substance de type Sm-C ([16], [17]) et que la Sm-C contrôle la croissance des cellules de Leydig [18], nos résultats sont compatibles avec un rôle paracrine de la Sm-C d'origine sertolienne. Reçue le 24 mars 1986, acceptée le 12 mai 1986.

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I.N.S.E.R.M., Hôpital Debrousse, 29, rue Soeur-Bouvier, 69322 Lyon Cedex 05.


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REPRODUCTION ANIMALE. — Isolement par liaison à des membranes d'ultrafiltration; d'un facteur testiculaire limitant le nombre de cellules germinales dans l'ovaire foetal de rat in vitro. Note de Jacques Prépin, Gilles Charpentier, Naïma Hida, Alfred Jost et Michèle Maingourd, présentée par Alfred Jost, Membre de l'Académie.

Le milieu dans lequel a été cultivé du testicule foetal ou néonatal, s'il est utilisé ensuite pour cultiver pendant 4 jours des ovaires de foetus de rat de 13,5 jours, a acquis la propriété de limiter sévèrement le nombre des cellules germinales Ovariennes. Le facteur non dialysable responsable de cette activité se lie aux membranes d'ultrafiltratibn (Diaflo, AmiconR). Il peut être élué de ces membranes par du milieu neuf contenant NaCl,

1M. ..

ANIMAL REPRODUCTION, — Isolation by binding to ultrafîltration membranes of a testicular factor limiting the number of germ cells in the rat fetal ovary in vitro.

The médium used for culturing in vitro fetal or neonatal testes, when used subsequently to culture for 4 days ovaries from .13.5 day oïd rat fetuses, has the property of severely limiting the number of ovarian germ cells. The non-dialysable factor (s) responsible for the observed effect binds to ultrafiltration membranes (Diaflo, AmiconR) and can beeluted from these membranes with fresh medium added 1M NaCl

In the fetal ovary during the days preceding the onset of the meiotic prophase, the number of germ cells increases rapidly and thereafter significantly deCredses. In the rat fetus maximal germ cell number occurs on day 18 of gestation ([1], [2]). Similarly, in fetal ovaries explanted in vitro on day 13.5 and cultured for 4 days in a synthetic medium (CMRL Î066) an approximate 6 fold increase is observed [3]. This increase is prevented when the ovaries are cultured in «conditioned » (or used) media in which fetal or testes of yoùng pups were previously cultured for 4 days. The activity of thèse conditioned média istetained after dialysis againstfreshmédium (eut off1,000 to 50,000 daltons) [4], suggesting the release of one or more activé factor (s) into the medium by the testes (techniques

TABLE Number of germ cells in ovaries from 13.5 days old fetuses for 4 days in diverse media.

Number of germ cells (1)

Number Number —

of pools of Over

of ovarian Exact 10,000 .

Type of experimentation and médium média cultures counting (2)

Ultrafiltration

Initial conditioned medium . ....._ 12 12 3,397+ 477 (12)

Filtrated fraction. . .... . : 12 22 .13,247+ 965 (12) (10)

Not fdtrated fraction . . 12 19 11,530+ 626(12) .(7)

Elution from membrane. ........; 3 8 3,711+ 437 (8) —

Incubation of a Diaflo membrane:

Initial conditioned médium .... .....9 19 3,955+412(19)

Médium after incubation , . . . 9 15 13,571+l,424 (6) (9)

Elution frommembrane..................... . 9 14 4,132+641(14) -

(- 1) Number of germ cells contained in both ovaries from the same fetus+SEM.

( 2) In these ovaries counting ofthe germ cells was stopped when the number attained 10,000.

0249-6313/86/03030123 S2.00 © Académie des Sciences


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reported in 3 and 4). The aim of the présent investigation was the isolation of the active factor (s).

In a first assay, concentration of the factor was attempted by ultracentrifugation through Diaflo membranes (YCO 5, YM2 or YM5 eut off respectively 500, 1,000 and 5,000) in an "Amicon 8 MC" ultrafiltration system under a 1.8 bar pressure (95% air + 5% C02). The inhibitory activity on the ovarian germ cells présent in the initial médium was lost in the filtered and non-filtered fractions, the number of germ cells in ovaries cultured in these média being greater than 10,000 (table) as it is in ovaries cultured in fresh medium. This observation suggested that the active molecule (s) in the conditioned medium was bound to the membrane. Indeed, the activity of the conditioned media also disappeared after incubating Diaflo membranes in the medium for 3 hours (table). The activity was subsequently recovered by elution with fresh medium added 1M NaCl (table). This technique, therefore, easily isolated the molecule (s) responsïble for the reduction of the number of germ cells in the fetal ovary. The active factor (s) was thermo-resistant and did not produce the regression in vitro of 14.5 day old Mullerian ducts at the concentration effective in reducing the number of ovarian germ cells.

Le nombre des cellules germinales peuplant l'ovaire foetal augmente très rapidement jusqu'au moment où débute la prophase méiotique. Ensuite, ce nombre va en diminuant considérablement. Chez le foetus de rat la phase d'augmentation culmine au stade de 18 jours in utero ([1], [2]); de même, dans les ovaires expiantes in vitro à 13,5 jours et cultivés pendant 4 jours le nombre des cellules germinales est multiplié par 6 environ [3].

Or l'augmentation du nombre des cellules germinales est empêchée si les ovaires sont cultivés in vitro dans des milieux dans lesquels on avait préalablement cultivé pendant 4 jours des testicules de foetus de rat ou de jeunes rats [4]. Cette propriété est conférée à ces milieux, ainsi « conditionnés », par les testicules qui libèrent un (ou plusieurs) facteurs (s) actif (s) dans le milieu de culture. Ces milieux gardent en effet leur activité s'ils sont dialyses contre du milieu neuf [4]. Étant donné que le milieu synthétique utilisé (CMRL 1066) [5] ne comprend que des constituants de faible poids moléculaire, on peut logiquement penser qu'il est renouvelé pratiquement en totalité au cours de la dialyse et que l'activité retenue par les membranes correspond à des molécules incapables de traverser des membranes dont le seuil de rétention variait de 1000 à 50 000 daltons [4].

La présente Note est destinée à rapporter des essais d'isolement du facteur actif sur le nombre des cellules germinales de l'ovaire foetal dans les conditions de culture in vitro rappelées ci-dessus. Le point de départ a été une tentative de concentration de ce facteur par ultrafiltration sur des membranes de séparation Diaflo Amicon.

TECHNIQUES. — Les techniques de culture in vitro, de dialyse et de comptage des cellules dans des coupes histologiques ont été rapportées antérieurement ([3], [4]). Cependant ici les ovaires prélevés sur des foetus de 13,5 jours ont été cultivés sur grilles, alors que les testicules de foetus ou de jeunes rats étaient immergés, comme précédemment, dans des boîtes Falcon Plastics. Chaque boîte contenait deux ou quatre gonades dans 0,8 ml de milieu CMRL 1066 [5] additionné d'antibiotiques. Les tentatives de séparation ont été faites sur des lots de 5 à 12 ml de milieux obtenus en groupant les milieux d'un nombre suffisant de culture.

Avant d'être employés pour cultiver les ovaires, les milieux expérimentés ont été stérilisés par filtration (filtres Millex, Millipore, pores de 0,8 puis de 0,22 um), puis dialyses (membranes Spectrapor, Spectrum Médical Industries Inc., Los Angeles 90054, U.S.A.), avant d'être stérilisés à nouveau par filtration.

Les ovaires expiantes à 13,5 jours et cultivés 4 jours dans un milieu neuf et dans les conditions indiquées, contiennent au moins 10 000 cellules germinales. Après culture dans les milieux conditionnés ce nombre est


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TABLEAU

Nombre de cellules germinales dans les ovaires de foetus de 13,5 jours cultivés 4 jours dans:divers milieux.

Nombre de cellules germinales ( 1)

Nombre Nombre

de lots de Plus de.

de cultures Comptages 10000

Type d'expérimentation et milieu milieux d'ovaires exacts ( 2)

Ultrafiltration:

Milieu conditionné initial 12 12 3397 + 477 (12)

Fraction filtrée .... . ....: 12 22 13247+; 965 (12) (10)

Fraction non filtrée . 12 19 11530 +- 626 (12) (7)

Elution de la membrane . . . 3 8 3711+- 437 (8)

Incubation d'une membrane Diaflo

Milieu conditionné initial . . . 9 19 3955+412 (19)

Milieu après incubation . : 9 15 13571+1:424 (6) (9):

Elution de la membrane ... . '. 9 14 4132+ 641 (14)

(1) Nombre de cellules germinales contenues dans les deux ovaires du même foetus+SEM.

( 2) Dansces ovaires le comptage des cellules germinales a été arrêté lorsque le nombre atteignait 10000.

inférieur à 6 000 [4]. On a donc considéré comme « inactifs » les milieux dans lesquels les ovaires contenaient au moins 10000 cellules germinales et dans certains cas le comptage a été arrêté quand ce nombre était atteint (tableau).

Les essais de concentration par ultrafiltration ont été réalisés dans une cellule d'ultrafiltration (ultrafiltration System 8 MC, Amicon, Denvers, Mass. 01923, U.S.A.) équipée de membranes Diaflo YC05, YM2 et YM5, dont le seuil de rétention théorique est respectivement de 500, 1000 et 5000, et sous une pression de 1,8 bar, sous air (95%)+CO2 (5%).

RÉSULTATS. — Essais d'ultrafiltration. — Douze lots de 5 à 12 ml de milieux de culture conditionnés ont été partiellement ultrafiltrés à travers les membranes Diaflo. Pour chaque lot on a vérifié l'activité sur le nombre des cellules germinales ovariennes de trois fractions :- (1) le milieu conditionné initial; (2) la fraction filtrée; (3) la fraction non encore passée à travers le filtre et qui aurait dû être concentrée.

Or dans les douze expériences faites l'activité initiale était perdue aussi bien dans la fraction filtrée que dans celle qui n'avait pas encore passé à travers la membrane (tableau).

Il apparaissait donc probable que le facteur actif disparaissait par suite du contact avec la membrane Diaflo. On a supposé qu'il pouvait être lié à la membrane d'une manière ou d'une autre et qu'il devrait pouvoir être élue. Effectivement il a été possible de récupérer l'activité en utilisant du milieu frais CRML 1066 additionné de NaCl, 1M et en le faisant passer à travers le filtre retourné du système « Amicon 8 MC » (tableau).

Extraction par liaison à une membrane Diaflo. — L'expérience précédente suggérant que le facteur actif sur le nombre des cellules germinales se lie, à la membrane Diaflo et peut être élue en augmentant la force ionique (NaCl, 1 M), on a fait l'expérience suivante.

Une ou deux membranes Diaflo sont plongées dans 5 à 12 ml de milieu conditionné contenus dans une boîte de Pétri. La boîte est placée sur un agitateur horizontal à 4°C pendant 3 h. Dans neuf expériences, on a vérifié que le milieu conditionné initial était actif sur les cultures d'ovaires, et qu'il avait perdu son activité après incubation avec membrane. Il restait à vérifier que l'activité pouvait être récupérée, en incubant les membranes une seconde fois, cette fois avec du milieu neuf additionné de NaCl, 1 M. Dans les neuf expériences faites, le milieu (après dialyse contre du milieu neuf et


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stérilisation sur membrane Millex) était devenu actif sur le nombre de cellules germinales des ovaires en culture (tableau).

DISCUSSION ET CONCLUSION. — Il apparaît donc que les testicules prélevés sur des foetus de 16 ou 19 jours (ou des jeunes rats de 2 à 22 jours) et utilisés pour conditionner les milieux, doivent libérer dans ces milieux une ou plusieurs substances qui : (1) sont retenues par les membranes de dialyse employées, mais non (ou peu) liées à ces membranes; (2) passent à travers les membranes Millex utilisées pour la stérilisation sans être liées d'une manière appréciable; (3) se lient aux membranes Diaflo Amicon et qu'elles peuvent être éluées par NaCl, 1 M.

Nous avons d'autre part vérifié sur sept lots différents que les milieux conditionnés ne perdent pas leur activité après chauffage (30 mn à 90°C ou 10 mn à 100°C au bain marie). Par ailleurs, en cultivant les conduits sexuels de foetus femelles de rat de 14,5 jours dans des milieux conditionnés (trois milieux et neuf cultures) ou extraits par membrane Diaflo (un milieu, trois cultures), on a observé que ces milieux ne provoquaient pas l'involution des canaux de Millier, alors qu'ils réduisaient le nombre des cellules germinales des ovaires de 13,5 jours, dans les conditions habituelles de l'essai. Il semble donc que l'action du testicule foetal sur le nombre des cellules germinales ovariennes et celle sur la régression du canal de Mùller ne soient pas le fait du même facteur, à moins que le premier effet ne soit obtenu pour une concentration plus faible que le second.

Quoi qu'il en soit, la technique simple d'isolement du facteur étudié ici devrait permettre de progresser dans son identification.

Reçue le 21 avril 1986, acceptée le 5 mai 1986.

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NEUROBIOLOGIE. — Evolution des sensibilités à la glycine, au GABA et à la B-alanine de neurones spinaux en culture. Note de Daniel Choquet et Henri Korn, présentée par Jean-Pierre Changeux.

L'analyse des courants globaux enregistrés sur des neurones spinaux en culture par la technique du patch-clamp a permis de vérifier que dès leur apparition, les réponses au GABA, à la glycine et à la (5-alanine sont dues à l'ouverture de canaux chlore et indique qu'elles commencent à apparaître le même jour. La majorité des neurones devient rapidement sensible à ces trois médiateurs au cours de la maturation neufonale. Toutefois, pendant cette ontogenèse, une fraction des cellules n'est sensible qu'au GABA, observation qui confirme que le récepteur pour celui-ci est distinct de celui pour le glycine. A l'opposé, les sensibilités à la glycine et à la P-alanine sont toujours associées, donnée en accord avec l'hypothèse suivant laquelle ces deux acides aminés sont agonistes du même récepteur.

NEUROBIOLOGY. — Development of sensitivity to glycine, GABA and B-alanine in cultured spinal neurons.

Whole cell patch-clamp recording of cultured chick spinal neurons, presumed to be motoneurons, revealed currents elicited in these cells by GABA, glycine and $-alanine, corresponding to the ppening of chloride channels. During maturation, sensitivity to all three transmitters were ftrst detected on the day 6 of culture, and appeared in most neurons by day 8. However, at all stages of development, a fraction of the cells were sensitive only to GABA; this observation supports the notion that the GABA and the glycine receptors are distinct. On the other hand, separate activation by glycine and fi-alanine was never observed, in agreement with the postulate that these amino acids bind to the same receptor.

La glycine et le GABA activent des conductances chlore ([I], [2]) et sont les deux principaux médiateurs de l'inhibition postsynaptique chimique dans le système nerveux central des vertébrés. Leurs récepteurs sont associés sur de nombreux neurones ([3], [4]) et la question de leur similitude a été posée ([5], [6]). Il paraît néanmoins vraisemblable que ceux-ci sont distincts puisqu'il existe des membranes sensibles uniquement à l'un des deux médiateurs [4] et que, dans la majorité des cas où l'action conjointe de ces derniers a été analysée, on observe une sommation de leurs actions maximales [7]. Ces résultats n'excluent pas toutefois une homologie des canaux ioniques associés à ces récepteurs. En effet,; les antagonistes de l'un peuvent bloquer les réponses de l'autre ([8], [9], [10]) et surtout les canaux chlore activés par ces acides aminés ont plusieurs niveaux de conductance communs [4]. Une étude a donc été conduite afin de déterminer si le développement de ces canaux présente des caractéristiques similaires. Dans ce but, nous avons cherché à préciser, sur des cellules en culture, la date d'apparition et l'évolution de la sensibilité à la glycine, au GABA, ainsi qu'à la P-alanine, acide aminé qui active également des canaux chlore ([1], [8]), dont l'action physiologique est bloquée par la strychnine, antagoniste de la glycine ([1], [11]) et dont le site d'action identique à celui de la glycine a été suggéré [8]. Nos expériences ont été effectuées sur des cultures primaires de neurones spinaux de poulet prélevés à 4,5 jours embryonnaires [12]. Après dissociation, les cellules étaient ensemencées sur des boîtes de pétri recouvertes de laminine (10 ug/ml pendant 12 h) et cultivées dans un milieu F-12 (Ham's de GIBCO) auquel était ajouté : sérum de veau foetal (10%), pénicilline (100 ul/ml), streptomycine (100 ul/ml), glutamine (2 mM), ainsi que 10% de milieu conditionné par des cultures musculaires. Celui-ci permet une survie prolongée des cellules ([12], [13]), à prédominance dès motoneurones. Les courants membranaires étaient enregistrés dès 2 h après la mise en culture, suivant la technique dite du « pàtch-clamp » [14] dans la configuration cellule entière [15] illustrée dans la figure 1 A- Seules ont été retenues 85 cellules ayant un potentiel de repos inférieur à —40 mV et présentant une activité électrique lorsque dépolarisées. Chacun des trois acides aminés était appliqué soit par perfusion locale rapide [16], soit par renouvellement

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plus lent de tout le bain. La durée des enregistrements variait de 15 à 90 mn, permettant l'application, suivant les cas, d'un seul transmetteur par cellule (n = 48), de deux (M = 27), ou de trois (rc = 10) acides aminés, successivement.

Sur toutes les cellules où elles étaient observées, les réponses aux trois transmetteurs étaient sensiblement comparables. A des potentiels négatifs, leur application induisait un courant entrant associé à une augmentation de conductance (fig. 1 B), due à l'ouverture de canaux chlore, comme le montrent les courbes courant-voltage (fig. 1 C) qui confirment que, en condition de chlore symétrique, le potentiel d'inversion des réponses était dans tous les cas voisin de zéro (m=4mV, SD = 1.5, n=10). Le pourcentage de cellules activées par chacun des acides aminés en fonction de l'âge de culture, est illustré sur la figure 1 D. Les histogrammes montrent que les différentes réponses apparaissent toutes à

Fig. 1. — Similitude des réponses au GABA, à la glycine et à la P-alanine, et du développement de la sensibilité à ces acides aminés. A : illustration du montage expérimental. Abréviations : ME, microélectrode; RF, circuit de rétroaction; Vref, voltage de référence imposé. Les conditions ioniques d'enregistrement étaient (mM) : (i) pour la pipette CsCl ou KC1, 150; NaCl 4; CaCl2 0,5, EGTA 5; HEPES-KOH 10; pH 7.2; (ii) pour le bain NaCl 150; KC1 4; CaCl2 1; MgCl2 1; HEPES-KOH 10; TTX 1 uM; pH 7.2. B : Courants entrants induits à —70 mV sur une même cellule par perfusion locale rapide de glycine (50 uM) et par perfusion globale de p-alanine (200 uM) et de GABA (50 uM), et accroissement de la conductance membranaire révélée par application régulière de sauts de voltage (culture de 10 jours). C : Pour chacune des trois cellules mises respectivement en présence de glycine (25 uM, ©), GABA (20 µM, O) et de p-alanine (200 uM, E), les réponses s'inversaient entre 0 et 5 mV (cultures de moins de 9 jours). D : Histogrammes, en fonction de l'âge de culture (abscisses) du pourcentage des cellules répondant à chacun des trois acides aminés (ordonnées). A partir du 8e jour, la sensibilité à la p-alanine n'a pas été étudiée sur les cellules insensibles à la glycine, d'où la répartition apparemment différente des deux histogrammes correspondants. Pour cette figure, comme pour la suivante, les chiffres au-dessus de chaque classe indiquent le nombre de cellules analysées.

Fig. 1. — Similarity of the responses to GABA, glycine and P-alanine, and of the development of sensitivity to these amino acids. A: Diagram of the experimental set up. AbbreViations: ME, recording microelectrode; Rv, feedback circuit; VnS, command voltage. The ionic composition of the microelectrode solution and of the bath were, in mM, as indicated above. B: Inward currents induced, in the same Cell, by local perfusion of glycine (50 uM) and by superfusion of p-alanine (200 uM) or GABA (50 nM), and underlying conductance changes (holdingpotential—70 mV; neuron after 10 days in culture). C: Identical reversaipotential (0-5 mV) of the responses elicited by glycine (25 µM, ®), GABA (20 µM, O) and P-alanine (200 µM, S), in three différent cells (cultures less than 9 days). D: Histograms, as a function of the age of culture (abscissa), of the percentage of cells (ordinates) activated by each of the indicated amino acid. Note that after day 8, the sensitivity to P-alanine was not tested on cells unresponsive to glycine. The number of cells analyzed in each class of âge is indicated on top bars.


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partir du 6e jour (aucune n'a été observée plus tôt, malgré la présence, dès le 3e jour, de potentiels d'action sodique), le pourcentage maximal étant observé, à partir du 8e jour, en particulier pour le GABA.

Chaque fois que cela a été possible, nous avons recherché si les neurones étaient sensibles à plus d'un seul acide aminé. Les résultats de ces expériences, qui sont illustrés dans la figure 2, ont été groupés en deux catégories distinguant les périodes d'installation (0-8 jours; n= 14) et de stabilisation relative des réponses (9-21 jours; n=19). Les sensibilités à la (3-alanine et à la glycine étaient toujours associées (n = 20), aucune cellule nerépondant uniquement à l'un des deux; cette donnée est compatible avec leurs propriétés d'agonistes révélées également par des expériences de désensibilisation commune. D'autre part, on trouve à tous les âges des cellules répondant aux trois acides aminés dont la proportion augmente en fonction de la maturation. Ce cas correspond à la classe de la figure 2 indiquant que GABA, glycine et/ou P-alanine ont été employés, soit tous trois (n=10 sur 21), soit deux à deux. Enfin, il existe manifestement une classe particulière de cellules ne répondant qu'au GABA qui persiste aux âges tardifs, bien qu'en proportion relative diminuée (6 cellules sur 10, et 2 sur 11, dans les deux groupes d'âge respectivement choisis).

La date d'apparition des réponses que nous rapportons ici (10e jour postconceptionnel) correspond exactement à celle déterminée in vivo pour le GABA sur le cerveau ([17], [18]), et pour la glycine, sur la moelle [17] de l'embryon de poulet. Elle survient après l'extension des neurites ([12]S [13]) et semble contemporaine de l'apparition des premières synapses à vésicules plates [19] qui, elles aussi se développent ensuite en 2-3 jours. Dès le 6e jour, certaines cellules répondent aux trois acides aminés et leur proportion augmente au cours de la maturation. Ces neurones possèdent donc la capacité d'exprimer les récepteurs aussi bien à la glycine qu'au GABA, notion en accord avec leur coexistence dans certains systèmes adultes ([3], [4]). Toutefois, il semble qu'au cours du temps puissent survenir des modifications de phénotypes. D'une part, on observe une diminution du nombre de

Fig. 2. — Pourcentage des cellules répondant à plusieurs ou à un seul acide-aminé, selon des combinaisons

indiquées sur chacune des classes de la figure. Noter que tous les neurones sensibles à la glycine étaient

... également activés par la P-alanine lorsque celle-ci était appliquée et que d'autre part, une fraction des cellules -

sensibles au GABA était également activée par l'un au moins des deux précédents. Le groupement des

résultats en classes d'âge montre que cette dernière catégorie s'accroît au cours de la maturation en relation

avec une diminution du nombre des neurones sensibles uniquement au GABA. Fig. 2. — Percentage of cells responding to one or several amino acids, as indicated in the figure. Note that all

cells activatëd by glycine Were also sensitive to P-alanine when the latter was tested. A fraction of the neurons sensitive to GABA were also responsive to at least one of the othér amino acids; during maturation, this

population increased as the number of cells sensitive only to GABA decreased.


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cellules répondant à la glycine après le 8e jour, certaines n'exprimant donc que transitoirement la sensibilité à la glycine; tel est le cas dans la moelle d'amphibiens [20]. D'autre part, la diminution du pourcentage des cellules répondant au seul GABA, du fait, peut être d'une apparition plus lente de la sensibilité à la glycine, ne fait pas disparaître cette catégorie. La réalité de celle-ci est confirmée par des estimations indiquant que pour les doses maximales utilisées, avec une résistance d'entrée constatée de 109O, et une conductance de 25 pS par canal [14], le seuil de détection était de 10 à 15 canaux sur le soma, les réponses enregistrées correspondant dans ces conditions à l'ouverture moyenne de 350 canaux. En conclusion, nos données renforcent la notion d'une différence des récepteurs pour d'une part la glycine et la P-alanine, et d'autre part le GABA, mais l'identité du schéma d'apparition des réponses permet, en accord avec celui observé in vivo ([17], [18]) de suggérer un mécanisme commun de l'activation de l'expression de ces récepteurs [21]. Reçue le 28 avril 1986.

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[21] Les cultures cellulaires ont été effectuées dans le laboratoire de Neurobiologie moléculaire (Institut Pasteur) sous la direction et avec l'aide du Dr C Henderson.

I.N.S.E.R.M. n° U261, Département de Biologie moléculaire, Institut Pasteur, 25, rue du Docteur-Roux, 75724 Paris Cedex 15.


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CYTOLOGIE VÉGÉTALE. — Un type original d'architecture pariétale : l'épiderme' foliaire de l'Alfa (Stipa tenacissïma L.). Note de Meriem Marche, présentée par Roger Buvat

L'extraction par la méthylamine associée à la cytochimie ultrastructurale a montré que la paroi secondaire de l'épiderme foliaire d'alfa présentait une structure pluristratifiée torsadée, ordonnée..Le type architectural rencontré est décrit pour la première fois et semble régi par un mécanisme endogène complexe.

'PLANT CYTOLOGY. — An original cell wall architecture. The epidermis of alfa leaves.

Mild extractions with méthylamine coupled with cytochemical staining were used to study cell wall architecture M the epidermis of alfa (Stipa tenacissima L.) leaves. A multilayered and ordered texture was disclosed. Thick strata with parallel microfïbrils alternate with thin strata with a herringbonë pattern. Such a structure was not yet reported It may be explained by rhythmic variations in the endogenous mechanism which controls microfîbril déposition.

INTRODUCTION. — Les méthodes soustractives associées à la cytochimie ultrastructurale = et l'examen au microscope électronique des coupes sous des angles différents ont permis de mieux comprendre l'organisation tridimensionnelle des parois et d'interpréter les «figures en arceaux » fréquentes sur les coupes ultrafines. Ces figures résultent d'une rotation progressive au sein de la paroi de l'orientation des microfibrilles ([1] et [2]) et témoignent d'une texture ordonnée torsadée. Dans certains cas (parois en croissance), cet ordre est transitoire; dans d'autres cas, il est permanent et la structure hélicoïdale est définitivement consolidée. Deux types d'architecture pariétale ordonnée ont été décrits jusqu'ici: le premier résulte d'une rotation régulière et les arceaux successifs apparaissent complets et symétriques; le second est caractérisé par des arcs incomplets, asymétriques, dus à Une rotation intermittente des microfibrilles. Un autre type architectural, original, se rencontre dans l'épiderme foliaire de l'Alfa.

MATÉRIELS ET MÉTHODES. — Les fragments prélevés sur des feuilles matures sont fixés par le glutaraldéhyde. puis incubés dans là méthylamine, sous agitation constante, à la température de la pièce, pendant des durées," différentes (16 à 105 h). Ils sont ensuite lavés, post-fixés, déshydratés et inclus dans l'araldite. Les coupes ultra-fines sont contrastées par le PATAg [3] pour mettre en évidence les polysaccharides à radicaux vis-glycols.

RÉSULTATS ET DISCUSSION. — Les parois de l'épiderme foliaire de l'Alfa sont lignifiées: et une incubation prolongée dans la méthylamine est nécessaire pour démasquer le squelette microfibrillaire. De bons résultats ont été obtenus après 105 h d'extraction, comme ce fut le cas pour le tissu fibreux du même matériel ([4], [5]). Les coupes transversales et longitudinales des feuilles matures montrent que la paroi des cellules épidermiques est très épaisse du côté externe et qu'elle présente, dans cette région, une: structure pluristratifiée, ordonnée (pl). On y observe, à partir de la paroi primaire et en allant vers l'intérieur de la cellule, l'alternance de strates épaisses (au moins 4) constituées de fibrilles orientées dans le même sens, séparées par trois bandes de figures en arceaux. Les figures en arceaux correspondent à une organisation de type hélicoïdal, c'est-à-dire à un empilement de plans formés chacun de microfibrilles parallèles entre elles, mais dont : l'orientation change progressivement d'un plan au suivant ([1], [2]). Lorsque le changement d'angle est régulier, on obtient des arceaux d'égale largeur, chaque arceau correspondant: a une variation angulaire de 180°. C'est le cas de certaines parois primaires en croissance ([1], [2]). C'est aussi le cas de diverses parois secondaires consolidées comme celle dur parenchyme xylémien [2] et de certaines fibres ([4] et [5]). Dans d'autres types de parois - secondaires, la structure hélicoïdale peut être réduite à des

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Fig. 1

Fie.


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EXPLICATIONS DE LA PLANCHE

Observations réalisées sur des portions de paroi d'épiderme foliaire d'Alfa. Partial views of epidermis cell walls from alfa leaves.

Fixation : glutaraldéhyde. Extraction par la méthylamine (105 h). Post-fixation: 0s04. Contraste: PATAg

(AP: 30 mn; TCH: 18 h: PrAg: 30 mn). Fixation: glutaraldehyde. Incubation: méthylamine (105 hrs.). Post-fixation: OsOA. Staining: PATAg (PA:

30\min.; TCH: 18 hrs.; AgPr: 30 min.).

PP: paroi primaire; PS: paroi secondaire. PP: primary wall; PS: secondary wall.

Fig. 1. — Coupe transversale. Paroi primaire mince fortement contrastée par le PATAg. Paroi secondaire pluristratifiée, ordonnée. Strates d'épaisseur inégale, les unes avec des figures en arceaux (flèche simple), les autres montrant des microfibrilles orientées dans le même sens (flèche double) (Gx29000).

Fig. 1. — Transverse section. The thin primary wall is strongly stained. The secondary wall shows a polylamellate structure with alternating strata of various thickness. The single arrow points to the thin strata showing an arced pattern, the double arrow to the thick loyer with parallel microfibrils (M x 29,000).

Fig. 2. — Coupe longitudinale. Paroi secondaire pluristratifiée. La disposition est la même qu'en coupe transversale (G x 34 000). Fig.-2. — Longitudinal section of the polylamellate secondary wall. Same structure than on fig. 1 (M x 34,000).

fractions de tours. C'est le cas des parois de trachéides classiquement définies comme tripartites (Sls S2, S3). Les images obtenues pour l'épiderme de l'Alfa témoignent d'un mode de construction hélicoïdale s'exprimant selon un rythme intermittent différent. Elles peuvent, en effet, s'interpréter comme des variations cycliques du mouvement de rotation des microfibrilles: il y a alternance entre des phases d'arrêt (ou de ralentissement très prononcé) et des phases de reprise d'un rythme hélicoïdal régulier et rapide, correspondant habituellement à trois arceaux, c'est-à-dire à un tour et demi. Tout se passe comme si le mécanisme qui régit le dépôt des microfibrilles et qui constitue l'horloge pariétale, ne tournait pas à vitesse constante. Le déterminisme, endogène ou exogène, reste à établir.

L'exemple de l'épiderme foliaire de l'Alfa montre ainsi qu'une cellule peut modifier à plusieurs reprises le déroulement de son programme morphogénétique d'édification pariétale.

CONCLUSION. — Le travail que nous avions réalisé précédemment sur les fibres foliaires de l'Alfa avait montré que les différentes catégories de cellules lignifiées (fibres sousépidermiques, fibres axiales, fibres périfasciculaires et fibres latérales) présentaient des textures pariétales variées, caractérisées par un rythme spécifique de dépôt des microfibrilles ([4] et [5]). L'épiderme, quant à lui, montre encore un autre type d'architecture pariétale. Il s'agit là d'un exemple assez remarquable de modulation, dans un même tissu, ; de la texture torsadée. Il serait intéressant de déterminer lés niveaux cellulaires où se trouvent régulés ces processus qui conduisent à l'expression asynchrone du mouvement hélicoïdal.

Reçue le 16 décembre 1985, acceptée après révision le 12 mai 1986.

.RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES

[1] A. C. NEVILLE et S. LEVY, Planta, 162, 1984, p. 370-384.

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[3] J. P. THIERY, J. Microscopie, 6, 1967, p. 987-1018.

[4] M. HARCHE, Thèse de Doctorat d'État, Sciences, Université Pierre-et-Marie-Curie, Paris, 1985, 88 p., 43 pl. [5] M. HARCHE et A. M. CATESSON, I.A.W.A. Bull, n.s., 6, 1985, p. 61-69.

Laboratoire de Cytophysiologie végétale E.N.S.,

24, rue Lhomond, 75231 Paris Cedex 05;

adresse actuelle : Laboratoire de Cytologie et Ultrastructure végétale,

Unité de Recherche de Biologie, Université d'Oran, Algérie.


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PHYSIOLOGIE VÉGÉTALE. — Relation entre rhizogenese t teneur en auxine et . acide abscissique chez trois clones de Sequoia sempervirens Endl.) issus d'arbres d'âge différent. Note de Yolande Fouret,Yolande Arnaud, Régis Maldiney, Bruno Sotta et Emile Miginiac, présentée par Alexis Moyse.

Trois clones de Séquoia sempervirens (Endl.) issus d'arbres d'âge différent (1, 50 et 500 ans) sont cultivés in vitrai leurs capacités rhizogéniques et leurs teneurs en AIA et en ABA sont étudiées simultanément. Dans le cadre de notre expérimentation, le matériel issu de l'arbre le plus âgé ne s'enracine pas; il présente une teneur faible en AIA, mais une teneur élevée en ABA (AIA/ABA = 0,17). Les matériels issus des arbres âgés de 1 et de 50 ans s'enracinent aisément; leurs teneurs en AIA sont plus fortes que celles du matériel issu de l'arbre de 500 ans et leurs teneurs en ABA sont plus faibles (rapports AIA/ABA respectivement de 0,60 et 0,44). Il est proposé que la teneur en ces deux phytohormones permet de caractériser l'état physiologique dé végétaux ligneux dont les différences d'âge sont très marquées.

PLANT PHYSIOLOGY. — Rhizogenesis and auxin and abscisic acid levels in three clones Of différent aged Séquoia sempervirens (Endl.) trees.

Three clones of Sequoia sempervirens (Endl.) issued from different aged trees (J: 1 year; I: 50 years; II: 500 years) have been cultured in vitro; their rooting ability and the IAA and ABA levels of their stems have been studied simultaneously. The hormonal levels were measured using an ELIS A method following an HPLC purification. In this experimentation, the material of the clone II did not formany root; most of the explants of the clones J and I were able to form roots (respectively 75 and 82%). The older the original tree was, the lower .theIAA level was (J: 592; I: 425; II; 244 ng-g- 1 DW); but the ABA level was higher in the clone II than in the clones J and I (J: 983; J; 957; II: 1416 ng.g- 1 DW). 77ms, for the clones J and I, the IAA/ABA rate was respectively 0.60 and 0,44; for the clone II, it was lower (0.17). For the clones J and I, the IÀA/ABA rate was higher in the apical half of the stems (J: 0.71; I: 0.74) than in the basai half (J: 0.41; I: 0.17) because the IAA levels were différent in the two parts of the stems. On the contrary, for the clone II, the ABA level repartition was différent: the ABA level was higher in the basal part of the stems. The IAA/ABA rate was higher in the apical part than in the basal part (apical part: 0.27; basal part: 0.13); it is always lower for the clone II than for the clones J and I. On the other hand, we noticed that the stem growth was slower for the older material than for the juvenile one. Therefore, we suggest that very différent aged woody plants can be characterized measuring their IAA and ABA levels. These biochemical criteria fit in with morphological and physiological ones.

INTRODUCTION. — La propagation intensive d'arbres adultes sélectionnés est, actuellement, un problème crucial en sylviculture. En effet, pour un grand nombre d'espèces, les boutures issues d'arbres adultes — voire très âgés — s'enracinent lentement et difficilement alors que les boutures issues d'arbres jeunes s'enracinent aisément ([1] à [4]). Ces différences de comportement s'observent aussi chez le Sequoia sempervirens (Endl.) en culture in vitro pour des clones issus d'arbres d'âge différent ([5], [6], [7]). L'aptitude à l'enracinement est considérée comme un critère physiologique de l'état jeune ([1], [2], [7]).

Il est bien connu, par ailleurs, que la morphogenèse végétale peut être, contrôlée par plusieurs hormones, ainsi que le rappellent Goodwin [8], Chaussat et Courduroux [9] et Margara [10]. En particulier, l'acide indolyl-acétique (AIA) participe à la régulation de la rhizogenêse ([8] à [11]). En outre, l'acide abscissique (ABA) semble être impliqué dans divers processus de « maturation » chez les ligneux [12].

Ainsi; il devrait être possible de caractériser l'état physiologique du matériel végétal à la fois par des tests physiologiques (tels que l'enracinement) et par des tests biochimiques reposant sur la mesure de l'AIA et de l'ABA endogènes. L'étude présentée ici a pour but d'associer, pour le Sequoia sempervirens, critères physiologiques (enracinement) et biochimiques (teneurs en AIA et en ABA) chez trois clones issus d'arbres d'âge différent et cultivés in vitro.

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MATÉRIEL ET MÉTHODES. — Les trois clones J, I et II de Sequoia sempervirens (Conifère de la famille des Taxodiacées) sont issus d'arbres âgés respectivement de 1, 50 et 500 ans. L'introduction in vitro a été effectuée à l'AFOCEL (Association Forêt-Cellulose) en 1983 pour le clone J, en 1977 pour le clone I et en 1978 pour le clone II. L'histoire de ces matériels, antérieure à notre expérimentation, a été rapportée précédemment ([4], [5], [7]). Le matériel est entretenu in vitro selon la séquence (fig.) décrite par Boulay [5] puis par Fouret et coll. [7]. Le test d'enracinement, qui s'inspire de celui de Bekkaoui et coll. [6], comprend trois phases ( fig.) caractérisées par la composition des milieux utilisés et par la durée de séjour des explants sur ces milieux [7]. Les conditions de culture sont les suivantes: photopériode de 8 h (26 W. m- 2; tubes fluorescents Incandia Mazdàfluor 40 INC) et température de 22±3°C. Simultanément, pour chaque clone, les dosages d'AIA et d'ABA libres ont été effectués sur un lot de 24 tiges, coupées en deux portions égales (moitié apicale et moitié basale). Le matériel est immédiatement congelé, puis lyophilisé et broyé au broyeur à bille; la poudre est conservée dans un dessicateur en chambre froide à + 1°C. Les protocoles d'extraction et de purification de l'AIA et de l'ABA ont été décrits par Leroux et coll. [13] et par Maldiney et coll. [14]. La technique de dosage fait appel à un test ELISA à deux anticorps, utilisant la liaison avidine-biotine et la phosphatase alcaline ([13], [14]). Chaque extrait est soumis à cinq dosages. Les résultats sont analysés sur microordinateur LISA Apple (U.S.A.). Les résultats moyens + écart-type sont présentés. Pour Chaque hormone, la teneur dans la tige entière a été calculée à partir des quantités mesurées dans chaque moitié.

RÉSULTATS. — La teneur des tiges entières (moitié apicale + moitié basale) en AIA est d'autant plus élevée que le clone est issu d'un arbre jeune (tableau); la teneur en AIA est environ deux fois moins importante chez le clone II que chez les clones J et I. La teneur en ABA est quasiment identique chez les clones J et I, mais elle est plus élevée chez le clone II ( x 1,4). Ainsi, le rapport AIA/ABA est beaucoup plus faible pour le clone II (0,17) que pour les clones J et I (respectivement 0,60 et 0,44).

Parallèlement, nous constatons, dans le cadre de cette expérimentation, que les taux d'enracinement des clones J et I sont respectivement de 75 et 82 %; aucun explant du clone II ne forme de racine.

Analysant les teneurs en AIA et en ABA dans les fragments de tige de chaque clone (tableau), nous constatons que, chez le clone I, la teneur en AIA est beaucoup plus élevée dans la moitié apicale que dans la moitié basale; chez le clone J, elle reste élevée dans la moitié apicale et dans la moitié basale; chez le clone II, la teneur en AIA est faible et sensiblement la même dans les deux fragments de tige. Dans la moitié apicale des tiges, les teneurs en ABA sont très voisines pour les trois clones; dans la moitié basale des

Schéma général de l'expérimentation [MM, milieu de multiplication; MA, milieu d'allongement; MRI, milieu

de rhizogenèse-induction (acide a-naphtalène-acétique 5.10"5M); MRE, milieu de rhizogenèse-expression;

dosages d'hormones : 24 explants par lot; tests de rhizogenêse : 12 explants par lot]. Expérimental scheme [MM, multiplication médium; MA, elongation médium; MRI, rhizogenesis medium-induction

(naphtyl-acetic-acid 5.10~SM); MRE, rhizogenesis medium-expression; hormone measurements: 24 explants;

rhizogenesis tests: 12 explants].


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TABLEAU

Teneurs des tiges en AIA et en ABA (ng. g- 1 masse de substance sèche) chez trois clones de Séquoia sempervirens (Endl.),

en culture in vitro, issus d'arbres d'âge différent (J : 1 an, 1: 50 ans et II : 500 ans).

IAA and ABA levels (ng.g- 1 DW) in stems of three clones of Sequoia sempervirens (Endl),

in vitro cultured, issued from différent aged trees (J: 1 year, I: 50 years and II: 500 years).

Moitié apicale Moitié basale Tige entière

Clones AIA ABA AIA/ABA AIA ABA AIA/ABA AIA ABA AIA/ABA

J 655 925 455 1110

(±177) (±194) 0,71 (±18) (±144) 0,41 592 983 0,60

I 700 949 169 964

( + 56) (±95) 0,74 ' (±15) (±298) 0,17 425 957 0,44

II 259 957 233 1790

(±28) (±148) 0,27 (±19) (±233) 0,13 244 1416 0,17

tiges, c'est chez le clone II que la teneur en ABA est la plus élevée. D'autre part, pour les trois clones, le rapport AIA/ABA est plus élevé dans la moitié apicale des tiges que dans la moitié basale. Dans la moitié apicale, ce rapport est beaucoup plus faible chez le clone II que chez les clones J et I. Or, c'est chez le clone II que la croissance de la tige est la plus lente [7].

DISCUSSION ET CONCLUSION. — Un taux d'enracinement élevé et une croissance apicale active des tiges entières sont observées lorsque le clone est issu d'un arbre jeune (clones J et I). Parallèlement et comparativement au clone issu de l'arbre le plus âgé (clone II), le rapport AIA/ABA est plus élevé grâce, à la fois, à une teneur en AIA plus forte et à une teneur en ABA plus faible. Il n'est pas surprenant d'observer que les clones aptes à former des racines sont ceux où la teneur en AIA est la plus forte. La stimulation de la rhizogenêse exercée par cette hormone est bien connue ([8], [9], [10]). D'ailleurs, la rhizogenêse s'accompagne d'une augmentation d'AIA endogène dans les tissus réactifs [11]. Quant à l'ABA, après apport exogène, son rôle sur la rhizogenêse adventive semble mal défini : il diffère selon les concentrations utilisées et les espèces auxquelles on s'adresse [15], mais aussi selon les conditions d'environnement et les types d'expiants mis en expérience [16]. D'autre part, une augmentation avec l'âge de la teneur en ABA des organes a déjà été observée [9] et, chez le Lierre (Hedera lielix L.), un apport d'ABA annule l'effet rajeunissant de l'acide gibberellique [17]. Nos résultats, obtenus avec du matériel maintenu en culture in vitro depuis plusieurs années pour les clones J, I et II, indiquent que la teneur en AIA et en ABA et, mieux, le rapport AIA/ABA peuvent être considérés comme de bons marqueurs d'états physiologiques différents dûs à l'âge du matériel d'origine. On peut également associer croissance active et rapport AIA/ABA élevé en considérant la partie apicale des tiges. Reçue le 5 mai 1986.

RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES

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[17] C E. ROGLER et W. P. HACKETT, Physiol. Plant, 34, 1975, p. 141-147Université

141-147Université Paris-VI,

Laboratoire de Physiologie végétale, Ontogenèse expérimentale,

Tour n° 53, 4, place Jussieu, 75252 Paris Cedex 05.


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PHYSIOLOGIE VÉGÉTALE. — Caractérisation biochimique de la période de repos au cours de la croissance rythmique du Frêne cultivé à température élevée et constante. Note de Suzanne Lavarenne, Paul Barnola, Michel Gendraud et Nicole Jallut, présentée par Jean Louis Bonnemain.

Déjeunes Frênes de 2 ans (Fraxinus excelsior L.) cultivés à 25 ±1°C en jour long présentent une croissance rythmique. Deux vagues de croissance successives sont séparées par une période de repos apparent de 15 mois. A aucun moment le bourgeon apical n'est pourtant dormant. Il augmente toujours le «pool " de ses nucléotides triphosphates, adényliques et non adényliques, après incubation sur adénosine. Les facteurs responsables de la manifestation morphologique observée sont à rechercher dans les tissus de l'axe sous-jacent au bourgeon apical.

PLANT PHYSIOLOGY. — Biochemical characterization of the rest period during therhythmical growth of ash-tree-growing at warm and constant température.

Two years old ash tree (Fraxinus excelsior L.) growing at 25±1°C with long day (16 hrs. ofday, 8 hrs. of night) exhibit a rhythmical growth.

The period of rest between two flushes of growth is fifteen months long. A. biochemical study indicates that during this rest the apical buds continuously increase their capacity to synthesize the adenylic (ATP) and non adenylic nucleotidic triphosphates pool (NTP) after an exogenous supply of adenosin (Fig. 2 a-b-c-d). In the above mentioned conditions they are never dormant. Observed with the isolated node cutting techniques at 25±1°C all the buds are growing (Fig. 1). But they open after a long timë when they are cultivated 6 and 12 months at 25CC (Fig. 1 b-c). This result depends on specific properties of the stem underlyïng the apical bud (Fig. 3).

These rhythmical growths with long rest period are observed with species growing in temperate climates, Such as ash tree (or limetree or chestnut tree) or with tropical ligneous plants growing in natural conditions. Our study shows the interest of a biochemical technique to characterize this rest period.

INTRODUCTION. — Dans la nature la dormance hivernale du bourgeon apical de Frêne est forte et prolongée ([1], [2]). Ses caractéristiques, imtialement révélées par le test des boutures de noeuds isolés, sont également mises en évidence par l'étude des modalités de régulation du « pool » nucléotidique de ses bourgeons [3]. Chez le Frêne comme chez le Topinambour [4], le traitement d'un bourgeon non dormant par l'adénosine provoque une augmentation de l'ensemble des nucléosides triphosphates, alors que, dans un bourgeon dormant, la même opération est seulement suivie de l'accroissement de la teneur en ATP.

La culture de feuillus comme le Chêne ([5], [6]), ou de résineux comme l'Epicéa [7], dans des conditions ne limitant pas la croissance, permet la mise en évidence d'un rythmé de croissance régulier caractérisé par de courtes périodes de repos. L'étude des mécanismes biochimiques de ce rythme a été abordé [8]. Il n'en est pas de même, à notre connaissance, des rythmes observés dans les mêmes conditions de culture, qui, chez dès espèces comme le Frêne et le Châtaignier, sont caractérisés par deux vagues successives de croissance séparées par des repos longs: de 9 à 10 mois pour le Châtaignier [9], de 14 à 16 mois pour le Frêne. La présente Note expose les résultats d'ordre morphologique, physiologique et biochimique obtenus à la suite du transfert à 25 + 1°C de plants de jeunes Frênes initialement non dormants.

MATÉRIEL ET MÉTHODES. — Les jeunes plants de Frêne cultivés dans les conditions naturelles et âgés de 2 ans sont transférés en mars à 25°C en jour long (16 h de joùr-8 h de nuit), en chambre climatisée. Dans ces conditions, les bourgeons apicaux, et eux seuls, débourrent et engendrent des pousses feuillées durée de la croissance est de 3 à 4 semaines. L'acrotonie est totale et aucune évolution morphologique n'est décelable parmi les bourgeons axillaires sous-jacents. Les nouveaux bourgeons apicaux sont alors prélevés pour l'analyse jusqu'à ce qu'une nouvelle croissance se manifeste sur la plante entière, 15 mois après la fin de la croissance de la première vague.

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Le matériel destiné à l'étude du débourrement est traité selon la technique classique des boutures de noeuds isolés [10]. Ce sont des boutures constituées par le bourgeon apical et un fragment d'axe sous-jacent d'une longueur de 7 cm. Elles sont placées à 25±1°C en jour long (16 h/24 h) et observées quotidiennement. Les prélèvements effectués 1, 5, 11 et 12 mois après l'arrêt de croissance sont constituées chacun de 20 boutures.

L'analyse biochimique suit immédiatement la récolte des bourgeons sur le plant de Erêne. Ceux-ci, exempts de tout fragment d'axe, sont places pendant 12 h à 16±1°C, à l'obscurité, au contact d'une solution d'adénosine 10mM afin de provoquer l'augmentation du «pool» d'ATP et éventuellement celle des nucléotides triphosphates non adényliques (NTP). Des témoins sont placés dans les mêmes conditions sur de l'eau distillée. Dans chaque cas, trois bourgeons sont analysés et l'expérience est répétée trois fois. A la fin de l'incubation, le matériel, dépourvu de ses écailles, est traité par la méthode déjà décrite [3]. Le surnageant, acido-sohible obtenu constitue, après neutralisation, l'extrait biologique dans lequel l'ATP et les NTP sont dosés par bioluminescence. Les protéines, remises en solution à partir du culot acido-insoluble constituent la référence et leur quantité est déterminée par colorimétrie. Les teneurs en ATP et NTP sont exprimés en picomoles par microgrammes de protéines.

RÉSULTATS. — 1. Aptitude des bourgeons au débourrement. — Sur la plante entière il faut attendre 14 à 16 mois pour observer un gonflement apical suivi d'une nouvelle vague de croissance. Un mois après l'arrêt, une dissection du bourgeon terminal montre que tous les éléments de la nouvelle pousse sont présents.

En boutures de noeuds isolés, les bourgeons apicaux sont toujours capables de manifester une croissance (fig. la-b-c-d). Seul le temps de latence au débourrement permet d'affirmer que la physiologie se modifie. Pour obtenir le maximum de débourrements il faut 8 à 10 jours pour un prélèvement qui a lieu 1 mois après l'arrêt, 24 à 27 jours 5 mois après l'arrêt, 30 à 32 jours 11 mois après l'arrêt. La pente de la courbe de

EXPLICATIONS DE LA PLANCHE

Fig. 1. — Aptitude au débourrement de 20 bourgeons apicaux en boutures de noeuds isolés placés à 25±1PC en jour long, a-b-c-d: respectivement après 2, 6, 12, 13 mois de culture à 25±1°C jour long.

Fig. 1. — Bursting capacity of 20 ash tree apical buds measured by the test of isolated nodes cuttings setted in conditionned room at 25 + 1°C with long day. a-b-c-d: respectively after 2, 6, 12; 13 months of culture at 25±1°C with long days.

Fig. 2. — Mesures du pool des nucléotides triphosphates de neuf bourgeons apicaux de Frênes (Fraxinus excelsior L.) cultivés à 25± 1°C en jour long, a-b-c: respectivement après 2, 6, 12 mois de culture, d: après 12 mois de culture, dosage précédé d'une carence en sucre des bourgeons apicaux de 6 jours à 16±1°C. Valeurs moyennes en ATP (nucléotides adényliques) et NTP (nucléotides non adényliques) après incubation 12h à 16°C: , sur eau; sur adénosine (moyennes de 3 expériences ±S,D. (traits verticaux)).

Fig. 2. — Measures ofnucleotidic triphosphates pool ofnine ash tree apical buds (Fraxinus excelsior L.) growing at 25±1CC with long day. a-b-c: respectively after 2, 6, 12 months of culture, d: after 12 months of culture, the measures are preceded by a sugar deficiency of the apicalbuds during 6 days at 16±l°C. Mean measures of ATP (adenylic nucleotid) and NTP (non adenylic nucleotid) after an incubation during 12 hours at 16°C: , on water; @3, onadenosin (nxeans ±S.D. (vertical bars) were calculated from 3 experiments).

Fig. 3. — Mesures du pool des nucléotides triphosphates de neuf sections de tige sous-jacente aux bourgeons apicaux de Frênes (Fraxinus excelsior L.) cultivés à 25±1°C en jour long, a-b-d-e: respectivement après 2, 6, 12, 13 mois de culture, c: après 6 mois de culture, dosage précédé d'une carence en sucre des sections de 6 jours à 16±1°C. Valeurs moyennes en ATP et NTP après incubation 12 h à 16°Ç: I 1 , sur eau; ^g, sur adénosine (moyennes de 3 expériences +S.D. (traits verticaux)).

Fig. 3. — Measures of nucleotidic triphosphates pool of nine stem cuttings underlying the apical buds of ash tree (Fraxinus excelsior L.) growing at 25± 1°C with long day. a-b-d-e: respectively after 2, 6, 12, 13 months of culture, c: after 6 months of culture, the measures are precded by a sugar deficiency of the stem cuttings during 6 days at 16+1°C I I, on water; r^\, on adenosin (means +S.D. (vertical bars) were calculated from 3 experiments).


PLANCHE I/PLATE I

SUZANNE LAVARENNE

Fig. 1

Fig. 2

Fig. 3



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débourrement reste toujours très élevée (fig. 1). Passé le onzième mois d'arrêt, l'aptitude à la croissance se restaure rapidement (fig. ld).

2. Modalités de régulation du métabolisme nucléotidique. — Dans les bourgeons apicaux prélevés sur la plante entière pendant les 12 mois qui suivent son transfert à 25°C, l'incubation au contact d'adénosine provoque toujours une augmentation de l'ensemble des nucléosides tri-phosphates (fig. 2a-b-d). Ces bourgeons ont donc un métabolisme nueléotidique de type non dormant et ce résultat est compatible avec la pente et le pourcentage de débourrement des boutures de noeuds, mais il n'apporte aucun éclaircissement sur leur temps de latence important. 11 mois après l'arrêt de croissance à 25 + l°C le traitement par le nucléoside semble sans effet sur la teneur en nucléotides tri-phosphates non adényliques, NTP (fig. 2c) bien que, comme l'indique le test des boutures de noeuds isolés, les bourgeons ne soient pas dormants (fig. 1 c). Un résultat analogue est signalé chez le Topinambour lorsque dans des conditions favorables à la croissance, le « pool » des nucléotides sucres issus de NTP, s'accroît au point d'empêcher l'accumulation de ces derniers [4]. La carence du bourgeon en glucides et autres molécules organiques permet alors de faire apparaître les potentialités d'extension du « pool" des nucléotides triphosphates et de montrer que le métabolisme nucléotidique est de type non dormant. Elle est obtenue en plaçant le bourgeon isolé sur une solution nutritive minérale (solution Knop diluée de 1/2). Dans le cas présent, l'incubation des bourgeons apicaux de Frêne pendant 5 jours sur une solution minérale, préalablement au traitement par l'adénosine, suffit pour vérifier qu'ils sont non dormants (fig. 2d).

La même technique appliquée aux fragments de tige sous-jacents aux bourgeons apicaux donne les résultats suivants :

Après 6 mois passés à 25 ± 1°C l'adénosine exogène n'entraîne pas ou peu d'augmentation en NTP, même après une carence en sucre (fig. 3 b-c).,Cette augmentation se manifeste à nouveau après 13 mois de culture. À ce moment là, l'aptitude à synthétiser les nucléotides triphosphates existe aussi bien dans le bourgeon que dans la portion d'axe sous-jacent à celui-ci (fig. 2 d-3 d-e).

DISCUSSION. — Ainsi incapables de débourrer à 25 + 1° C pendant plus de 12 mois sur la plante entière les bourgeons apicaux de Frêne, initialement non dormants, restent non dormants. Ils sont toujours capables de synthétiser un excédent de liaisons phosphates riches en énergie, susceptibles d'être transféré sur des nucléotides non adényliques, afin de disposer d'un approvisionnement énergétique suffisamment diversifié pour permettre la croissance. Suite à l'arrêt de la croissance, et pendant le mois qui suit, l'efoliation provoque le développement du seul bourgeon apical; cette inhibitionfoliaire est bien connue dans les conditions naturelles où elle s'exerce pendant 1 à 2 mois après l'arrêt de croissance [1]. Après 6 mois de culture à 25 + l°C, la situation est comparable à l'inaptitude au débourrement observée pour des bourgeons prélevés dans les conditions naturelles en septembre et placés en boutures de noeuds isolés à 25 + l°C [3]. Cette inaptitude serait alors peut-être liée à l'incapacité des tiges à assurer l'approvisionnement trophique et énergétique dont a besoin le bourgeon pour croître. Dans le cas des plantes maintenues en permanence à 25±1°C, la corrélation entre le bourgeon apical et les tissus voisins de l'axe est probablement de même nature mais n'atteint pas la même intensité puisque tous les bourgeons finissent par débourrer. C'est pourtant dans l'axe qu'il faut rechercher le facteur limitant de la manifestation morphologique décrite. Sans présumerde la nature véritable de ce facteur, il se peut qu'il soit aussi la cause de la longueur anormale du temps de latence au débourrement des boutures. Dans cette hypothèse, il disparaîtrait


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au-delà de 12 mois et pourrait être simplement un défaut de mobilisation des réserves nécessaires à la croissance. En se basant sur la seule technique biologique des boutures de noeuds isolés nous avions conclu qu'à température moyennement élevée une dormance faible s'installait dans le bourgeon et se maintenait longtemps [11]. L'étude biochimique permet de corriger et d'affiner ce point de vue. Enfin, bien que le Frêne soit une espèce d'origine tempérée les résultats présentés dans cette Note devraient s'inscrire dans la réflexion quant à la nature des repos longs observés chez les ligneux tropicaux comme dans le cas de Gnetum africanum [12]. Reçue le 3 février 1986, acceptée après révision le 5 mai 1986.

RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES

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Laboratoire de Phytomorphogenèse associé au C.N.R.S., U.A. n° 45, Université de Clermont-Ferrand-II, 4-6, rue Ledru, Clermont-Ferrand.


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PHYSIOLOGIE VÉGÉTALE/ — Photorégulation de la 8-aminolévulinate dêshydratase des cotylédons de radis. L Effet de l'acide d-aminolévulinique. Note de Claude Huault, Philippe Bruyant et Alain-Pierre Balangé, présentée par Michel Thellier.

L'activité de la 5-aminolévulinate dêshydratase extraite des cotylédons de radis étiolés ou éclairés sous lumière rouge lointain est accrue lorsque les plantules sont cultivées en présence d'acide 8-aminolévulinique (ALA). L'effet amplificateur de l'ALA est aboli par l'addition de cycloheximide. Ces résultats suggèrent 1) que l'acide 8-aminolévulinique, substrat de l'enzyme, serait l'inducteur de la synthèse de l'ALA 2) que l'effet V de la lumière rouge lointain résulterait d'un accroissement de la concentration endogène de l'ALA.

PLANT PHYSIOLOGY, — Photorégulation of radish 5-aminolevulinate dehydratase, I, Effect of 5-aminolevulinic acid in etiolated and far-red treated cotyledons.

B-aminolevulinic acid (ALA) is shown to increase S-aminolevulinate dêshydratase (ALADactivity in radish cotylédons grown in darkness or under continuous far-red light. Cycloheximide conteracts the promotive effect of ALA. It is postulated (1) that 8-aminolevulinic acid is an inducer of ALAD synthesis (2) that the promotive effect of far-red light arises from an increase of in situ ALA concentration.

This report deals with the photocontrol of 8-aminolevulinate dehydratase (ALAD; E.C.4.2.1.24) in radish cotylédons. ALAD catalyses the self-condensation of aminolevulinate (ALA) to form the monopyrrole porphobilinogen which is the precursor of cytochromes and chlorophylls [1] We demonstrate that feeding etiolated or light-grown seedlings with ALA increases ALAD activity measured in cotylédon extracts after Sephadex G.25 sieving (Fig. 2 A and B). The promotive effect of ALA in etiolated Seedlings is indépendant of time of application (Fig. 2A, curves b, c and d) by comparison with non-treated cotylédons (curve a). When ALA is supplied to light-grown seedlings 48 hrs after sowing, the promotive effect of ALA is weak until 12 hrs., then ALAD activity increases dramatically (Fig 2B; curve b); Similar results are obtained when ALA is supplied 72 or 96 hrs. after sowing (Fig.-2 B, curves c and d). In a previous paper, we have demonstrated, by density làbelling studies in radish cotylédons, that the turn-over of ALAD is very poor [3]. Therefore the promotive effect of ALA cannot be explained by a decrease of ALAD dégradation. Cycloheximide abolishes the promotive effect of ALA when it is supplied with ALA to etiolated cotylédons (Fig. 2 A, curve e) or to light-grown cotylédons (Fig. 2 B, curvè e) From these results, we assume that endogenous ALA may act as an inducer of ALAD synthesis and that photocontrol of ALAD synthesis, demonstrated previously [3], may depend upon ALA turnover as shown on Fig. 3.

ABRÉVIATIONS. — ALA=acide S-aminolévulinique; ALAD — 5-aminolévulinate dêshydratase; RL=lumière rouge lointain.

INTRODUCTION. La 5-aminolévulinate déshydratase (ALAD :E.C.4.1.24) catalyse la condensation de deux molécules d'acide 8-aminolévulinique (ALA) en porphobilinogène, monopyrrole précurseur, chez les végétaux supérieurs, des hèmes mitochondriaux et chloroplastiques, et des chlorophylles [1]. Chez les végétaux la lumière accroît l'activité ALAD [2]. Récemment, nous avons démontré, par marquage de densité, que l'augmentation sous éclairemënt rouge lointain (RL) de l'activité ALAD des cotylédons de radis

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résulte d'une synthèse de novo accrue de l'enzyme faisant intervenir les ribosomes cytoplasmiques [3]. Kasemir et Masoner [4] ont établi que l'effet inducteur de la lumière RL implique le système phytochrome. Cependant, comme pour la plupart des enzymes végétales contrôlées par le phytochrome, le problème du mode d'action du photorécepteur demeure. Le phytochrome contrôle-t-il l'expression de photogène(s) codant pour l'ALAD ? ou le photorécepteur intervient-il par l'intermédiaire d'un produit de la chaîne des porphyrines ? Chez les végétaux supérieurs, il est bien établi que la biosynthèse de l'ALA est accrue à la lumière et qu'elle constitue une étape limitante dans l'élaboration des porphyrines [1]. Masoner et Kasemir [5] ont ainsi démontré par des expériences d'induction-réversion utilisant des irradiations rouge clair et rouge lointain que le phytochrome agit sur la synthèse de l'ALA dans les cotylédons de moutarde. Ces résultats suggèrent que l'ALA pourrait contrôler l'induction de la synthèse de l'ALAD.

MATÉRIEL ET MÉTHODES. — Matériel végétal et conditions de culture. — Les grains de Radis, variété « Longue rave saumonée » proviennent des Etablissements Fontaine 27310, Bourg Achard (France). Les graines sont mises à germer sur papier filtre, à l'obscurité ou sous éclairement rouge lointain (RL). Les caractéristiques de l' éclairement précédemment définies [6] permettent de maintenir une quantité faible mais constante de phytochrome rendant compte des réponses photomorphogénétiques au cours de la différenciation [7]. La cycloheximide a été utilisée à la concentration de 0,1 mM déterminée dans des travaux antérieurs [3]. L'acide 5-aminolévulinique (ALA) a été employé en solution aqueuse ajustée à pH7, généralement à la concentration de 5 mM.

Extraction et mesure de l'activité ALAD. — Les extractions sont effectuées à partir de 25 paires de cotylédons suivant le protocole défini par Huault et coll. [3]. L'activité ALAD est déterminée selon un protocole précédemment décrit [8] en estimant la quantité de porphobilinogène formé par la technique de Mauzerall et Granick [9]. La mesure de l'activité ALAD est effectuée après dessalage des extraits sur colonne de Sephadex

Fig. 1

Fig. 2

Fig. 1. — Influence de la concentration de l'ALA sur l'activité ALAD des cotylédons éclairés sous lumière RL (l'ALA est fourni 48 h après le semis et le dosage de l'ALAD est réalisé à 120 h).

Fig. 1. — Effect of ALA concentration upon ALAD activity of cotylédons grown under far-red light (ALA is applied 48 hrs. after sowing and ALAD activity is measured at 120 hrs.).

Fig. 2 A et B. — Effet de l'ALA (5 mM) sur l'évolution de l'activité ALAD des cotylédons cultivés à l'obscurité (A) ou sous éclairement RL (B). Les flèches indiquent le moment du transfert des plantules sur milieu contenant l'ALA (e—© : sans ALA; W—V .avec ALA; A—A : avec .ALA et cycloheximide).

Figs. 2 A and B. — Effect of ALA (5 mM) on the time-course of cotyledons ALAD activity in darkness (A) or under far-red light (B). The arrows indicate the change on ALA médium (E—e: control without ALA; ▼--*-▼■ ALA; A—A: ALA+cycloheximide.


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G 25 (Pharmacia Fine Chemicals). L'activité enzymatique est exprimée en pikoKatal par paire de cotylédons (picomole de porphobilinogène formé par millilitre de solution inhitiale, par seconde). Les expériences ont été reproduites de cinq à dix fois, chaque mesure étant effectuée en double. L'intervalle de confiance, selon le test t de Student, représente en moyenne 6 à 30 % des valeurs des activités enzymatiques portées sur les courbes. Le dosage des protéines est effectué en utilisant la technique de Bradford [10].

RÉSULTATS EXPÉRIMENTAUX. — 1. Effet de la concentration en ALA exogène sur l'activité ALAD de cotylédons. — L'effet de la concentration en ALA exogène sur l'évolution de l'activité ALAD a été suivie sur des cotylédons provenant de plantules cultivées sous éclairement RL traitées entre 48 et 120 h par des concentrations croissantes d'ALA. Aucun effet de l'ALA n'est observé au-dessous de la concentration de 2 mM (fig. 1). Au-delà de cette concentration, l'ALA exogène amplifie l'activité ALAD et un plateau d'activité est atteint au-delà de 5 mM. Aucun effet corrélatif de l'ALA sur la teneur en protéines solubles n'a pu être mis en évidence.

2. Cinétique d'évolution de l'activité ALAD des cotylédons cultivés en présence d'ALA (5mM). — Lorsque les plantules sont cultivées à l'obscurité, l'activité ALAD augmente lentement pour atteindre un maximum 72 h environ après le semis (fig. 2A, courbe a). L'addition d'ALA 48 h après le semis provoqué un accroissement continu de l'activité ALAD. Cette augmentation de l'ordre de 25 % 72 h après le semis atteint 100 % après environ 144 h (fig. 2 A, courbe b). L'effet amplificateur de l'ALA est également observé lorsque les plantules sont transférées sur milieu contenant l'ALA 72 ou 96 h après le semis (fig. ZA, courbes c et d). Lorsque les plantules sont cultivées sous éclairement RL, l'activité ALAD augmente de façon importante jusque vers 72 h, puis décroît (fig. 2B,. courbe a). Le transfert des plantules sur un milieu contenant de l'ALA 48 h après le semis provoque une augmentation de l'activité ALAD des cotylédons faible jusque vers 72 h après le semis (fig, 2B, courbe), bien que de même amplitude que celle observée chez les plantules étiolées. Au-delà de 72 h, l'activité ALAD est maintenue dans les cotylédons cultivés en présence d'ALA. Le rapport entre l'activité ALAD des cotylédons traités par l'ALA et l'activité ALAD des cotylédons non traités est de 600% environ 144 h après, le semis. L'effet amplificateur de l'ALA est également observé lorsque le traitement des plantules éclairées est réalisé 72 ou 96 h après le semis (fig. 2B, courbe c Md):

Dans une série d'expériences nous avons transférés les plantules âgées de 96 h étiolées ou cultivées sous lumière RL sur un milieu contenant à la fois de l'ALA et de la cycloheximide. L'effet amplificateur de l'ALA (fig. 2A et B, courbes d) est alors réduit par la cycloheximide aussi bien dans les cotylédons maintenus à l'obscurité (fig. 2A, courbe e) que dans les cotylédons cultivés sous lumière RL (fig. 2B, courbe e).

DISCUSSION. — Nous montrons dans cette Note que l'activité ALAD des cotylédons étiolés de radis s'accroît au cours de leur différenciation et que la lumière RL ne fait qu'accentuer cette augmentation. Par ailleurs, nous mettons en évidence que l'acide 8-aminolévulinique exogène amplifie l'accroissement de l'activité ALAD dans les cotylédons cultivés à l'obscurité ou sous éclairement RL. Des expériences antérieures ont permis d'établir, par marquage de densité, que l'ALAD de plantules étiolées ou éclairées, n'est pas soumise à un « turnover » [3]. Il est donc exclu que l'ALA intervienne dans le contrôle de la dégradation de l'ALAD. Un traitement simultané des cotylédons avec l'ALA et Je cycloheximide réduit l'effet amplificateur de l'ALA. Ces faits impliquent que l'action de l'ALA résulte de l'accroissement de la synthèse de novo de l'ALAD, L'effet inducteur de l'ALA est progressif et de faible amplitude à l'obscurité. Par contre, sous éclairement RL, l'effet de l'ALA n'est important qu'après 72 h, temps correspondant au


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maximum d'activité ALAD des cotylédons non traités par l'ALA. Ces résultats suggèrent que la photorégulatioh de la synthèse de l'ALAD au cours de la différenciation pourrait dépendre de la concentration de l'ALA endogène et des facteurs dépendant ou non de la lumière pouvant affecter le métabolisme de l'ALA (fig. 3). Il apparaît que la concentration de l'ALA endogène est la résultante de sa propre synthèse à partir du glycocolle suivant la voie Shemin [1] ou à partir de l'acide glutamique suivant la voie Beale [1], de son câtabolisme [13] et de sa transformation en protohème et protochlorophylle [1]. La lumière contrôlerait, via le système phytochrome, la protéolyse des réserves cotylédonnaires [11] et ainsi la production des précurseurs de l'ALA. Le phytochrome contrôlerait également l'activité des enzymes participant à la biosynthèse de l'ALA [5].

Tout facteur exogène susceptible de modifier le métabolisme de l'ALA devrait influer sur la synthèse de l'ALAD. C'est ainsi que l'emploi d'analogues de l'ALA, inhibiteurs compétitifs de l'ALAD, devrait nous permettre d'étayer notre hypothèse. Reçue le 3 mars 1986, acceptée après révision le 12 mai 1986.

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Laboratoire de Photobiologie, U.A. 203 C.N.R.S., Faculté des Sciences et des Techniques, Université de Rouen, B.P. n° 67, 76230 Mont-Saint-Aignan.

Fig. 3. — Modèle hypothétique

du contrôle de la synthèse de l'ALAD par l'ALA.

Fig. 3. — Proposed scheme for régulation of ALAD synthesis by ALA.


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GÉNETIQUE — Absence de liaison entre la maladie d'Alzhëimer et les marqueurs du complément. Note de Sylvie Clemenceau, Jean-François Foncin, Jean-Yves Muller, Liliane Halle,Georges Hauptmann, Jeanine Seger et Charles Salmon, présentée par Jean-François Bach.

La recherche d'une liaison éventuelle entre la maladie d'Alzhëimer (MA), démence présénile dégénérative, et les marqueurs du complément C2, C4, Bf liés au complexe majeur d'histocompatibilité a été entreprise dans une famille étendue d'origine Calabraise, dans laquelle la MA se transmet selon un mode mendélién autosomique

dominant (43 cas de MA recensés).

L'analyse des complotypes de 33 sujets appartenant à une branche de cette famille, dans laquelle 10 cas de MA ont été observés, permet de conclure qu'il n'existe aucune liaison entré la MA et les marqueurs du complément étudiés. En outre, aucun déficit complet bu partiel en fractions C2, C4, Bf n'a été observé chez les sujets atteints de MA.

GENETICS. — No linkage between Alzheimer's disease and Complement markers.

The hypothesis of a linkage between Alzheimer's disease (AD) (presenile dementia) and the complement components C2; C4, Bf linked to the Major Histocompatibility Complex has been investigated in a large family originating from Calabria,in which AD is transmitted as an autosomal dominant monogenic mendelian trait.

The analysis of complotypes of 33\ members of a pedigree, from which 10 individuals are affected, allowed to demonstrate that there wasn't any linkage between AD and those markers.

Furthermore, no complete or partial deficiency in the C2, CA, Bf components has been observed in affected patients. .

INTRODUCTION. - Le développement d'une démence organique est, dans la deuxième moitié du cours normal de l'existence humaine, le plus souvent en rapport avec la maladie d'Alzhëimer (MA):

Une concentration familiale évoquant une transmission mendélienne autosomique dominante a été observée depuis longtemps, essentiellement dans des formes à début précoce [1]. L'étude des facteurs génétiques est donc l'une des principales voies de recherche en ce qui concerne la MA.

Le présent travail se propose de tirer parti de l'individualisation [2] d'une famille étendue dans laquelle la MA se transmet selon un mode mendélien autosomique dominant, pour tenter de rechercher une liaison de celle-ci avec les marqueurs du complément liés au complexe majeur d'histocompatibilité (CMH).

MATÉRIEL. —33 sujets issus d'une famille d'origine Calabraise, partiellement émigrée aux États-Unis et en

France, ont pu être étudiés [2]. Cette famille est présentée sur la figure.

Ainsi,21 sujets de la génération IV ont été analysés, 8 sujets de la génération III ont été examinés et 3

reconstitués à partir de leurs descendants. Enfin, un seul membre de la génération II a pu être analysé

directernent (H5), le génotype des sujets II2, II4 et II6, tous atteints et décèdes a été reconstitué d'après le génotype de leurs enfants (fig.).

Le diagnostic de MA a été établi d'après : des critères cliniques et des examens histopathologiques classiques

sur biopsie cérébrale pour III8, III10, III13; des critères cliniques pour III11, III1, III6 et d'après un interrogatoire

de la descendance pour les patients des générations I et II. Ce sont les descendants du II6 qui nous ont permis d'étudier la liaison entre la MA et les marqueurs du

complément.

MÉTHODES. — Le polymorphisme du facteur B de la Properdine (Bf) à été déterminé par électrophorèse en gel d'agarose suivie d'une iinmunofixation ([3], [4]).

- L'étude du polymorphisme, de C2 a été effectuée par iso-électrofocalisation en gel de polyacrylamide suivie d'une révélation hémolytique [5].

- Les allotypes de C4 ont. été mis en évidence par électrophorèse en gel d'agarose et déterminés par immunofixation, Pour parfaire là distinction entre les produits du locus C4A et C4B, nous avons éprouvé leur activité hémolytique [6].

0249-6313/86/03030149 S 2.00 © Académie des Sciences

C.R. 1986, 2e Semestre (T. 303) Série III - 13


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C. R. Acad. Sc. Paris, t. 303, Série III, n° 5, 1986

La nomenclature adoptée ici est celle proposée à la IV Workshop Internationale sur la génétique du complément [7].

— Le polymorphisme de la glyoxalase érythrocytaire a été étudié par électrophorèse en gel d'amidon [8].

Définition des complotypes. — Le terme de « complotype » [9] se réfère aux quatre marqueurs du complément localisés sur le chromosome 6. L'ordre des gènes adopté ici est : Bf-C2-C4A-C4B. Seule la désignation des allèles est donnée. Ex : BfS-C2C-C4A3-C4B 1 = SC31.

RÉSULTATS. — Les phénotypes obtenus sont présentés dans le tableau L

A partir de ces résultats et des relations de parenté (fig.), les complotypes de chacun des sujets ont été établis et confirmés par l'étude des marqueurs HLA [10]. Les différents haplotypes (HLA/complément) rencontrés sont mentionnés dans le tableau II et repris de façon abrégée dans l'arbre généalogique.

1° Il n'est observé aucun déficit génétique, complet ou partiel, en fractions C2, C4 ou Bf chez les sujets atteints de MA.

2° Sur l'ensemble des sujets analysés, nous avons pu mettre en évidence six complotypes particuliers :

— SC 31 est retrouvé à la fois chez des sujets malades et des sujets sains.

— FC31, peu fréquent dans la population Caucasoïde, est hé dans cette famille à trois haplotypes HLA différents, introduits dans la famille par ll5 et III9, indemnes de la MA.


PLANCHE I/PLATE I

SYLVIE CLEMENCEAU

TABLEAU I

Diagnostic Année

de Haplotypes

Sujet . Numéro 1 2 3 Atteint naissance Sexe Décès. HLA

I1 108 + ±. 1864 : M + ND

I2 109 - 1866 F + ND

II1 153 - 1893 F + ND

II2 154 + + 1891 M. + (a/?)

II3 161 - :; 1893 F + (n/?)

II4,. ... 162 + + 1894 M + (6/?)

II5. ................ 165 - 1893 F - c/d

II6. 166 + 1895 - M + . (a/b)

III1 228 + - 1922 F + ND

III2. 233 - 1930 M - (a/1)

III3. . 1572 - 1938 F + ND

III4. .............. 236 : - 1916 F - (b/n)

III5. ....... . ........ 1418 - ? F - ' (o/p)

III6 237 + + 1917 M + (b/n)

III7. . 1201 - 1937 F - e/f

III8 . . . . 250 + + 1933 M - b/c

III9 1191 - 1935 F - g/h

III10 249 + + 1931 M — a/c

III11 246 + + 1926 F + (a/1)

III12 1177 - ? M - i/?

III13. 247 + + 1928 F + (b/c)

III14 1211 - 1925 M - j/k

IV1. 1651 ? ? M - a/?

IV2. ... ............ 1439 ? 1955 ... F - b/o

IV3. 1438 ? 1951 - M - n/o

IV4. ... : 1437 ? 1949 F - : b/p

IV5. . . .. 1205. ? 1967 M - e/cr

IV6 1203 ? 1964 M - ' f/b

IV7 1202 ? 1962 F - e/b

IV8. ........ 1195 ? 1966 F - g/c

IV9 1194 ? 1965 M — h/a

IV10 1193 ? 1962 M - g/c

IV11 1185 ? 1950 F - a/i

IV12. 1212 ? 1965 M b/j

IV13 1435 ? 1950 F - l/m

IV14 1213 ? 1954 M - c/j

IV15 315 ? ? F - ND

IV16 1216 ? 1961 M - b/j

IV17 1214. ? 1956 M - b/k

IV18 316 ? 1956 F . - ND

IV19 1217 ? 1965 M - b/j

IV20 1218 ? 1970 F - c/k

VI21 1219 ? 1972 F - b/k

V1 1434 ? 1977 M — b/m

V2 1436 ? 1981 F - j/l

V3. . . . . . 490 ? 1981 M — kr/l

La colonne « n° » correspond au numéro de chaque sujet dans l'arbre généalogique informatisé. La colonne « diagnostic » correspond :

— pour 1 : à un diagnostic anamnésique;

— pour 2 : à un diagnostic clinique;

— pour 3 : à un diagnostic clinique et anatomique.

Les « ? » de la colonne « atteint » signifient que les sujets n'ont pas atteint un âge suffisant pour affirmer qu'ils sont indemnes de la maladie d'Alzheimer, .

La signification des lettres de la colonne « haplotype » est donnée dans le tableau II In the column "No." is given the number oj each individual in the computer file. In the column "diagnostic":

— 1 indicate an anamnestic diagnosis;

— 2a clinical one;

— 3 a clinical and an anatomical one.

In the column "atteint" the "?" means that the individual has not yet reached an age allowing to insure that he will be free of disease. The meaning of letters in the haplotype column is given in Table II



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153

TABLEAU II

Haplotyoes présents dans la famille. HLA haplotypes found in the studied family

HLAA B DR Bf C2 C4A C4B GLO

a= 1 W47 1 SC 3. 1 1

38 W6 S C 4 6 2

c= 3 35 W6 S C 3 1 1

d= W33 - 8 F c 3 1 2

e= 24 49 W6 S C 3 l 1

f= 2 35 4 S V C 3 1 2.

g= 3 W55 2 S C 3 1 2

h= 24 44 7 F C 3 1 1

i= W33 35 4 S C 3 1 1

J= 2: 39 6 S C ; 3 1 2

k= 24 14 W6 S ...... C 2 1,2 2

l= 1 W57 7 S C6 1 2

m= - W57 W14 S C QO 1 1

n= 24 14 S C 2 2

o= 2 35 5 S C 3 1 1

p= W33 14 1 S C 2 1,2 1

Haplotypes recombinés

e= 24 35 4 S C 3 1 2

cr= 3 38 6 S C 4. 6 2

hr= 24 44 2 F C 3 1 2

kr= 24 14 6 S C 4 6 2

br= 1 38 6 S C 4 6 1

- SC 46, provenant de l'un des ancêtres, se trouve associée à quatre haplotypes HLA différents, et se transmet indépendamment de la MA.

— SC 2 1,2 est d'un intérêt particulier puisqu'il présenté une duplication au locus

C 4 B:C 4 B 1,2, ce complotype est associé à trois haplotypes HLA différents tous porteurs de l'antigène HLA B14. Cette association allélique est introduite dans la famille par III5,

III14 et II3.

— SC 61 et SCQ01 composent le génotype du sujet IV13 et sont retrouvés uniquement dans la descendance de celui-ci.

3° La descendance du sujet II6 atteint, permet de démontrer l'absence de liaison entre les marqueurs du complément et la MA.

En effet, le génotype de ce patient a pu être déduit grâce à l'analyse de ses descendants et de sa conjointe encore vivante, il possède les complotypes suivants : SC31/SC46. Ses enfants atteints de MA ont reçu indifféremment les complotypes SC31(III10 et III11 ) et SC46(III8 et III13). Pour les sujets II2 et II4, nous n'avons pu reconstituer qu'un seul complotype à savoir respectivement SC 31 et SC 46.

Par contre, l'examen génétique des enfants du sujet II4 permet de montrer, soit directement, soit par déduction, qu'ils ont reçu le même complotype parternel (SC46) : le sujet ÏII4 est indemne, son frère III6 est atteint. D'autre part, leur cousin germain III2 indemne a reçu de son père atteint (II2) le complotype SC 31.

DISCUSSION. — L'hypothèse d'un déficit héréditaire en facteurs du complément envisagée initialement n'est pas confirmée à la suite de cette étude. En effet, aucun des sujets


154

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atteints de MA dans cette famille ne présente d'allèles silencieux C4A*Q0, C4B#Q0 ou C2*Q0 susceptibles d'être impliqués dans l'étiopathogénie de l'affection.

En outre, cette étude familiale permet de démontrer clairement qu'il n'existe aucune liaison entre la MA et les marqueurs du complément liés au complexe majeur d'histocompatibilité.

Par ailleurs, Weitkamp [11], dans une étude familiale de MA n'a trouvé aucune relation entre cette affection et les marqueurs Bf et GLO. Par contre, l'existence d'une association entre la MA sporadique et le variant C4B*2 a été signalée par Nerl et coll., 1982 [12] et ceci en l'absence d'une association avec un antigène HLA particulier. La discordance de ces résultats peut faire envisager l'hypothèse d'une étiologie différente entre les formes familiales et sporadiques de la MA.

Indépendamment de la MA, nous avons porté un intérêt particulier à la combinaison allélique SC 2 1,2 toujours associée à l'antigène HLA B14 et qui est introduite dans la

famille par trois conjoints. La fréquence des duplications au locus C4B estimée à partir d'études familiales est de l'ordre de 0,01. De plus, l'association avec l'antigène HLA B 14 est toujours retrouvée [13].

Dans l'étude qui nous concerne, il serait intéressant dans un premier temps d'approfondir la généalogie des sujets en cause afin de s'assurer qu'ils ne sont pas apparentés; cette hypothèse est à envisager dans la mesure où il s'agit d'une population relativement isolée géographiquement. Si aucun lien de parenté ne peut être décelé entre ces trois conjoints, il serait alors souhaitable d'entreprendre une étude portant sur l'ensemble de la population Calabraise afin de déterminer la fréquence des duplications C4B et de confirmer l'association à l'antigène HLA B14.

Reçue le 7 avril 1986.

RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES

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Centre national de Transfusion sanguine,

Institut, Laboratoire d'Immunologie,

6, rue Alexandre-Cabanel, 75015 Paris.


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IMMUNOLOGIE.— Recherches sur les mécanismes de défense antibactérienne chez les Insectes : isolement de peptides antibactériens dans l'hémolymphe du Diptère Phormia terranovae. Note de Elisabeth Keppi, Jean-Luc Dimarcq, Jean Lambert, Daniel Zachary, Jean-Marc Reichhart, Danièle Hoffmann, Rainer Keller et Jules Hoffmann, présentée par

Maurice Durchon.■

Trois groupes de peptides antibactériens ont été isolés à partir de l'hémolymphe immune de larves du Diptère Phormia terranovae par combinaison de traitement à la chaleur et différents "modes dé chromatographies

(échange de cations, permeation sur gel: et HPLC). Leur composition en acides aminés a été déterminée et

montre qu'il existe de fortes analogies entre les différents peptidès isolés.

Ils diffèrent des peptides antibactériens décrits chez d'autres insectes par plusieurs aspects qui sont discutés dans la Note. ,

IMMUNOLOGY- Studies on antibacterial defence mechanisms in insects: isolation of antibacterial peptidès in the immunë haemolymph of theDipteran Phormia terranovae.

Three groups ofantibacterial peptides were isolàted from immune haemolymph of larvae of the Dipteran Phormia terravnoae through a combination of heat-treatmënt, cation exchange chromatography, gel permeation chromatography and HPLC Their amino-acid composition Was dëtermined and showèd mqrkëd analogies between the various peptidès. '

They differed in several respects from known antibacterial peptieds such as cecropins and attacins of Lepidopte rans anf from Sarrcotxin I from theDi

INTRODUCTION. - Nous avons montré précédemment [1] que l'injection d'une dose faible de bactéries; à des larves du Diptère Phormia terranovae induit l'pparition dans l'hémolymphè de plusieurs protéines à activité antibactérienne. Ces molécules sont hautement thermostablës, basiques à des degrés différents (pi variant dé 7,5 a 9,5); leurs poids moléculaires sont inférieurs à 10OOOd, ,

Nous avons entrepris l'isolement et l'identification de ces molécules et rapportons ici quelques premiers résultats concernant trois de ces protéines.

MATERIEL ET METHODES. — (a) Souches bactériennes. — Escherichiacoli D 31 (mutant résistant à la streptomycme) et Enterobacter cloacae j312 (mutant résistant à l'acide nalidixique) sont des dons du Professeur Boman,

Université de Stockholm. Ces deux souches sont cultivées en âérobiose, à 37°C, sur milieu non défini [2] à

pH 7,2.

(b) 'Immunisation desinsectes et prélèvement de l'hémolymphe. — Des larves de troisième; stade de Phormia terranovae sont isolées peu après qu'elles aient quitté leur nourriture (jabot à moitié vidé) et sont maintenues à 2p9Ç:au contact de papier filtre humide. Avant immunisation, les larves sont lavées à l'èâu additionnée d'eau

de Javel à 2%

Des germes de E. cloacae en phase exponentielle de croissance (8000 germes dans 2 µl) sont injectés à Chaque

larve entre deux segments abdominaux, au moyen d'une seringue Hamilton de lO µl. L'hémolymphe est prélevée

après par piqûre de la partie antérieure de la larve. Une légère pression permet l'écoulement de 10 à 15 fil d'hémolymphe.Celle-ci est collectée dans des tubes; à centrifugation en plastique maintenus au froid et contenant.5µl d'Aprotinine (Sigma) à 14U/mg de protéine. Une centrifugatiôn à 36000xg pendant 20mn

permetl'élimination des hémocytes; le surnageant (plasma) est recueilli et congelé à — 80°C jusqu'à utilisation

ultérieure,,

(c) Test d'activité antibactérienne — Le milieu utilisé pour les cultures bactériennes est

gélosé à 12 un volume de 6ml de ce milieu est ensemencé avec 3.105 bactéries de la souche à éprouver,

additionné de antibiotique approprié et coulé en boîte de Petri. Des puits de 2 mm de diamètre sont percés dans la gélose et reçoivent 2µl de l'échantillon à éprouver. Les boîtes sont incubées pendant une nuit à 37°C.

Le diamètre des zones d'inhibition de croissance des bactéries est proportionnel a la concentration du facteur antibactérien présent dans l'échantillon [3] (d) Permeation sur gel, — Les échantillons sont déposés sur une colonne d'AcA 54(IBF) de format 60 x 0,9 cm,

équilibrée avec de l'acétate d'ammonium à 40mM, pH6,8. L'élution est effectuée avec 50 ml de la même

solution. On collecte des fractions de 0,5ml.

0249-6313/86/03030155 $2.00 © Académie des Sciences


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G R. Acad. Se. Paris, t 303, Série III, n° 5, 1986

(e) Chromatographie liquide à haute pression (HPLC). — Le matériel à chromatographier est lyophilisé puis dissous dans 200 µl de solution A (0,11% d'acide trifluoroacétique dans l'eau) et appliqué sur une cartouche de Sep-PakC18 (Waters). Après rinçage avec 4ml de la même solution, les molécules antibactériennes sont éluées avec 2 ml de la solution B (0,10% d'acide trifluoroacétique dans l'acétonitrile à 60%). Après évaporation à sec, les échantillons sont dissous dans 100 ul de la solution A et appliqués sur une colonne Bakerbond C18-WP (4,6 x250mm) et élues comme indiqué dans la section Résultats, à raison de 0,9ml/mn. Les profils d'élution sont suivis à 210 nm. Le système d'HPLC est constitué de deux pompes Model 510, d'un contrôleur de gradient, automatique Model680 et d'un injecteur Model U6K, tous de marque Waters.

(f) Analyse des acides aminés. — Les échantillons lyophilisés ont été repris dans 50 µl d'HCI5,7M (Pierce) et hydrolyses pendant 24 ou 48 h à 110°C dans des tubes de verre asséchés sous azote, évaporés et scellés. L'analyseur est un Biotronik LC 5000. L'utilisation de résine BTC 2710, de tampons citrate-borate et la détection à la ninhydrine sont conformes aux indications du fabricant,

EXPLICATIONS DE LA PLANCHE

Fig. 1. — Chromatographie liquide à haute pression en phase inverse de la fraction Ph II de l'hémolymphe immune de Phormia. La fraction active Ph II lyophilisée, obtenue après une perméation sur gel est reprise dans 100 µl de solution A et injectée en phase inverse dans une colonne Bakerbond C18-WP. L'élution est faite dans un gradient linéaire de 35 à 60% de solution B. Les fractions ont été collectées pendant 75 mn (0,9ml/mn; 1200-1500 pSi) et l'absorption des protéines a été suivie à 210nm. L'activité antibactérienne, repérée par le test d'inhibition en milieu gélose est indiquée en noir. Les chiffres 1, 2 et 3 se rapportent aux protéines Ph II-1, Ph II-2 et PhII-3. I : moment de l'injection; G : début du gradient.

Fig. 1. — Reverse phase HPLC of pool Ph II of immune haemolymph of Phormia. The lyophilized active pool Ph II obtained after gel permeation was taken µp in 100 µl of solvent A and injected into reverse phase on a Bakerbond C18-JW column. The elution was performed with a linear gradient from 35 to 60% of solution B. The fractions were collected for 15 min. (0.9ml/min; 1,200-1,500pSi) and the protein absorption monitored at 210nm. Antibacterial activity, determined by inhibition zone assay is indicated in black. 1, 2 and 3 refer to proteins Ph II-1 PhII-2 and PhlI-3. I: injection time; G: starting of the gradient

Fig. 2. — Purification finale par chromatographie liquide à haute pression des protéines PhII-1, PhII-2 et Ph II-3. Les pics d'absorption 1, 2 et 3 de la figure 1 ont été chacun rechromatographiés en HPLC en phase inverse isocratique sur une colonne Bakerbond C18-WP. L'éluant était à 44% de solution B. L'absorption des protéines était suivie à 210 nm. I : moment de l'injection; G : début de l'élution isocratique.

Fig. 2. — Final purification step of antibacterial proteins PhII-1, PhII-2 and PhII-3. Absorption peaksl, 2 and 3 from Figure 1 were each rechromatographed in isocratic reverse phase HPLC on a Bakerbond C1SWP column; the solvent was 44%B. Protein absorption was monitored at 210 m. I: injection time; G: starting of isocratic elution.

Fig. 3. — Chromatographie liquide à haute pression en phase inverse des fractions PhlII et PhlV de l'hémolymphe immune de Phormia. Les fractions combinées PhlII et PhlV obtenues après une perméation sur gel ont été reprises dans 130 u] de solvant A et injectées en phase inverse dans une colonne Bakerbond CI8-WP. L'élution a été faite avec un gradient linéaire de 35-50% de solution B. Les fractions ont été collectées pendant 80mn (0,9ml/mn; 1200-1500 pSi) et l'absorption protéique a été suivie à 210 nm. L'activité antibactérienne, repérée par le test d'inhibition sur gélose est indiquée en noir. Les chiffres 4, 5, 6 et 7 se rapportent aux protéines Ph III/IV-4, Ph III/IV-5, Ph III/IV-6 et Ph III/IV-7. I : moment de l'injection; G : début du gradient.

Fig. 3. — Reverse phase HPLC of pools Ph III and Ph lV of immune haemolymph of Phormia. The lyophilized combined pools Ph III and Ph lV obtained after gel permeation were taken up in 130 µl of solvent A and injected into reverse phase on a Bakerbond C1S-WP column. The elution was performed with a linear gradient (35-50% of solution B). The fractions were collected for 80mm. (0.9ml/min; 1,200-1,500/ pSi) and the protein absorption was monitored at 210 nm. Antibacterial. activity determined by the inhibition zone assay, is indicated in black. 4, 5, 6 and 1 refer to proteins Ph III/IV-A, Ph III/IV-5, Ph III/IV-6 and Ph III/IV-1. I: injection time; G: starting of gradient.

Fig. 4 a et b. — Purification finale par HPLC des protéines 4 à 7 de l'hémolymphe immune de Phormia. Les pics d'absorption de la figure 3 ont été chacun rechromatographiés en HPLC en phase inverse sur une colonne Bakerbond C18-WP. Pour 4 et 5 (fig. A a) les protéines ont été éluées dans un gradient de 35-50% de solution B, interrompu par un palier isocratique à 45% de solution B. Pour 6 et 7 (fig.4b) les protéines ont été éluées dans un gradient linéaire de 35-50% de solutionB. L'absorption protéique a été suivie à 210 nm; I : moment de l'injection; G : début du gradient.

Fig. A a and b. — Final purification of proteins A to 1 from immune haemolymph of Phormia. Absorption peaks A, 5, 6 and 1 were each rechromatographed in reverse phase HPLC on a Bakerbond Cls-WP column. For 4 and 5 (Fig. A a) the proteins were eluted with a linear gradient from 35-50% B interrupted by an isocratic step at 45% B. For 6 and 1 (Fig. A b), the proteins were eluted with a linear gradient from 35 to 50 % B. Protein absorption was monitored at 210nm. I: injection time; G: starting of gradient


PLANCHE I/ PLATE I

ELISABETH KEPPI

Fig.1

Fig-2

Fig. 3

Fig.4


PLANCHE II/PLATE II

TABLEAU I

Composition en acides aminés des protéines antibactériennes 1 à 7

isolées à partir de l'hémolymphe immune de Phormia.

Amino-acid composition of antibacterial proteins 1 to 7

isolated from immune haemolymph of Phormia.

Ph II Ph III, IV

1 2 3 4 5 6 7

Acide aminé Mol%

Asx. 12,94 12,51 13,11 12,25 12,11 11,87 11,89

Thr (°) 3,16 3.48 3,19 3,76 3,62 4,41 4,49

Serf) 4,23 5,89 4,07 5,63 5,69 4,94 4,78

Glx 6,65 8,11 6,45 6,00 5,67 7,51 7,44

Pro 11,07 10,14 11,44 9,30 10,15 8,75 8,98

Gly 18,60 18,13 18,56 17,87 18,36 14,80 14,49

Ala 4,28 4,46 3,98 5,26 4,92 5,84 5,94

Cys - - - - - <0,6 0,94

Val (b) 5,43 5,38 5,32 5,96 6,59 6,07 5,92

Met - - - <0,33 <0,23 0,66 0,86

IIe (b) 4,91 4,25 5,00 3,77 3,99 3,42 3,32

Leu (b) 6,89 5,80 6,80 6,47 6,81 6,09 5,56

Tyr (b) 5,76 5,59 6,04 5,49 5,37 4,62 4,24

Phee 2,40 2,35 2,39 2,68 2,70 4,18 4,27

His 4,68 5,05 4,67 5,05 3,95 5,24 5,01

Lys 3,92 3,86 3,77 5,48 5,16 6,73 6,75

Arg 5,08 4,99 5,20 5,04 4,94 4,87 5,12

Les résultats correspondent aux moyennes de deux analyses faites après 24 h (°) et 48 h (b) respectivement. Le tryptophane n'a pas été déterminé.

Results are means from two analyses: 24 hrs. (a) and 48 hrs. (b). Tryptophane was not determined.

TABLEAU II

Principales caractéristiques de quelques peptides antibactériens non-lysozymiques,

présents dans l'hémolymphe immune de Lépidoptères et de Diptères.

Comparison between some non-lysozymic

antibacterial peptides from the immune haemolymph of Lepidopterans and Dipterans.

Cécropines (a) Attacines (b) Phormia (d)

A D P5A P5F SarcotoxineI(c) 14 6 Poids moléculaire apparent (kDa) 4 3,8 20-23 20-23 5 9-10 9-10 9-10

pI >9,5 >9,5 8,3 5,7 - 7,8 8,2 8,5

Composition en acides aminés (en Mol %)

Asx "5,4 6,5 16,4 19,9 7,8 12,9 12,2 11,9

Thr 2,9 5,8 9,1 7,7 6,0 3,2 3,7 4,4

Ser 0,4 3,5 7,4 6,9 2,7 4,2 5,6 4,9

Glx 10,6 11,0 2,8 1,5 10,1 6,6 6,0 7,5

Pro 2,6 5,5 4,2 3,8 4,5 11,1 9,3 8,7

Gly 11,0 6,9 9,7 10,2 11,5 18,6 17,9 14,8

Ala 13,2 20,8 10,7 11,0 12,2 4,3 5,2 5,8

Cys 0 0 - - 0 0 0 <0,6

Val 9,0 12,8 4,7 4,8 5,9 5,4 6,0 6,1

Met 0 0 1,1 1,5 1,5 0 <0,3 0,7

Ile 9,9 2,8 3,4 5,5 6,7 4,9 3,8 3,4

Leu 3,0 5,5 6,0 6,2 4,1 6,9 6,5 6,1

Tyr 0 0 2,5 1,2 2,6 5,8 5,5 6,6

Phe 2,6 2,8 8,6 7,2 1,3 2,4 2,7 4,2

His 0 0 3,1 3,1 3,9 4,7 5,0 5,2

Lys 17,4 8,2 8,6 7,2 10,4 3,9 5,5 6,7

Arg 2,5 5,1 0,7 1,6 6,8 5,1 5,0 4,9

Trp - 2,8 1,0 0,5 1,5

(") Valeurs d'après Steiner et coll., 1981 et d'après Hultmark et coll., 1982; (b) d'après Hultmark et coll., 1983; (c) d'après Okada and Natori, 1983; (d) présent travail. (-) : non déterminé.

(a) From Steiner et al., 1981 and Hultmark et al., 1982; (b) from Hultmark et al., 1983; (c) from Okada and Natori, 1983; (d) présent paper. (-): not determined.


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RÉSULTATS. — Les premières étapes de notre purification ont été celles que nous avions déjà utilisées dans un travail précédent[1]: de l'hémolymphede larves immunisées, acidifiée à pH 4,5 par addition d'acide acétique 1M a été traitée à la chaleur (100°C, 5mn). Le surnageant a été soumis à une chromatographie par échange de cations d'où cinq groupes de fractions actives ont été élues : ces groupes,sont appelés ci-dessous Ph (pour Phormia) I à V en fonction de leur ordre d'elution reflétant une basicité croissante. Seuls Ph II, III et IV sont considérés dans la présente étude.

Les fractions Ph III ont été rassemblées, concentrées par lyophilisation et soumises à une chromatographie de perméation sur gel. Les fractions actives ont été asséchées sous vide, reprises dans un faible volume de solution A et soumises à une chromatographie liquide à haute pression en phase inversé. L'élution a été effectuée dans un gradient de 35 k 60% de solution B.

Comme le montre la figure 1, trois pics d'absorption possédant une activité antibactériénnè ont été clairement séparés dans cette expérience. Les molécules de chacun de ces pies ont été rechromatographiées séparément en HPLC en phase inverse isocratique. La pureté apparente a été jugée par densitométrie (fîg. 2).

Les fractions Ph lII et Ph IV obtenues après chromatographie échangeuse de cations ont été rassemblées et traitées comme les fractions de Ph II: perméation sur gel et chromatographie liquide à haute pression en phase inverse.

La figure 3 montre le profil obtenu en HPLC et indique la séparation de 4 pics d'absorption renfermant de l'activité antibactérienne. La figuré 4 présente le degré de pureté obtenu après rechromatographie en HPLC isocratique de chacun des pics.

Les molécules correspondant aux sept pics d'absorption, numérotés de 1 à 3 pour Ph II, et 4 à 7 pour Ph lII+IV, ont été soumises séparément à l'analyse de la composition en acides aminés. Les résultats, présentés dans le tableau I indiquent que les sept peptides antibactériens présentent des similitudes frappantes. Ils sont particulièrement riches en Asx, Pro et Gly (> 10 Mol%) et relativement riches en Glx, Leu et Arg (5-10 Mol %). Le pourcentage relatif en Lys (amino-acide basique) suggère l'existence de trois groupes de peptides : (a) 1 à 3 (3, 3 à 3,9Mol %), (b) 4 et 5 (5,2 et 5,5 Mol%) et (c) 6et 7 (6,7 Mol%). Ce résultat pourrait partiellement expliquer la basicité relative de Ph II, Ph III et Ph IV et traduit l'ordre dans lequel ces groupes sont élues à partir d'une colonne échangeuse de cations. Il ressort également une différence qualitative entre les groupés 4 et 5 d'une part, et 6 et 7 d'autre part, étant donné que les deux derniers peptides sont les seuls à présenter des traces significatives d'acides aminés soufrés. Il est probable, mais non démontré, que les peptides 4 et 5 correspondent à Ph III et 6 et 7 à Ph IV.

DISCUSSION. — Notre étude confirme nos résultats obtenus précédemment[1] qui montraient que l'injection de bactéries vivantes induit dans l'hémolymphe de larves de Phormia terranovae l'apparition de plusieurs protéines antibactériennes plus ou moins basiques. La combinaison de la précipitation à la chaleur, de la chromatographie par échange de cations, du tamisage moléculaire et enfin de la HPLC nous a permis d'aboutir à la purification de sept peptides et d'en déterminer la composition en acides aminés. Rappelons que les protéines antibactériennes dont l'analyse n'a pas encore pu être complétée (Ph I et Ph V) concourent également à l'activité globale de l'hémolymphe immune de Phormia. La méthodologie décrite dans cette Note et qui permet d'aboutir à l'isolement de peptides antibactériens purs est actuellement mise à profit au laboratoire pour séparerr des quantités importantes de ces peptidès en vue de leur séquénçâge.


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Le tableau II compare quelques caractéristiques biochimiques essentielles des peptides 1, 4 et 6 de Phormia à celles des autres molécules antibactériennes décrites jusqu'à présent chez les insectes : les cécropines, les attacines et la sarcotoxine I ([4] à [8]). Le poids moléculaire apparent des peptides antibactériens de Phormia analysés dans la présente étude indique une taille supérieure à celle des cécropines et de la sarcotoxine I mais inférieure à celle des attacines. Leur point isoélectrique se compare à celui des attacines E et F [5]; les protéines de Phormia sont significativement moins basiques que les cécropines, mais davantage que les attacines A à D.

En ce qui concerne la composition en acides aminés, les cécropines, les attacines et la sarcotoxine I diffèrent entre elles à plusieurs égards, ainsi que le montre le tableau IL Les peptides de Phormia se distinguent de ces trois familles de molécules antibactériennes, notamment par leur faible teneur en Lys et Arg et leur relative richesse en Pro et Gly.

Au vu de ces résultats, les peptides antibactériens de Phormia semblent représenter une

nouvelle classe de peptides antibactériens inductibles, différant à certains égards des

cécropines et des attacines de Lépidoptères et de la sarcotoxinel du Diptère Sarcophaga

peregrina. Cette classe comporte plusieurs sous-groupes de peptides de composition

voisine : il n'est cependant pas exclu que leur polymorphisme apparent puisse résulter

d'une dégradation partielle en cours de purification. Par ailleurs, comme les peptidès

antibactériens ont été isolés à partir de plusieurs milliers de larves, des différences

mineures entre les peptides d'un même groupe pourraient refléter un polymorphisme

allélique parmi les insectes utilisés pour cette étude.

Le travail de collaboration entre les laboratoires de Bonn et de Strasbourg a été financé par la Fondation Alexander vonHumboldt. R. Keller remercie la Deutsche ForsChungsgemeinschaft pour son soutien (Grant Ke 206/7-1).

Reçue le 7 avril 1986, acceptée le 26 mai 1986.

RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES

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E. K., J.-L. D., J. L., D. Z., J.-M. R., D. H. et J. H. :

Laboratoire de Biologie générale de l'Université Louis-Pasteur et Unité associée C.N.R.S. n° 672, Endocrinologie et Immunologie des Insectes,

12, rue de l'Université, 67000 Strasbourg;

R. K. : Institut fur Zoophysiologie, Endenicher Allée 11-13,

Rlieinische Friedrich Wilhelms Universitàt, 5300 Bonn, R.F.A.


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TOXICOLOGIE. — Première étude sur la toxicité expérimentale de nouvelles substances cytoslatiques : les cétonucléosides. Note de Moulay Àbdellah Alaoui-Jamali, Phu-Lich Nguyen, Ivan Chouroulinkov et René Truhaut, présentée par René Truhaut, Membre de l'Académie.

La relation entre la structure chimique des cétonucléosides et la toxicité chez la souris est apparue liée à la présence des groupements O=C — C = C ou O=C—C-—C dans la structure du sucre de ces molécules.

\G/

L'introduction du brome en position 3 du sucre du KN-35 augmente la toxicité, tandis que l'introduction du groupement O-acétyle en position 3 du JCN-3 modère celle-ci.

Les symptômes et les lésion organiques ne sont pas spécifiques. Cependant les composés KN-35 et KN-43 entraînent des altérations hématologiques avec une diminution du nombre dé globules blancs.

TOXICOLOGY. — Preliminary study on the toxicity of the new cytostatic drugs: ketonucleosides.

The relation structure/toxic effects on mice was related with the presence of the 0 = C — C = C or 0 = C—C C groupments in the sugar moiety of these molecules.

The introduction of bromine (Br) in3' of sugar of KN-35 increase toxicity, whereas, introduction of an O-acetyl groupment in 3' of sugar of KN-3 decrease toxicity.

The compounds has no specific signs of intoxication and histological damage. Nevertheless, KN-35 and KN-A3 are marked effects on hemopoietic cells with decrease on the number of white cells.

INTRODUCTION. — Synthétisés par Antonakis et coll. ([1], [2], [3]), les cétonucléosides KN-35, KN-43, KN-44 et KN-3( fig. 1) se sont révélés d'un grand intérêt biologique. En effet, ces substances inhibent la croissance de différentes cellules leucémiques et transformées in vitro ([4], [5], [6]) et certaines d'entres elles sont activés in vivo sur les leucémies L1210 et de Friend chez la souris ([7], [8], [9]). Dans le but d'envisager une application éventuelle de ces substances en thérapeutique humaine anticancéreuse, nous avons estimé utile d'évaluer leur toxicité chez les animaux de laboratoire. Cette Note préliminaire rapporte les résultats concernant leur toxicité chez la souris.

PROTOCOLE EXPÉRIMENTAL. — La toxicité aiguë est évaluée sur des souris DBA/2 mâles et femelles, par injection intrapéritonéale de doses croissantes des différents cétonucléosides.

Dans ce but, des lots de souris DBA/2 mâles et femelles de 50+ 5 jours (élevage local sans germes pathogènes) ont été formés par randomisation au moment de l'injection des produits. Pour chaque dose, 10 souris mâles et 10 souris femelles, réparties par nombre de 5 dans des cages d'élevage, sont utilisées.

Les cétonucléosides sont préparés juste avant l'injection. Le solvant est un mélange de solution physiologique (NaCl 9 %) et DMSO (9/1, v/v). Les injections ont.été réalisées par voie intrapéritonéale et chaque animal reçoit 0,5 ml de la solution ou du solvant.

Les critères d'intoxication et les doses toxiques sont définis pour une échéance de 8 jours, au-delà de laquelle les animaux survivants retrouvent un état apparemment normal. Les doses toxiques sont définies comme suit :

DLO plus forte dose administrée non mortelle.

DL16, DL50 et DL84 : doses qui tuent 16, 50 et 84 % des animaux respectivement.

Elles sont calculées par la méthode graphique de Litchfield et Wilcoxon [10], Les limités de confiance sont déterminées pour le seuil de probabilité p=0,05.

DL100 : plus petite dose administrée, toujours mortelle.

Certaines souris ont été soumises à des examens hématologique et histologique. Le sang prélevé au niveau du sinus orbitaire est utilisé pour le comptage des globules rouges et des globules blancs sur un compteur électronique (Coulter modèle Z, Coultronics, France). Les examens hématologiques sont effectués avant le traitement et à intervalle régulier de 2 jours après le traitement et ceci pendant 2 à .3 semaines. Pour l'étude en microscopie optique, les organes prélevés sont préparés dans du Bouin, fixés dans des bains d'alcool et de xyène, puis colorés avec de l'hémalun-érythrosine et du safran.

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Structure chimique des cétonucléosides. Chemicals structures of ketonucleosides KN-35, KN-43, KN-AA, KN-3 and KN-Tx.

Numérotation internationale des cétonucléosides Nomenclature of ketonucleosides

N° Noms chimiques

KN-35 7 (3'-bromo-2'-céto-3'.4'.6'-tridésoxy-p-L-glycéro-hex-3'-énopyranosyl) théophyllinê

KN-43 7 (4'-céto-2.3'.6'-tridésoxy-P-L-glycéro-hex-3'-énopyranosyl) théophyllinê

KN-44 7 (4'-céto-2'. 3'. époxy-p-L-fucosyl) théophyllinê

KN-3 7 (3'-0-acétyl-2'-céto-4.6'-bis désoxy-P-L-glycéro-hex-3'-énopyranosyl) théophyllinê

KN-Tx 7 (3'.4'-isopropylidène-P-L-fucopyranosyl) théophyllinê

SYMPTOMATOLOGIE. — 1 à 2 jours après administration des cétonucléosides, les animaux présentent un amaigrissement important et précoce. Dans certains cas, en particulier avec les doses mortelles, nous avons observé des diarrhées sanguinolantes suivies de constipation. Pour les doses toxiques, il apparaît une ataxie avec des troubles de la locomotion et de l'équilibre, localisés au niveau du train postérieur. L'hypersensibilité est presque constante et la mort est précédée par une paraplégie. Avec le KN-Tx, composé correspondant au KN-3 avant oxydation, dénué d'activité cytostatique in vitro et utilisé comme témoin, l'animal présente des crises tétaniques typiques, rappelant l'intoxication par la strychnine, même pour des doses par ailleurs non toxiques. Ces crises sont intermittentes, puis finissent par régresser et l'animal revient à son état normal.

RÉSULTATS. — Les résultats obtenus, exprimés en milligrammes par kilogramme ou en millimoles par kilogramme, sont regroupés dans le tableau.

Statistiquement, avec le test de tendance linéaire des proportions permettant la comparaison deux à deux des groupes mâles et femelles, les différents cétonucléosides n'ont révélé aucune différence significative entre les mâles et les femelles.

Dans tous les cas, les droites représentatives des probits des mortalités en fonction des logarithmes des doses ont une pente très forte; la dose infraléthale est ainsi proche de la DL50. Par ordre décroissant de toxicité, le KN-35 est le plus toxique, puis viennent les composés KN-43, KN-44, KN-3 et enfin le KN-Tx.


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TABLEAU

Toxicité des cétonucléosides KN-35, KN-43, KN-44, KN-3 et KN-Tx,

chez la souris après injection intrapéritonéale unique

Acute toxicity of ketonucleosides KN-35, KN-A3, KN-A4. KM-3 and KN-Tx

on mice after single intraperitoneal injection

Nombre Doses toxiques C) (mg/kg)

Groupements d'animaux ——— — DL50

Produits. chimiques (a) . (b) DLO DL16 DL50 DL84 DL100 (mmoles/kg)

KN-35 80 . 10 , 12 26 55 60 0,070

Br Ni (19.70-34.32)

HN-43 ' 80 30 45 60 79 100 0,207

(53,57-67,20)

KN-44.......,..:... 80 30 48 66 92 120 .0,220

(56.61-76.19)

KN-3. ....... . 80 50 70 110 160 200 0,316

Ac G (95,65-126.50)

OH

KN-Tx 9 ,80 .400 610 775 980 1000 .2,190

(679.82-883.50)

CH3 CH3

(") Groupements responsables de l'activité biologique. . . .

(') Pour chaque composé, les lots sont composés de 40 souris 6* et 40 souris .$. C) Doses toxiques déterminées pour une échéance de 8 jours DL0 et DL100 expérimentales; DI.16, DL50 et DL84 calculées.

L'administration IP répétée d'une dose non toxique plusieurs fois de suite conduit à une amplification des effets toxiques, laissant présumer une toxicité cumulative. La connaissance de la cinétique d'élimination pourrait permettre de vérifier cette hypothèse.

LÉSIONS ANATOMO-PATHOLOGIQUES. — Des examens histologiques ont été effectués au microscope optique sur des coupes de différents organes. Aucune lésion spécifique n'est détectée au niveau du foie, de la rate,; des intestins et des reins. Des congestions, une stéatose inconstante et quelques foyers inflammatoires sont notés au niveau du foie et du rein.

Après administration d'une dose voisine de la DL50, le nombre de globules rouges diminue légèrement (3-7 %) au début du traitement pour revenir à l'éiat normal à la fin de la première semaine après traitement. Par contre, la diminution du nombre des globules blancs est importante (10-20 %) au début de la première semaine, puis se stabilise ensuite pour augmenter progressivement vers la fin de la deuxième semaine.

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Avec la DL16, la lignée rouge n'est pas modifiée et la lignée blanche diminue légèrement (5 à 10 %) pendant les 3 premiers jours après le traitement pour revenir à l'état normal une semaine après.

DISCUSSION. — Nos études précédentes effectuées sur des cellules leucémiques et transformées, en culture, ont montré que la présence des structures 0 = C —C = C ou 0 = C —C C dans la partie sucre des cétonucléosides est indispensable à l'activité

cytotoxique. Les composés dépourvus de ces structures sont inactifs. L'introduction du brome en position 3' du sucre du KN-35 augmente la cytotoxicité; par contre, la présence du groupement O-acétyl en position 3' du sucre du KN-3 modère celle-ci [6].

Des résultats similaires sont obtenus chez l'animal : le KN-35 est le plus toxique à cause de son atome de brome, les KN-43 et KN-44 ont une toxicité intermédiaire, le KN-3 est moins toxique à cause du groupement O-acétyle et enfin le KN-Tx qui est l'équivalent du KN-3 avant oxydation et qui est complètement inactif in vitro, présente une toxicité très faible. Ils confirment le rôle des structures 0 = C — C = C ou 0 = C — C C et laissent suggérer que les cétonucléosides agissent par eux-mêmes

et non par le biais d'une transformation métabolique. Des études de pharmacocinétique permettront d'éclaircir ce problème.

Le mécanisme d'action de ces composés est encore mal connu. Cependant, in vitro, sur des cellules L1210 [11], le KN-3 réduit considérablement le taux des groupements — SH de la surface membranaire, et est sans effet, sur les groupements — SH des protéines solubles intracellulaires. Au contraire, le KN-35 entraîne une dépletion considérable des groupements thiols des protéines solubles intracellulaires et est sans effet sur les thiols de la surface membranaire. Or, in vivo, les groupements thiols des protéines sont sous forme — SH inactive et seule la forme ionisée — S- semble réagir avec des agents susceptibles d'alcoyler les fonctions thiols ([12], [13]). Il est donc peu probable que l'alcoylation des thiols protéiques puisse être l'unique responsable des effets toxiques observés après administration de ces produits. En outre, étant donné les faibles doses utilisées (quelques milligrammes), on s'explique mal comment l'estérification de quelques groupements carboxyles ou l'alcoylation de quelques fonctions thiols puissent entrer en compte dans les effets toxiques voire biologiques de ces composés. D'après Roberts et Warwick [14], l'alcoylation des groupements thiols présents dans de petites molécules telles que la cystéine ou le glutathion peut être considéré comme une détoxification de certaines substances alcoylantes. Par contre, le couplage avec des protéines sériques, telles que l'albumine ou des polypeptides, peut protéger ces molécules d'une hydrolyse rapide et peut participer indirectement à la prolongation de leur effet biologique, voire même à la diminution de leur toxicité [15].

Les résultats de cette étude, ont permis de tirer les conclusions suivantes :

— Le KN-43 et le KN-44 sont environ 3 fois moins toxiques que le KN-35, alors que leur activité cytostatique vis-à-vis des cellules leucémiques est aussi importante. Nous poursuivrons nos recherches dans le but d'envisager une future utilisation en thérapeutique de ces composés.

— A cause de la toxicité forte du KN-35, qui limite son utilisation thérapeutique, nous envisagerons de coupler ce composé avec des protéines sériques capables de protéger les réactions avec les groupements thiols et d'observer ensuite les modifications de


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l'activité biologique. De même, le couplage du KN-3 peut permettre de voir si l'activité de ce produit serait susceptible d'être augmentée dans le cas où ses réactions avec les thiols contribueraient à son inactivation. Reçue le 12 mai 1986.

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M. À. A.-J. et I. C. : Institut de Recherches scientifiques sur le Cancer,

E.R. 304, B.P. n° 8, 94802 Villejuif Cedex;

P.-L. N. et R. T.: Faculté de Pharmacie, 4, avenue de l'Observatoire, 75006 Paris.



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BIOLOGIE MARINE. — Prises simultanées de l'azote minéral et de l'urée par les digues unicellulaires des claires ostréicoles: effet de la source d'azote sur la nature du peuplement Note de Jean-Michel Robert, Marie-Laiire Vincendeau, Serge Y. Maestrini et Anne Marion, présentée par Jean-Marie Pérès.

Un échantillon naturel de phytoplancton printanier de claire est mis simultanément en présence de N-NH4, NO~ et d'urée. La prise de l'azote minéral par les algues se fait selon le processus: prise immédiate de NH.J, NOJ n'étant prélevé que lorsque la concentration en NH4 n'atteint plus que 22,4 ug—at.l- 1. L'utilisation de l'urée est concomitante de celle des deux autres formes. Toutefois, elle n'apparaît importante qu'après épuisement de l'azote minéral. Elle est due au développement des Flagellés, les Diatomées utilisant préférentiellernent lésions NH^ et NOJ..

MARINE BIOLOGY. — Simultaneous uptake bf inorganic nitrogen and urea by the unicellùlar algae of oyster-ponds: effect of the nitrogen source on the community composition.

A natural spring phytoplankton sample of oyster-ponds is grown in the simultaneous présence of N-NH4, NO^" and urea. The inorganic nitrogen uptake by the algae opérâtes according to that process: NH4 is immediately taken up while the NO3" uptake bégins only when the NH^ concentration has decreased to '-22,4 \tg-at. I~x. Urea is simultaneously taken up with the two other forms; however, its more important uptake occurs only when the inorganic nitrogen is exhausted. It is due to a development of flagellâtes while NH^ and NCÇ are prèferentially taken up by Diatoms.

INTRODUCTION. —. Les eaux des claires ostréicoles, bassins d'immersion des huîtres pour leur affinage, se caractérisent par de fortes teneurs en azote minéral sous les formes ammoniacale et nitrique, mais aussi par des concentrations en azote organique dissous parfois élevées, de l'ordre de 30 à 40su.g-at.l~ 1, surtout quand les huîtres y sont immergées [1]. L'azote minéral constitue l'élément prépondérant contrôlant la fertilité des claires [2]. De plus, l'utilisation concomitante des ions NH4 et NO^ par les microalgues des bassinsj est contrôlée par les concentrations respectives de ces deux formes azotées ([3],[4]). En outre,l'azote organique dissous peut être directement assimilé'■■[!]. La question se posait donc de rechercher si les fortes teneurs en azote organique estimées dans le milieu naturel pouvaient modifier le schéma habituel de la prise de l'élément par les algues sous sa formé minérale, et dans quelle mesure elles pouvaient orienter la composition spécifique des peuplements. Plus précisément, il s'agissait de rechercher si, pour les algues des claires, l'urée inhibe effectivement l'absorption de NO3, comme l'ont montré McCathy et Eppley [5] sur du phytoplancton océanique, ou bien si les trois formes de l'azote sont prélevées simultanément, comme l'ont observé Price et coll. [6] chez d'autres espèces phytoplanctoniques. Dans ce but, une expérimentation a été conçue de manière à placer un échantillon naturel d'algues de claire en présence de concentrations voisines d'azote fourni à la fois sous les formes ammoniacale, nitrique et urée. Les teneurs ont été choisies proches de celles estimées dans Tes eaux ostréicoles; elles caractérisent une eau de fin d'hiver-début du printemps.

.PROTOCOLE EXPÉRIMENTAL. — De l'eau d'une claire est prélevée au début du printemps puis filtrée sur membrane, de porosité de 0,45 um. Elle est ensuite répartie dans trois barils de verre de 25 1 de contenance, chacun communiquant les uns avec les autres de façon à ce que le volume total de la culture soit de 75 1. Une suspension d'algues provenant d'un peuplement naturel de claire concentré par filtration sur soie à bluter de 70 um de vide de maille, est inoculée dans les barils de manière à ce que la concentration initiale en chlorophylle a de l'eau atteigne 5 ug chla. 1_ 1. Les formes ammoniacale et nitrique de l'azote, ainsi que l'urée, sont ajoutées de façon à ce que leurs concentrations respectives soient initialement de l'ordre de 25 (j.g-ât.1- 1 pour l'azote minéral et 35 ug-at.l- 1 pour l'azote organique. Les cultures sont incubées dans les conditions naturelles de température et d'éclairemènt, par immersion des barils dans un bassin. La biomasse est estimée par mesure des densités cellulaires ainsi que des teneurs en chlorophylle a et en azote et carbone particulaires. L'utilisation dés ions NH4 et NO3. et de l'urée par les algues est estimée par diminution de leurs concentrations respectives dans le milieu. La quantité d'azote nitrique intracellulaire est déterminée parallèlement. L'évolution dé la composition spécifique du peuplement mis en culture est suivie jusqu'en fin de croissance des algues.

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Fig. 1. — Diminution des concentrations en NH4, NO3 ainsi qu'en urée, dans le milieu de culture; variations concomitantes des concentrations en nitrate intracellulaire et augmentation de la biomasse exprimée par la teneur en chlorophylle a (chl a).

Fig. 1. — N-NH4, NO3 and urea concentration decreases due to algal growth; simultaneous variations of cellular nitrate content and biomass increase, expressed by chlorophyll a content (chl a).

RÉSULTATS ET DISCUSSION. — l. Prise de l'azote (fig. 1). — La prise de l'azote ammoniacal par les algues commence immédiatement, alors que l'azote nitrique n'est prélevé qu'au bout de 70 h d'expérience: quand la concentration en NH4 a atteint 22,4 ug-at. I- 1, le prélèvement de NO^" commence selon un taux réduit de 0,11 ug-at N.l_1.h_ 1; ce taux ne se modifie pas pendant près de 70 h, jusqu'à ce que la réserve en azote ammoniacal ait atteint près de 7,7 ug-at, 1_ 1. A partir de cette valeur-seuil, le prélèvement des nitrates par les algues augmente et atteint 0,29 ug-at N.l_1.h_ 1. L'absorption de l'urée se fait de façon concomitante de celle des deux autres formes d'azote, dans un premier temps au taux très réduit de 0,036 ug-at N.l-1.h- 1. La vitesse maximale d'absorption de la substance ne s'établit qu'après épuisement de la réserve en NH4 et NOJ" : elle atteint alors 0,37 µg-at. I- 1 .h~ 1, taux de prise d'azote le plus élevé.

L'addition simultanée d'urée à une concentration proche de 40 µg-at.I" 1 ne modifie en rien le processus de l'absorption des formes minérales de l'azote par les microphytes des claires: il y a utilisation concomitante des ions NHj et NOJ, alors que la concentration en NH4 est encore près de 30 fois supérieure à la limite habituellement fixée pour les algues [3]. La plus forte proportion de l'azote organique n'est prélevée par le peuplement algal que lorsque la réserve minérale du milieu est épuisée.

IL Évolution de la biomasse. — La prise de l'azote se traduit par un accroissement notable de la biomasse : la teneur en chlorophylle a atteint 127 µg. 1 ~1 en fin de croissance des algues, correspondant à une densité numérique de 32.106 cellules. 1_ 1 (fig. 1 et 2). Il existe d'ailleurs une relation linéaire entre la quantité de chlorophylle a produite et la


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quantuité d'azote prélevé sous les formes minérale et organique (fig. 3). Toutefois, les fortes teneurs initiales en NH4 et en urée pourraient laisser supposer l'intervention des bactéries dans d'éventuels processus de reminéralisatiôn de l'uréè et de nitrification à partir de l'ammoniaque. Mais la corrélation hautement significative entre l'azote particulaire produit et la'totalité dé l'azote assimilé, ainsi que le rapport N particulaire/N dissous prélevé, proche de 1(=0,93), sont autant de preuves de l'utilisation directe de l'azote organique par les algues de claire et non par les bactéries (fig. 3).

III. Composition spécifique du peuplement et source d'azote. — L'augmentation de la biomasse corrélative de la prise d'azoté sous ses trois formés est due à ;ïin accroissement des populations de Diatomées et, dans une moindre mesuré, des Flagellés (fig. 2). L'enrichissement en: azote conduit à la multiplication intensive des Diatomées Nitzschia elosteriùm (Ehrenberg), Smith et Nitzschia ovalis Arnott, espèces présentes initialement à faible concentration ^en fin de croissance du peuplement, elles représentent à elles seules 50 % de l'effectif des Diatomées inventoriées. Toutefois, leur prolifération ne s'effectue pas de façon concomitante : il y â d'abord multiplication de M. elosteriùm dont la densité

Fig. 2 Fig. 3

Fig. 2. — Variations des densités numériques en Diatomées et Flagellés (x 106 cellules, l- 1) pendant la période -. de croissance algale et évolutions, parallèles des nombres de cellules dès espèces dominantes Nitzschia y. closteriùm et Nitzschia ovalis.

Fig, 2. — Cell density variations of diatoms. and flagellates (x 1O 6 cellules. ï- 1) during the algal growth, and simultaneous evolutions of cell abundance of the dominant specieS Nitzschia.closteriùm. and Nitzschia ovalis.

Fig. 3. —Biomasse produite par les algues ; en fonction de la quantité : totale, d'azote prélevé sous les trois . formes, NH4, NO3 et urée; la biomàsse est exprimée par les teneurs en chlorophylle à (chl a) et azote

particulaire (PON).

Fig. 3. Algal biomass produced versus total nitrogen (N).taken up under NH4, NO3 and urea forms; the biomass is expressed by the chlorophyll à (chl : a) and particulate nitrogen (PON) contents.


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numérique maximale atteint 11,4.106 cellules.I" 1 après 7 jours de culture, alors qu'elle est de 5,1.106 cellules. 1_ 1 pour N. ovalis, après 10 jours (fig. 2). L'effectif en Flagellés ne s'accroît pas régulièrement: alors qu'en début de culture il augmente conjointement avec celui des Diatomées, il se stabilise et même diminue après 5 jours, puis augmente à nouveau au bout de 8 jours pour atteindre 11,8. Î06 cellules. 1_ 1 après 10 jours (fig. 2).

La source d'azote détermine de façon sélective le développement des populations d'algues au sein du peuplement. Ainsi, la diminution des teneurs en NH4 et NO3 apparaît liée principalement au développement des Diatomées, celle des teneurs en urée à la multiplication des Flagellés. Il apparaît clairement que si l'azote ammoniacal est directement utilisé par les Diatomées et les Flagellés, une concentration élevée en nitrates oriente la production algale vers celle des Diatomées lorsque la réserve en azote ammoniacal est pratiquement épuisée. La disparition du nitrate intracellulaire correspond d'ailleurs exactement à l'arrêt de la croissance des Diatomées (fig. 1 et 2). En revanche, la prolifération des Flagellés se fait à partir de l'urée, mais quand la concentration en NOJ du milieu n'atteint plus que 3 ug-at.I- 1.

Parmi les Diatomées, la plus grande précocité de N. elosteriùm à se développer par rapport à JV. ovalis peut être interprétée comme une plus grande aptitude de la première espèce à prélever à la fois les deux formes NH4 et NO3 pour une concentration en NH4 plus élevée. Deux d'entre nous ont montré en effet que la concentration-seuil en NH4 au-dessous de laquelle NOJ peut être consommé par des Diatomées de claire, diffère selon les espèces [4].

CONCLUSION. — La présence de fortes teneurs en urée dans les eaux des claires ne modifie en rien les caractéristiques d'assimilation des ions NH4 et NOJ par les algues unicellulaires dominantes de ces milieux : elle n'entraîne pas d'inhibition de la prise des deux formes minérales de l'azote comme l'ont observé Price et coll. [6] avec d'autres espèces algales. L'utilisation concomitante de l'azote minéral et organique par les microphytes marins peut être considérée comme caractéristique des espèces des milieux néritiques riches en matière organique dissoute, surtout si on considère les peuplements algaux dans leur ensemble. En outre, on observe que de fortes proportions en nitrates conduisent à la production dominante des Diatomées, celles de l'urée à la multiplication active des Flagellés, sources potentielles de nourriture pour les Mollusques Bivalves mis en élevage. L'azote organique dissous contribue à l'augmentation du niveau de la production micro-algale des eaux ostréicoles ainsi qu'à l'évolution de la composition des peuplements. Reçue le 17 février 1986, acceptée après révision le 2 juin 1986.

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Université de Nantes, 2, rue de la Houssinière, 44072 Nantes Cedex;

J.-M. R. et S. Y. M.: C.R.E.M.A.-L'Houmeau, Case n° 5, 17137 Nieul-sur-Mer.


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PARASITOLOGIE ANIMALE.— Action de la microsporidie Thelohania contejeani sur la charge énergétique adénylique de l'Ecrevisse hôte : Austropolamobius pallipes Le., 1858. Note dé Pascal Coste et Claude Chaisemartin, présentée par Maurice Durchon.

Thelohania contejeani altère la composition biochimique tissulaire de l'écrevisse pallipède hôte. Ces modifications sont traduites dans les variations importantes de la charge énergétique adénylique.

ANIMAL PARASITOLOGY. — Effect of microsporidan Thelohania contejeani on the adenylic load in the crayfish: Austropotamobiuspallipes. Le., 1858.

Thelohania contejeani (Microsporida); interaction with its crayfish host significantly altered the biochemical constituents of host tissues. Modifications were reflected in substantial variations in the crayfish's adenylic energetic load.

Les signes cliniques et histopathologiques chez l'écrevisse pallipède atteinte de microsporidiose à Theloharnia contejeani (Henneguy et Thelohan, 1892) reposent sur le remplacement progressif de la musculature squelettique par des spores, ultime étape du cycle des schizontes qui ont envahi les myofibrilles. Les spores sont au nombre de 8 dans un pansporoblaste. Elles désorganisent la structure myofibrillaire [1].

Au tout premier stade de l'infestation, une observation macroscopique de l'hôte révèle des foyers indépendants, traduits par des stries blanches au niveau des muscles fléchisseurs abdominaux qui sont toujours translucides chez les écrevisses saines ([2], [3], [4]). Chez les écrevisses massivement atteintes, le tégument abdominal est bombé sous l'effet des fibres musculaires sous-jacentes, gonflées par la présence des spores en très grande

quantité ([5],

Les microsporidies modifient la composition biochimique et électrolytique des tissus infestés ([8], [9]). L'environnement cellulaire de l'hôte agit, réciproquement, sur les activités métaboliques du parasite. De telles perturbations induites restent relativement peu étudiées

([10],[11]).

Cette étude vise à préciser les principales étapes de la progression du parasitisme par la microsporidie grâce à un indice biochimique caractérisant l'état physiologique de l'écrevisse parasitée : la charge énergétique adénylique (AEC).

MÉTHODES. — Les écrevisses pallipèdes femelles de 5 à 10 g, capturées à la fin de la période annuelle des mues, sont plongées entières dans de l'azote liquide. Pour pallier une altération des nucléotides, elles sont conservées à —40°C.

De petites sections des musclés fléchisseurs abdominaux, au niveau du cinquième sternite, permettent, après coloration au bleu de toluidine, de déterminer l'extension du développement parasitaire et du niveau individuel d'infestation. Les écrevisses sont réparties en quatre lots de huit individus :

- écrevisses saines;:,

— infestation légère : < 103 formes parasitaires par gramme de tissu musculaire frais;

— infestation moyenne : de 103 à 106 formes parasitaires par gramme de muscle et avec un plus grand nombre de jeunes sporoblastes;

— infestation massive : >108 formes parasitaires par gramme de muscles atteints; à ce stade, les muscles mandibulaires sont aussi concernés.

L'énergie métabolique mobilisable par un individu peut s'exprimer par la charge énergétique adénylique définie à partir des concentrations en nucléotides adényliques, obtenues par le protocole [12] faisant intervenir les systèmes enzymatiques pyruvate-kinase et myokinase, d'une part, et luciférase, de l'autre.

Le protocole est le suivant :

Extraction du broyat dans 5 ml d'acide perchlorique à 6 %; libération des trois nucléotides de façon similaire par rupture des parois cellulaires. Le broyat est placé au contact de 5 ml d'acide perchlorique pendant 30 mn

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TABLEAU I

Effets de l'infestation microsporidienne à Thelohania sur la charge énergétique adénylique et des nucléotides. Les valeurs des concentrations, exprimées en moles par mg de protéines sont des moyennes affectées de l'intervalle de confiance au seuil de probabilité de 0,05 (taille de l'échantillon entre parenthèses).

Effects of microsporidan infection of Thelohania on adenylic energetic load and of nucleotids. All values are the mean ± 95% confidence interval (sample size in parentheses).

Descripteur AEC ATP ADP AMP

Échantillon écrevisses saines 0,74 + 0,09 2,31 + 0,32 1,68 + 0,28 0,55 + 0,08

(8) (8) (8) (8)

Début de l'infestation 0,84 + 0,14 2,74+0,38 1,19±0,14 0,22±0,11

(8) (8) (8) (8)

Infestation moyenne 0,21 + 0,03 0,28±0,07 0,04+0,01 1,86 + 0,19

(6) (6) (6) (6)

0,77±0,12 0,63±0,18 2,04±0,26 0,34±0,09

(5) (5) (5) (5)

Infestation massive. ....... 0,45 + 0,08 0,31 + 0,06 0,11±0,03 1,87 + 0,21

(8) (8) (8) (8)

à —4°C, après homogénéisation au Polytron, neutralisation du surnageant à pH 7 par K2C03 à 0,5 M, centrifugation pendant 10 mn à 10000 tr/mn.

Dosage des protéines. — Le culot est remis en suspension par 10 ml de NaOH 1 N, en vue d'un dosage des protéines par la méthode du biuret.

Après neutralisation, le précipité de KC104 est éliminé par une autre centrifugation pendant 10 mn à 10000 tr/m. Les extraits sont conservés à — 20°C.

Dosage des nucléotides. — Pyruvate-kinase et Myokinase. — Les enzymes sont présentés en suspension dans (NH4)2S04. A chaque dosage, une quantité suffisante est centrifugée et le culot est repris dans le milieu réactionnel

TRIS à 0,5 M : 5 ml;

K2S04 à 0,5 M : 1,875 ml;

MgS04, 7 H2O à 0,1 M : 2,5 ml;

EDTA 0,770 M : 0,2 ml;

q.s.p. = 50 ml eau bidistillée.

Solution S : elle est préparée extemporanément en introduisant 25 ul de PEP à 1 mg dans 500 ul, dans 1 ml de la solution précédente.

Luciférine-luciférase. — Ils sont obtenus en KIT; nous ajoutons 5 ml d'eau bidistillée au lyophylisat. A l'instant du dosage, celte solution mère est diluée à 1/5 par du dithiothréitol 2.10- 3 M, lequel stabilise l'enzyme pendant la durée de la réaction.

Solution étalon d'ATP. — La solution mère à 10- 3 M est conservée au congélateur à —20°C. Une dilution est réalisée au moment du dosage.

Dosage des échantillons. — Dans les microfuges contenant les milieux réactionnels et l'extrait à doser, la solution de luciférine-luciférase est ajoutée au moment du dosage. Le scintillateur liquide (Packard TRI-CARB) « minute » les opérations : la lecture est déclenchée avant la décroissance du pic du signal lumineux. Un chronomètre est déchenché au temps t = 0.50 ul de luciférine-luciférase sont injectés au temps t=10s. La microfuge est placée en position de lecture par le compteur et l'enregistrement de la lecture n'est déclenché qu'au temps t = 50 s. Les photons émis au cours de la réaction sont traduits en coups par minute. Les mesures des nucléotides sont répétées trois fois pour chacun des extraits. La concentration correspondante en ATP total est déterminée sur la courbe étalon à partir de la moyenne des trois mesures effectuées.

Le rapport : ATP+1/2ADP/ATP+ADP+AMP varie par définition de 0 (« pool » adénylique sous forme d'AMP) à 1 (« pool » sous forme d'ATP).

Cette valeur est située près de 0,8 pour les organismes pluricellulaires; 0,7 pour les conditions optimales répond à un organisme en « bon état physiologique ». Les valeurs passent à 0,5 quand les conditions sont limitantes et sont inférieures à 0,5 en conditions sublétales, plus ou moins irréversibles.


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RÉSULTATS. -Mesures de la charge énergétique (AEC). — Les paramètres biochimiques ATP, ADP, AMP et protéines ont été mesurés d'une part sur les écrevisses saines et d'autre part sur les écrevisses parasitées aux trois degrés ci-dessus indiqués. Les valeurs les plus significatives sont réunies dans le tableau.

Chez les écrevisses saines, dans une population homogène, la répartition des valeurs de la charge énergétique adénylique suit une loi normale. La valeur moyenne est de : 0,77 + 0,08 pour des conditions optimales correspondant à un bon état physiologique. Les valeurs diminuent à 0,6 sous l'action de certaines nuisances liées à des milieux perturbés.

Dans le cas dès écrevisses à infestation légère, la charge énergétique est supérieure à la moyenne des; témoins. Les teneurs des nucléotides, pris isolément, montrent que l'augmentation de l'AEC est réalisée par une chute de la concentration en AMP.

Pour les écrevisses moyennenment infestées, les charges énergétiques évoluent différemment et deux modes de comportement apparaissent. Une partie des écrevisses [3] ne maintiennent pas leur niveau métabolique. La charge énergétique est, par contre, plus ou moins maintenue chez les autres [2]. L'observation individuelle des concentrations de nucléotides traduit la différence dans le comportement métabolique des écrevisses à haute ou à faible valeur de charge.

Dans le cas des écrevisses présentant une infestation massive, les charges énergétiques sont significativement plus faibles que celles notées chez les écrevisses saines, même soumises à des stress les plaçant dans des conditions limites, soit : 0,6.

DISCUSSION. — Les perturbations dans la composition biochimique des tissus infestés par les microsporidies intracellulaires se traduisent souvent par une altération significative des électrolytes, des glucides, des protéines et des « pools » d'acides aminés libres dans les cellules de l'hôte [13]. La diminution du glycogène doit provenir d'une augmentation des demandes métaboliques musculaires ou du développement des parasites.

Le but de ces mesures était de vérifier que la charge énergétique adénylique pouvait être un indice positif pour contrôler le métabolisme des écrevisses atteintes de thélohaniose. Nous avons montré que des modifications importantes de la charge énergétique sont induites par un gradient de contamination parasitaire.

Chez les écrevisses hôtes, au début de l'infestation parasitaire, la disparition de l'AMP est catalysée par l'AMP désaminase et nous pouvons supposer que l'induction de l'infestation est conditionnée par la balance des nucléotides adényliques. Pendant la période la plus active de la sporoblastogenèse, certaines écrevisses épuisent leur charge en ATP et ADP et accumulent de l'AMP. La valeur très faible de la charge énergétique adénylique les place manifestement en sursis.

D'autres écrevisses, au même stade d'infestation, maintiennent leur « pool » d'ATP et d'ADP aux dépens du « pool » d'AMP. Leur charge énergétique, plus ou moins maintenue, leur permettra, vraisemblablement, de résister au stress pendant plusieurs mois. A partir d'un lot d'individus suffisant, il serait intéressant de préciser les phénomènes physiologiques liés à la balance des nucléotides (activités de l'AMP désaminase et de l'adénylate kinase). Reçue le 26 mars 1986,

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Université de Limoges,

U.F.R. Sciences, Laboratoire de Biologie expérimentale, Hydrobiologie,

U.A. au C.N.R.S. n° 138, Biologie comparée des Protistes,

123, rue Albert-Thomas, 87060 Limoges Cedex.


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NEUROPHYSIOLOGIE. —Augmentation du sommeil paradoxal, induite par l'injection d'acide iboténique dans l'hypothalamus ventrolatéral postérieur, chez le Chat. Note de Marcelle Sallanon, Kazuya Sakai, Colette Buda, Michelle Puymartin et Michel Jouvet, présentée par Michel Jouvet, Membre de l'Académie.

■y L'injection intratissulaire d'acide iboténique, dans la partie latérale de l'hypothalamus caudal, provoque une hypersomnie intense biphasique et transitoire dès que les effets de l'anesthésique disparaissent (14 à 24 h après l'injection). La durée de cette hypersomnie (6 à 40 h) est proportionnelle à la quantité de heurotoxine injectée. La première période est caractérisée par une augmentation importante (300%) du sommeil paradoxal (SP). Au cours de la deuxième phase, le SP disparaît tandis que l'on constate une augmentation du sommeil lent (SL) (60%). Dès le troisième jour postopératoire les animaux retrouvent des quantités normales de SP et de SL.

NEUROPHYSIOLOGY. — Increase of paradoxical sleep, induced by injection of ibotenic acid in to the ventrolateral part of the posterior hypothalamus in the cat.

The intratissular injection of ibotenic acid into the ventrolateral part of the posterior hypothalamus induced a dramatic biphasic and transient hypersomnia immediately after disappearance of the anaesthesia (14 to 24 hrs. after injection). The duration of hypersomnia was related to the dose of neurotoxin injected. Its first period was characterized by an increase in paradoxical sleep (PS) (300%). Then, during the second phase, PS disappeared and there was a subsequent increase of slow wave sleep (SWS) (60%). Finally, on the third day, all cats recovered control level of PS and SWS.

A la suite des observations; cliniques de Von Economo [1], de multiples approches expérimentales ont mis en évidence le rôle de l'hypothalamus postérieur dans l'alternance des différents états de vigilance et: notamment dans le maintien de l'éveil ([2], [3]). De plus, Vanni-Mercier et coll. [4] ont montré la présence, dans l'hypothalamus ventrolatéral postérieur (HVL), de cellules présentant une décharge tonique exclusivement pendant l'éveil. Enfin, cette région de l'hypothalamus contient un groupe de neurones capables de capter et de décarboxyler le précurseur de la sérotonine : le 5-hydroxytryptophane (5-HTP) [5]. Or, certaines données expérimentales permettent d'envisager que la sérotonine, libérée pendant l'éveil, agisse au niveau de l'hypothalamus pour mettre en jeu la biosynthèse d'un facteur hypnogène capable de déclencher la mise en jeu des mécanismes exécutifs du sommeil paradoxal ([6], [7]).

Afin de déterminer le rôle éventuel de l'HVL dans les mécanismes régulant l'apparition successive des différents états de vigilance, nous avons injecté localement un acide aminé excitateur détruisant spécifiquement les corps cellulaires neuronaux : l'acide iboténique y

TECHNIQUES. — Ces expériences ont été réalisées chez 5 chats adultes des deux sexes. La solution d'IBO (40 ug/ul de tampon phosphate, 1M, pH=7,4) est injectée, sous anesthésie au pentobarbital (25 mg/kg/iv), au moyen d'une aiguille (diamètre externe 0,4 mm) placée stéréotaxiquement dans l'HVL selon les coordonnées suivantes (A 8-10; L 2-2,5; H —4); Le volume total d'IBO injecté bilatéralement varie d'un chat à l'autre de 1 ul a 5 ul. Ces animaux sont porteurs d'électrodes chroniquement implantées permettant l'enregistrement de l'activité électrique du cortex et des noyaux genouillés latéraux, de l'électroculogramme et de l'électromyogramme. L'enregistrement est mis en route dès la fin de l'intervention et poursuivi 24 h/24 h pendant 2 à 3 semaines. À;la fin de l'expérience les chats reçoivent deux injections de p-chlorophénylalanine (400 mg/kg/ip) séparées de 24h et le troisième jour une injection de DL-5-HTP (5 mg/kg/ip), 90mn avant le sacrifice. Le:. contrôle immunohistologique de la lésion de l'HVL est réalisé, par la suite, selon la méthode de Takeuchi et coll. [9].

RÉSULTATS; — L'injection d'IBO dans l'HVL provoque l'apparition d'une hypersomnie intense et transitoire intéressant d'abord le sommeil paradoxal (SP) puis le sommeil lent

(SL) ( fig. 1 et 2). Cette hypersomnie survient dès la dissipation des effets du pentobarbital

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(14 h à 24 h après l'injection d'IBO). Sa durée est proportionnelle à la quantité de toxine injectée et varie de 6 h à 40 h. Pendant une première période de 3 à 21 h, on constate une augmentation importante de la fréquence d'apparition et de la durée des phases de SP. De plus, au cours de cette période, des phases de SP peuvent être déclenchées au moyen de stimulations tactiles. Les pourcentages moyens de SL et de SP sont alors respectivement de 34+9% et de 53 + 13%, tandis que l'éveil diminue considérablement : 13 + 15%. Par la suite, les animaux présentent une période de durée équivalente pendant laquelle le SP disparaît (3,8 + 3,7%) tandis que les quantités de SL augmentent (83,5 + 7,1%). Pendant cette hypersomnie d'autres phénomènes transitoires peuvent être observés tels que l'apparition précoce d'une hypothermie (30 à 32°C) nécessitant le placement des chats en ambiance thermostatée (26°C). Des modifications du comportement à type de stéréotypies d'attaque non dirigée surviennent dès la fin de l'anesthésie. Dès la troisième journée post-opératoire des quantités de sommeil lent total et de SP similaires aux contrôles non lésés sont observées, bien que le taux de sommeil lent profond (S2) reste très diminué dans la majorité des cas. Parallèlement, la température et le comportement se normalise très rapidement, tandis que l'on note le maintien d'une hypophagie importante.

La lésion commune observée s'étend de A 8 à A 12,5, son volume est proportionnel à la quantité d'IBO injectée. Elle concerne l'hypothalamus latéral et périfornical, l'aire hypothalamique postérieure et une partie du noyau ventromédian de l'hypothalamus. Dans tous les cas on observe une disparition importante, voir totale, des cellules captant le 5-HTP (fig. 3).

DISCUSSION. — L'injection d'acide iboténique dans l'hypothalamus ventrolatéral provoque l'apparition d'une hypersomnie intense et transitoire. Ce phénomène peut être

Fig. 1. — Hypnogramme représentant l'hypersomnie, induite par l'injection bilatérale d'acide iboténique (IBO) (56 ug/1,5 ul) dans l'hypothalamus ventrolatéral postérieur sous anesthésie au pentobarbital (25 mg/kg/iv), au cours du deuxième jour postopératoire (Jl); en abscisses : le temps en heures; en ordonnées : éveil (E), sommeil lent (SL), sommeil paradoxal (SP) en noir, s : stimulations tactiles.

Fig. 1. — Hypnogram showing the hypersomnia, induced by a bilateral injection of ibotenic acid (IBO) (56 ug/1,5 ul) in to the ventrolateral part of the posterior hypothalamus under pentobarbital anaesthesia (25 mg/kg/iv), during the second postoperative day (Jl); abscissa: time in hours; ordinates: waking (E), slow wave sleep (SL), paradoxical sleep (PS) black area, s: tactile stimulations.


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interprété soit en fonction des effets neuroexcitateurs de cet acide aminé soit en fonction de ses propriétés neurotoxiques [10] soit, finalement, en fonction des propriétés gamma amino butyrique acide (GABA) agonistes de son métabolite le muscimol [11]. Les effets transitoires précoces relèvent plus vraisemblablement d'une action neuroéxitatrice de l'IBO ou GABA agoniste de son métabolite. En effet, Markovska et coll. [12] ne constatent pas de trace de lésion au cours des premières 24 h qui suivent l'injection d'IBO dans l'HVL, la mort cellulaire n'étant observée que 3 jours plus tard; L'hypersomnie que nous avons observée, n'étant pas suivie de modification durable, pourrait donc révéler soit le blocage momentané d'un système inhibiteur (effet GABA mimétique) soit la stimulation transitoire d'un système facilitateur des mécanismeshypnogènes. De tels effets pourraient s'effectuer au moyen de projections descendantes des neurones de l'HVL vers les systèmes exécutifs pontobulbaires du SP [13] et/ou au moyen de projections ascendantes au niveau de l'hypothalamus antérieur (Sakai résultats non publiés), la lésion de cette structure provoquant dès insomnies durables [14]. Ainsi, la levée d'une inhibition tonique ou la stimulation transitoire d'un système facilitant l'apparition du SP provoquerait, dans un premier temps, le phénomène d'hypersomnie. Dans un deuxième temps, l'épuisement du facteur hypnogène concerné serait responsable de la disparition transitoire du SP. Dans ce cas il faut supposer qu'une structure hypothalamique située à la périphérie de la lésion observée, et qui a donc été momentanément sous l'influence excitatrice de l'IBO, joue un rôle primordial dans la régulation du SP. Des effets similaires mais permanents, concernant l'augmentation de SL, ont été constatés par d'autres auteurs après des lésions électrolytiques extensives de l'hypothalamus latéral ([2], [3], [15]). Ce phénomène, considéré comme un état « d'hypo-éveil », est attribué à la destruction d'un système de

Fig.2. — Hypersomnie biphasique induite par l'injection d'acide iboténique dans l'hypothalamus ventrolatéral

postérieur chez différents chats : Z87, E88, K88, K92 et C96. Pourcentages de sommeil lent (SL) : zone

hachurée et de sommeil paradoxal (SP) : zone noire, au cours de la première (A) et de la deuxième (B)

phase de l'hypersomnie; C, pourcentages moyen (+ la déviation standard) de SL et de SP chez les animaux

non lésés.

Fig. 2, — Biphasic hypersomnia induced by bilateral injection of ibotenic acid in to the ventrolateral part of

posterior hypothalamus in cats: Z81, E88, K88, K92 and C96. Percentages of slow wave sleep (SL) (hatched

areas) and of paradoxical sleep (SP) (black areas) during the first(A) and the second (B) period of hypersomnia;

C, mean percentages(± standard deviation) of SL and SP in unlesioned cats.


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relais hypothalamique entre les informations activatrices en provenance de la formation réticulée et les structures corticales. Dans nos expériences, l'absence d'effet à long terme laisse supposer soit que ce système hypothalamique d'éveil n'est pas entièrement détruit, soit que d'autres structures puissent rapidement compenser les effets de la lésion.

Reçue le 26 mai 1986.

RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES

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Fig. 3. — A : Distribution des neurones hypothalamiques ventrolatéraux immunoréactifs à la sérotonine après administration de 5-hydroxytryptophane chez le chat (côté droit du plan frontal), abréviations : ZI, zona incerta; STh, nucleus subthalamicus; HL, area hypothalami lateralis; Ml, nucleus mamillaris lateralis; HD, area hypothalami dorsalis; HP, area hypothalami posterior; Mm, nucleus medialis mamillaris; V3, troisième ventricule; TMT, fasciculus mamillothalamicus; Ped, pedunculus cerebri; Fx, fornix; VMH, area hypothalami medialis; In, infundibulum. B : Représentations schématiques de la lésion bilatérale des corps cellulaires, induite par injection d'acide iboténique dans l'hypothalamus ventrolatéral postérieur; 1 : plus petite lésion (chat Z 87) ; 2 : lésion commune des chats E 88, K 88, K 92 et C 96.

Fig. 3. — A: Localization of serotonin immunoreactive hypothalamic neurons in the cat after 5-hydroxytryptophan administration (right side of the frontal section). Abbreviations: ZI, zona incerta; STh, nucleus subthalamicus; HL, area hypothalami lateralis; Ml, nucleus mamillaris lateralis; HD, area hypothalami dorsalis; HP, area hypothalami posterior; Mm, nucleus medialis mamillaris; V3, third ventricule; TMT, fasciculus mamillothalamicus; Ped, pedunculus cerebri; Fx, fornix; VMH, area hypothalami medialis; In, infundibulum. B: Schematic drawings of the bilateral cell body lesion, induced by ibotenic acid injection into the ventrolateral part of the posterior hypothalamus; 1: smallest lesion (cat Z87); 2: smallest common lesion for cats E 88, K88, K92 and C 96.


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Département de Médecine expérimentale, I.N.S.E.R.M., U n° 52, C.N.R.S.-L.A. n° 1195, Université Claude-Bernard, 8, avenue Rockfeller, 69373 Lyon.

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PHYSIOLOGIE VÉGÉTALE. — Effets du stade de prélèvement et des prétraitements sur le développement in vitro d'anthères prélevées sur le tournesol cultivé (Helianthus annuusL.). Note de Antoine Mezzarobba et Robert Jonard, présentée par Roger Gautheret.

L'isolement in vitro d'anthères prélevées sur diverses lignées et variétés de Tournesol cultivé (Helianthus

annuus L.) a permis d'obtenir des embryons avec des fréquences élevées. Le développement de ces embryons a

fourni des plantes haploïdes (n ==17) et diploïdes (2n = 34). Des régénérations à partir de cals ont également

été observées. L'embryogénèse a pu être améliorée en prélevant les anthères à un stade très jeune et en les

traitant à l'obscurité à 35°C pendant les 12 premiers jours de la culture.

PLANT PHYSIOLOGY. — Effects of the stage of isolation and pretreatments on in vitro development of cultivated sunflower anthers (Helianthus annuus L.).

High percentages of embryos wereobtained from anther culture of several sunflower inbread lines and cultivars (Helianthus annuus L.). Haploid (n=17) and diploid (2n = 34) plantlets were regenerated from these embryos. Direct shoot formations from callus were also observed. Best yields of embryos were obtained when the anthers were isolated at a very young stage and treated in the dark at 35°C during the first 12 days of culture.

INTRODUCTION. — Parmi les nombreuses techniques de cultures in vitro, l'androgenèse, qui fait l'objet de travaux importants au cours de ces dernières années, a pu être intégrée dans certains programmes de sélection, tels que ceux du colza [1], du piment [2], de l'aubergine [3] ou du blé tendre [4]. En ce qui concerne le genre Helianthus, les recherches réalisées par Alissa et coll. [5] ou par Bohorova et coll. [6] et [7] se sont plus particulièrement orientées vers les espèces sauvages et les hybrides interspécifiques. Hormis les quelques données relatées par MIX en 1985 [8], aucune expérimentation jusqu'à ce jour, n'a fait l'objet de publications sur l'androgenèse du Tournesol cultivé (Helianthus annuus L.).

Nous nous sommes donc attachés à l'obtention de tournesol cultivé à partir d'anthères isolées in vitro en étudiant plus spécialement l'importance dans les mécanismes de l'androgenèse du stade de prélèvement des anthères et des conditions de prétraitement.

MATÉRIEL ET MÉTHODES. — Le matériel utilisé a été fourni par le laboratoire du tournesol de la station I.N.R.A. de Montpellier-II comprend :

— 3 lignées :

MH 1-2 (lignée I.N.R.A.); M 6-4 (lignée espagnole); 82 R 159 (lignée I.N.R.A.);

— 5 hybrides :

M 6-4x82 R 159 (matériel I.N.R.A.);

DO 131 (matériel américain);

Luciole (matériel I.N.R.A.);

Remil (matériel I.N.R.A.);

Rodéo (matériel I.N.R.A.-C.S.T.).

Les plantes-mères ont été cultivées en serre durant l'hiver 1985/1986 à une température variant de 18 à 25°C avec un régime photopériodique de 16 h, sous lumière naturelle avec des appoints de lumière artificielle le matin et le soir, en fonction de la longueur des jours.

Les anthères ont été prélevées à 3 stades différents de la formation des microspores :

— stade A : stade pré-méiotique=cellules-mères;

— stade B : stade méiose II = cellules entre le stade diade et le stade tétrade;

— stade C : stade microspores uninucléées vacuolisées.

Les boutons floraux sont désinfectés par un trempage pendant 10mn dans une solution d'hypochlorite de calcium à 4% additionnée d'un mouillant (Tween 50), suivi de 3 rinçages à l'eau distillée stérile. Les anthères sont ensuite isolées en boîtes de Pétri de 55 mm de diamètre contenant le milieu gélosé (15 à 20 anthères par boîte). Les boîtes ensemencées sont alors scellées par un ruban de film plastique étirable (scel-o-frais). Toutes ces opérations sont effectuées dans des conditions rigoureuses d'aseptie. Après différents essais, et en se basant sur les résultats de Alissa et coll. [5], nous avons sélectionné un milieu d'initiation (MI) pour l'isolement des anthères. Ce milieu renferme les macro et micro-éléments de Murashige et Skoog [9], additionnés du mélange vitaminique de Morel et Wetmore[10] (méso-inositol : 100 mg.l- 1; pantothénate de calcium : 1 mg.l- 1; acide nicotinique : 1 mg.l- 1; pyridoxine HCl : 1 mg.l- 1; thiamine HCl : 1 mg.l- 1; biotine : 0.01 mg.l-1), de vitamine B 12 : 0,1 mg.l- 1, d'un acide aminé=la glycine ; 1 mg.l- 1, d'un sucre=le saccharose : 60g.l- 1 et

0249-6313/86/03030181 $ 2.00 © Académie des Sciences


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de 2 phytohormones: l'acide naphtalène-acétique (ANA : 0,5 mg.l- 1) et la benzylaminopurine (BAP :0,5 mg.l-1); le milieu est solidifié par la gélose (agar-agar à 6g.l- 1) et le pH ajusté à 5,7 avant l'autoclavage à 110°C pendant 20mn.

3 traitements ont été appliqués sur les anthères isolées :

— anthères en chambre climatisée à 25°C et à l'obscurité;

— anthères à l'obscurité dans une étuve réglée à 30°C pendant 2, 4, 8, 12 et 16 jours;

— anthères à l'obscurité dans une étuve réglée à 35°C pendant 2, 4, 8, 12 et 16 jours.

Un groupe d'anthères ensemencées parallèlement sans traitement particulier (25°C sous un éclairement de 2 000 lx avec une photopériode de 16 h) servait de témoin.

A la sortie de l'étuve, les boîtes de Pétri sont placées à l'obscurité à 25°C dans la chambre à culture.

Lorsque les embryons atteignent le stade «torpille », ils sont transférés, sous un régime photopériodique de 16h de jour sur un milieu de développement R1 qui diffère du milieu 1 par une teneur en macro-éléments réduite de moitié (à l'exception du FeEDTA), par une plus faible teneur en saccharose (à 10g.l-1), par la suppression de l'auxine et la réduction de la concentration en BAP à 5-10- 4 mg.l- 1. Enfin, lorsqu'apparaît le première paire de feuilles, les plantules, avant leur transfert en terre, sont transférées sur un milieu R 2=milieu R1 additionné d'ANA (0,02 mg.l- 1) et de BAP (0,01 mg.l- 1) afin de favoriser la rhizogénèse.

Le comptage des chromosomes est réalisé sur les pointes racinaires, après une coloration au carmin-acétique.

RÉSULTATS. — 1. Influence du stade de prélèvement des anthères. — Après 2 à 3 semaines de culture, les anthères peuvent présenter 4 évolutions différentes :

— brunissement et nécrose de l'anthère;

— évolution vers la formation d'un cal sans différenciation organogène;

— évolution vers la formation d'un cal sur lequel apparaissent des bourgeons et des pousses feuillées;

— formation d'embryons issus soit directement de l'anthère, soit rapidement à partir d'un cal peu développé.

Gomme l'indiquent les résultats du tableau I, les pourcentages de cals organogènes et d'anthères embryogènes varient suivant le stade de prélèvement des anthères. Un ensemencement de l'anthère au stade B augmente nettement le nombre de cals organogènes et le nombre d'embryons formés. Le stade B, localisé entre les 2 phases de la méiose, représente l'époque la plus favorable au développement des microspores.

Il faut souligner que pour le stade A, la majorité des anthères (95% tous génotypes confondus) forme un cal qui ne se différencie pas et se nécrose au bout de 6 à 7 semaines. Pour le stade C, 40% des anthères (tous génotypes confondus) brunissent après 2 à 3 semaines et se nécrosent.

EXPLICATIONS DE LA PLANCHE I

Fig. 1. — Embryon androgénétique de l'hybride de Tournesol Luciole au stade « torpille », observé en

microscopie électronique à balayage (G x 40). Fig. 1. — Sunflower androgenetic embryo (Hybrid F1: Luciole) at the "torpedo" stage (El. micr.) (Mx40).

Fig. 2. — Embryon de l'hybride de Tournesol = M 6.4 x 82 R159 au stade « 2 cotylédons développés » observation en microscopie électronique à balayage (G x 40). Fig. 2. — Sunflower embryo (hybrid F1: M 6.4 x 82 R 159) at "the 2 cotylédons" stage (El. micr.) (M x 40).

Fig. 3. — Plante androgénétique de Tournesol issue du développement d'un embryon (stade du transfert en terre).

Fig. 3. — Androgenetic sunflower plantlet from the development of an embryo (Stage of transfer in the soil). Fig. 4. — Plante androgénétique de Tournesol avec la floraison in vitro. Fig. 4. — Androgenetic sunflower plantlet flowering in vitro.

Fig. 5. — Plaque métaphasique diploïde à 34 chromosomes dans une cellule de la plante-mère de Tournesol

cultivé. Fig: 5. — Cultivated sunflower=Mother plant diploid (2n = 34).

Fig. 6. — Nombre haploïde de chromosomes (n=17) dans une cellule de la pointe racinaire d'une plante de Tournesol cultivé, issue de l'androgénèse in vitro.

Fig. 6. — Hapoid chromosome number (n = 17) in a root tip cell of a plantlet coming from a cultivated sunflower anther culture.


PLANCHE I/ PLATE I

ANTOINE MEZZAROBBA


PLANCHE II/PLATE II

TABLEAU I Effets du stade prélèvement sur le développement in vitro des anthères. Effects of the stage of isolation on in vitro development of the anthers.

Cals Anthères

Nombre organogènes embryogènes

Génotypes ensemencées Nombre % Nombre %

Stade de prélèvements : A : Préméiotique 1re Exp. :

MH 1.2 . 158 1 0

M 6.4 202 0 - 0

82R159 170 0 - 0

M 6.4x82 R 159 .......... 225 0 - 1

Do 131 202 0 - 0

Luciole . . 185 0 - 0 -

Rémi 1 192 0 - 0

Rodéo 210 0 - 0

Tous génotypes confondus 1544 1 0,06 1 0,06

Stade de prélèvements : B : Diade à tétrade 2e Exp. :

MH1.2 ........... . 192 71 37 0

M6.4 . .. . 186 15 8 4 2,2

82R159. . .' 203 0 - 1

M6.4x82xRx159 215 11 5,1 21 9,8

Do 131 . . 198 6 3 9 4,5

Luciole .. 231 1 6 2,6

Remi 1. , . . 222 8 3,6 2 0,9

Rodéo. . . 197 5 2,5 0

Tous génotypes confondus 1644 117 7,1 43 2,6

Stade de pélèvements : C : microspore uninucléée 3e Exp. ;

MH1.2. ....... ... 162 16 9,9 0

M6.4 .......... .. 203 5 2,5 2 1

82R159. 181 0 - 0

M6.4x82xRx159. . . . . . 195 4 2,1 5 2,6

Do 131 211 3 1,5 2 0,9

Luciole 208 0 - 1

Rémil ... 153 2 1,3 0

Rodéo 162 0 - 0

Tous génotypes confondus 1475 30 2 10 0,7

Toutes les anthères ont été cultivées sur le même milieu MI et dans les mêmes conditions : température de 25°C, éclairement de 2000lx, photopériode de 16 h de jour. Les 3 expériences ont été réalisées à la même époque de l'année.


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TABLEAU II

Effets de divers prétraitements sur le développement in vitro des anthères de Tournesol cultivé

(tous génotypes confondus,

Effets of pretreatments on in vitro development of cultivated sunflower anthers (for the whole genotypes tested).

TABLEAU III

Effet d'un traitement par la chaleur sur la formation d'anthères embryogènes et de plantes à partir de différents génotypes de Tournesol cultivé. Nombre de plantes régénérées. Effet of heat treatment on embryonenesis in anthers of different cultivated sunflower genotypes. Number of plants regenerated.

Traitements Nombre Nombre Pourcentage

subis d'anthères d'anthères d'anthères

par les anthères ensemencées embryogènes embryogènes

1er Témoin=25°C, 2000 lx, photopériode de

16h de jour.. ............ 212 6 2,8

2e Témoin=25°C et obscurité 219 8 3,7

30°C obscurité pendant

2 jours ... 230 9 3,9

4 jours 242 8 3,3

8jours ...... ....:. . 215 12 6

12jours . . ... -.-...' 202 12 5,9

16 jours ....... . 188 10 5,3

35°C obscurité pendant

2 jours ...... ............ ........... , 190 5 2,6

4 jours 205 4 2

8 jours ..,...... 209 21 10

12jours ........,.... 218 38 17,4

16 jours ..,..,,.....,.. , 198 34 y-, 17,1

Les résultats sont observés après 3 semaines de culture avec conservation à 25°C et à l'obscurité après les prétraitements.

Anthères

Nombre embryogènes Nombre

d'anthères de plantes Leur degré

Génotypes ensemencées Nombre % régénérées de ploïdie

Traitements des anthères : 25°C et obscurité :

MH1.2. 182 0

M6.4. ........... . 178 2 1,1

82R159 192 2 1,0

M6.4x82R159 . 198 18 9,1 1 n=17

Do 131. ........ 210 10 4,8 1 2n = 34

Luciole................. 162 3 1,9

Remil. ......... 201 2 0,99

Rodéo........... 188 0

Traitements des anthères : 35°C pendant 12 jours à l'obscurité :

MH1.2. . . ........... 192 8 4,2 1 2n

M6.4, ... 186 22 11,8

82R159 ........ ... .. . 203 6 2,9 -

M6.4x82R159 ........ 215 118 54,9 - 4 dont 3 à 2n

et 1 à n

Do 131. 198 61 30,8 2 2 à 2 n

Luciole,. .. 231 32 13,9 1 n

Remil. ......... 222 29 13,1

Rodeo ............ 197 4 2,1 1 2n

2: Effet d'un choc thermique sur le développement ultérieur des anthères.— Des anthères prélevées à ce stade B favorable ont été ensemencées après avoir subi les différents traitements thermiques cités plus haut.


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L'examen des résultats consignés dans le tableau II montre que le pourcentage d'anthères produisant des embryons varie en fonction des prétraitements thermiques. Un traitement des anthères à 35°C pendant les 12 premiers jours de culture améliore nettement la quantité d'anthères embryogènes.

Après 3 semaines de culture, la majorité des embryons sont au stade « torpille » (fig. 1, pl. 1). On constate qu'un prolongement du séjour à l'étuve (16 jours) n'améliore pas significativement le pourcentage d'anthères embryogènes.

Un premier comptage des chromosomes au niveau du pôle racinaire de quelques embryons a révélé la présence de métaphases haploïdes et diploïdes.

Les résultats du tableau III mettent en évidence l'importance d'un traitement des anthères à 35°C pendant les 12 premiers jours de culture sur le pourcentage des anthères embryogènes, et ceci quel que soit le génotype.

De nombreux embryons restent « bloqués » au stade torpille ou présentent un développement anormal avec arrêt de la croissance de la plantule au stade 1 paire de feuilles.

Le comptage des chromosomes réalisés au niveau des méristèmes racinaires des plantes régénérées révèle encore la présence de plantes diploïdes comme la plante-mère (fig. 5, pl. 1) et de plantes haploïdes (fig. 6, pl. I).

La plupart des plantes ainsi régénérées manifestent une floraison très précoce, parfois même sur le milieu gélosé, si la plantule n'est pas rapidement transférée en terre (fig. 4, pl. I).

CONCLUSIONS. — Pour les génotypes de Tournesol étudiés, choisis pour la diversité de leurs origines, un stade d'isolement précoce des anthères ainsi qu'un traitement à 35°C pendant les 12 premiers jours de culture améliorent sensiblement les développements d'embryons sur les anthères isolées in vitro.

Le nombre de plantes régénérées, bien qu'encore faible, permet d'envisager concrètement pour la première fois chez le Tournesol cultivé les problèmes liés à l'utilisation de l'hapoïdie dans un schéma de sélection. Reçue le 14 avril 1986, acceptée le 26 mai 1986.

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Université des Sciences et Techniques du Languedoc,

place Eugène-Bataillon, 34060 Montpellier Cedex.


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BIOTECHNOLOGIES. —Transestérification, interestérification et synthèse d'Esters catalysées par des lipases en microémulsions. Note de Moussibaou Bello, Marc Pievic, Hervé Adenier, Daniel Thomas et Marie-Dominique Legoy, présentée par Pierre Douzou.

L'étude des réactions non conventionnelles de transestérifications, d'interestérifications et de synthèses d'esters catalysées par des lipases microbiennes spécifiques des positions 1-3 et non spécifiques ont été éprouvées dans des microémulsions inverses. Les microémulsions utilisées sont composées de triglycérides ou d'acides gras, d'eau en très faible quantité (1%) dans laquelle l'enzyme est solubilisée, de tensioactif du type Brij 35 et d'un cotensioactif alcoolique. Dans le système utilisé, les matières grasses et l'alcool (primaire ou tertiaire) sont à la fois substrats de l'enzyme et constituants de la microémulsion.

Le type de réaction catalysé (transestérification ou interestérification) dépend de la nature de l'alcool entrant dans la fabrication de la microémulsion;Ainsi, la transestérification n'est possible qu'avec un alcool primaire alors qu'avec un alcool tertiaire ce sont les réactions d'interestérification qui ont lieu.

Par ailleurs, la lipase non spécifique de Candida cylindracae n'interestérifie pas les triglycérides à chaîne courte dans les microémulsions révélant ainsi une spécificité vis-à-vis de la longueur de la chaîne de l'acide gras. Un rendement de synthèse d'oléate d'heptyle voisin de 100% est obtenu avec cette lipase.

Il est donc possible d'utiliser des enzymes dans des milieux peu hydratés du type microémulsions inversés pour catalyser des réactions de transfert de groupements acyles.

BIOTECHNOLOGIES. — Transesterification,interesterification and Ester synthesis catalyzed by lipases in microemulsions.

Studies of unusual reactions of transesterification, interesterification and ester synthesis catalyzed by specific (1-3 positions of chains) and non specific microbial lipases have been tested in reverse microemulsions. The microemulsions used were mode of triglycerides or fatty acids, enzyme dissolved in a very low water quantity (1%), Brij 35 as surfactant and an alcoholic cosurfactant. In such a system, fats and alcohol (primary or tertiary) are substrates of the enzyme and microemulsion components. The type of catalyzed reaction (transesterification or interesterification) depends of the nature of the alcohol. So, transesterification is only possible with a primary alcohol when interesterification needs a tertiary one.

Incidentally, non specific Candida cylindracae lipase doesn't catalyze interesterification of short chain triglycerides revealing a specificity for the chain length. Heptyl-oleate synthesis catalyzed by non specific lipase is obtained in microemulsions at a 100% yield.

It is possible to use enzymes in very low water content medium as reverse microemulsions for catalyzing group transferring reactions or synthesis.

La plupart des études menées jusqu'à présent concernent des enzymes hydrophiles utilisant des substrats solubles en phase aqueuse.

La possibilité d'inclure des enzymes dans des émulsions ou des microémulsions permet d'étudier la transformation de substrats insolubles dans l'eau et même en modulant la quantité d'eau, d'obtenir des réactions de synthèse ou de transferts de groupements ([1 ]-[9]).

Une microémulsion est une dispersion d'un liquide (par exemple de l'eau) dans un autre liquide (par exemple de l'huile) obtenue en ajoutant un ou plusieurs produits appelés tensioactifs. Les microémulsions sont monophasiques, transparentes, isotropes et stables du point de vue cinétique et thermodynamique ([10]-[14]).

Les potentialités industrielles de ces systèmes sont nombreuses : récupération assistée du pétrole, enrichissement en octane, diminution de la pollution, lubrifiants, pesticides, cosmétiques... [15],

Jusqu'à présent peu de publications font état de l'utilisation de microémulsions en enzymologie [16].

Nous avons choisi d'étudier le comportement de lipases dans de tels systèmes. En modulant les quantités des différents constituants, il est possible d'avoir des microémulsions directes (huile dans l'eau) ou des microémulsions inverses (eau dans l'huile)([11],[15]).

Les microémulsions utilisées sont constituées de 4 composants : les triglycérides ou les acides gras pour la phase organique, l'enzyme dans l'eau pour la phase aqueuse, le

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tensioactif est du Brij 35 (polyoxyéthylène-23-lauryl éther), le cotensioactif un alcool primaire ou tertiaire.

Dans notre cas le système utilisé va permettre non seulement, la solubilisation des substrats et produits mais aussi l'obtention de réactions non conventionnelles telles que des transestérifications, des interestérifications et des synthèses.

Les réactions testées sont les suivantes :

hydrolyse

alcool + acides gras *± ester d'acide(s) gras

synthese

La transestérification est caractérisée par le schéma suivant :

et l'interestérification :

Le facteur fondamental influençant soit l'hydrolyse, soit la formation de nouveaux esters d'acides gras est le pourcentage d'eau (ou plus exactement l'activité de l'eau). Une activité de l'eau faible favorise les réactions de synthèse, de trans ou d'interestérification.

MATÉRIEL ET MÉTHODES. — Matériel. — Les lipases microbiennes de Candida cylindracae (non spécifique des positions des acides gras sur les triglycérides) et de Rhizopus arrhizus (spécifique 1-3) sont commercialisées par Sigma. Leur activité hydrolytique a été éprouvée sur l'huile d'olive et est respectivement de 15 et 2 300 umoles d'acides gras libérés/mg de protéine/minute.

La phase organique est représentée suivant les cas par de l'huile d'olive du commerce, des triglycérides (trioléine, trinonanoïne, trioenanthine ou tributyrine commercialisés par Fluka) ou de l'acide oléique (Fluka).

Le tensioactif est du Brij 35 (Sigma) et le cotensioactif de l'heptanol (Fluka) ou du 2 méthyl-2-hexanol (Aldrich).

Méthodes. — Les zones de microémulsions sont déterminées par construction de diagrammes dé phase. Toutes les expériences sont réalisées avec des microémulsions inverses. Dans tous les cas la composition des microémulsions sera donnée en pourcentage massique. Les réactions sont suivies d'une part par chromatographie sur couche mince (CCM) et d'autre part par chromatographie en phase gazeuse (CPG).

Chromatographie sur couche mince. — Elle permet de séparer les lipides selon leur polarité. Les dépôts sont faits sur des plaques de gel de silice 60F254 (Merck). La composition du solvant de développement est la suivante : hexane/diéthyl éther/acide acétique 120/30/1,5 (V/V/V). Les plaques sont révélées par pulvérisation de dichloro-2',7'-fluorescéine.

Chromatographie en phase gazeuse. — La séparation est basée sur les différences de poids moléculaire et de polarité.

Un chromatographe « Girdel 3000 » équipé d'une colonne capillaire OV1 est utilisé avec une programmation de température de 60 à 340°C à 10°C/mn. Les débits sont les suivants : 20ml/mn pour l'hydrogène et 300ml/mn pour l'air; le débit de fuite du gaz vecteur (N2) est fixé à 30ml/mn, la pression de gaz vecteur est de 0,4 bar. La température de l'injecteur est réglée à 375°C et celle du détecteur à 375°C également.

RÉSULTATS. — Tranestérification. — Des microémulsions inverses sont réalisées avec les deux lipases en présence d'alcool primaire (l'heptanol) et en présence d'alcool tertiaire (le 2 méthy-2-hexanol). La composition des microémulsions est la suivante : triheptanoïne 24% (0,27 g), trioléine 40% (0,45 g), alcool 35% (0,41g), eau 1 % contenant soit 20 U de lipase de Candida cylindracae, soit 65 U de lipase de Rhizopus arrhizus et 0,1 % de Brij 35.

Une CCM révèle que la transestérification n'a lieu qu'en présence d'heptanol et n'existe pas en présence de 2 méthyl-2-hexanol. Ces résultats s'expliquent par le fait que les alcools primaires et tertiaires entraînent la formation d'un alcoolate et d'un carbocation respectivement. L'alcoolate est accepteur des radicaux acyles ce qui n'est pas le cas du


PLANCHE I/PLATE I

MOUSSIBAOU BELLO

Fig. 1

Fig. 2

Fig. 1. — Pourcentage d'interestérification trioléine-tributyrine en fonction du temps pour la lipase de Rhizopus arrhizus ( — A) et de Candida cylindracae ( —@).

Fig. 1. — Transesterication yield for the system triolein-tributyrin as a function of time for Rhizopus arrhizus lipase (—A) and for Candida cylindracae lipase ( —©).

Fig. 2. — Pourcentage d'interestérification trioléine-triheptanoïne

en fonction du temps pour la lipase de Rhizopus arrhizus (—©) et de Candida cylindracae (—E—).

Fig. 2. — Transesterification yield for the system triolein-triheptanoin

as a function of time for Rhizopus arrhizus lipase (— @) and for Candida cylindracae lipase(— S—).

Fig.3

Fig. 4

Fig. 3. — Pourcentage d'interestérification trioléine-trinonanoïne

en fonction du temps pour la lipase de Rhizopus arrhizus (—A) et de Candida cylindracae (S— ).

Fig.3. — Transesterification yield for the system triolein-trinonanoin as a function oftime for Rhizopus arrhizus

lipase (—A) and for Candida cylindracae lipase (-E-).

Fig. 4. — Synthèse d'ester d'oléate d'heptyle

en fonction du temps pour la lipase de Candida cylindracae.

Fig. 4. — Heptyl-oleate synthesis

as a function of time with Candida cylindracae lipase.



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carbocation. L'alcool tertaire ne joue alors que le rôle de cotensioactif. Ces résultats sont conformes à ceux de Zaks et Klibanov [9].

Les spots d'esters d'oléate d'heptyle et d'heptanoate d'heptyle sont beaucoup plus importants quand on utilise la lipase non spécifique.

Par ailleurs, avec le 2 méthyl-2-hexanol on observe l'apparition de deux nouveaux triglycérides correspondant à du dioléyl monoheptanoyl glycérol et du diheptanoyl monooléyl glycérol.

Il est donc possible avec des microémulsions inverses d'obtenir des transestérifications et des interestérifications.

Interestérification. — Pour les deux lipases des interestérifications ont été testées avec des triglycérides dont la longueur des chaînes d'acides gras varient de C4 à C9.

Des microémulsions composées de 33% de trioléine, 1% d'eau contenant soit 60 U de lipase de C. cylindracae, soit 1333 U de lipase de R. arrhizus, 30% de 2 méthyl-2-hexanol et 0,1% de Brij35. A ces microémulsions selon les cas, on a ajouté 37% de tributyrine (C4), 37% de triheptanoïne (C7) ou 37% de trinonanoïne (C9).

Les résultats obtenus en fonction du temps sont représentés sur les figures 1 pour l'interestérification trioléine-tributyrine, 2 pour trioléine-triheptanoïne et 3 pour trioléinetrinonanoïne.

Dans tous les cas l'interestérification a lieu.

La lipase de R. arrhizus permet d'obtenir environ 40% de triglycérides interestérifiés dans tous les cas après 20 jours de réaction.

La lipase non spécifique de C. cylindracae donne des résultats équivalents pour les systèmes trioléine-triheptanoïne et trioléine-trinonanoïne mais ne permet d'obtenir que 6% d'interestérification avec le système trioléine-tributyrine. Il semblé donc que cette lipase non spécifique placée dans des conditions particulières du type microémulsions puisse acquérir une certaine spécificité et n'accepte plus les triglycérides à chaîne courte comme substrat.

Synthèse. — La lipase non spécifique de Candida cylindracae a été utilisée pour réaliser la synthèse d'oléate d'heptyle. Comme dans les expériences précédentes l'heptanol est à la fois substrat et cotensioactif. L'influence du rapport molaire heptanol/acide oléique sur la synthèse d'ester a été étudiée pour des microémulsions contenant 1 % d'eau avec 60 U de lipase, 0,1 % de Brij 35, de l'heptanol et de l'acide oléique variant dans un rapport 1 à 5. Les résultats sont présentés sur la figure 4.

La réaction est d'autant plus rapide et la quantité d'ester formé est d'autant plus grande que le rapport heptanol/acide oléique est élevé. Pour un rapport égal à 5, le rendement de synthèse est de 80% au bout de 4 jours et voisin de 100% au bout de 17 jours, alors qu'un alcool primaire aussi; réactif soit-il permet rarement de dépasser 70 % de synthèse en catalyse chimique.

La réalisation de réactions enzymatiques et plus particulièrement de réactions de transfert de groupements acyles en microémulsions constitue une approche nouvelle.

De plus dans le cas des lipases, les substrats peuvent être à la fois substrats de l'enzyme et constituants de la microémulsion.

Nous avons montré qu'il est possible de réaliser des microémulsions constituées de matières grasses liquides, d'un surfactant, d'un cotensioactif alcoolique et d'une très faible quantité d'eau.

L'introduction de la lipase dans la phase aqueuse du système ne casse pas la microémulsion. La nature du substrat lipidique et de l'alcool ont dans les systèmes à microémulsions une influence déterminante sur les réactions.


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L'utilisation de la lipase de Candida cylindracae en microémulsions révèle que cette enzyme normalement non spécifique, peut ne plus accepter certains substrats et donc acquérir une spécificité lorsqu'elle est placée dans des conditions particulières.

Les microémulsions, par leur structure et leur stabilité ouvrent de larges champs d'application à la catalyse enzymatique. Les réactions non conventionnelles des lipases (interestérification, transestérification et synthèse d'esters) observées en microémulsion en sont une illustration.

Une étude de la stabilité thermique des lipases et des microémulsions à des températures plus élevées permettrait d'élargir la gamme des triglycérides étudiés.

Nous remercions MM. Clausse pour ses conseils avisés. Reçue le 13 janvier 1986, acceptée le 12 mai 1986.

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IMMUNOLOGIE. — Anticorps pathogènes dans le lupus erythémateux disséminé: anticorps anti-LAMP, Note de Laurent Jacob, Marie-Annick Lety, Renato C. Monteiro, Daniel Louvard et Jean-François Bach, présentée par Jean François Bach, Membre de l'Académie.

Nous avons récemment montré qu'un anticorps monoclonal spécifique de; l'ADN double brin, le PME 77, spontanément produit chez la souris lupique B/W, reconnaît une ou des protéines à la surface de différents types cellulaires humains normaux concernés dans la pathogénie du lupus érythémateux disséminé (LED); glomérule humain rénal, lymphocytes B et T, globules rouges, plaquettes et tissu neuronal. Cette ou ces protéines de surface cellulaire partagent un épitope avec l'ADN double brin. Nous proposons de dénommer cette ou ces protéines de surface cellulaire LAMP [lupus associated membrane protéines].

Nous démontrons ici que :

(1) des immunoglobulines G (IgG) éluées des reins de souris lupiques MRL/lpr/lpr réagissent.fortement avec la LAMP;

(2) des anticorps anti-LAMP sont présents en grande quantité dans le sérum de souris lupiques B/W et MRL/lpr/lpr;

(3) des anticorps anti-LAMP sont présents dans le sérum de 25 patients atteints de LED, selon la classification de l'American Rheumatism Association.

Fait intéressant parmi ceux-ci, 2 sérums sont négatifs en anticorps anti-ADN. En revanche, les anticorps anti-LAMP ne sont pas détectés dans le sérum de 10 patients atteints de polyarthrite rhumatoïde, de 4 patients atteints de sclérodermie, de 2 patients atteints de Gougerot-Sjogren et 10 sujets normaux. L'ensemble de. ces données suggèrent que la LAMP pourrait jouer un rôle majeur dans la pathogénie du LED.

IMMUNOLOGY. — Pathogenic antibodies in systemic lupus erythematosus: anti-LAMP antibodies.

We recently demonstrated that a monoclonal anti-DNA antibody, spontaneously produced in lupus B/W mice, recognizes the same protein(s) at the surface of several human cell types involved in lupuc pathogenesis including normal human erythrocytes, normal platelets and rat neuronal tissue. This cell-surface protein(s) cross-react(s) with double-stranded DNA.

We suggest to call this protein(s) LAMP [lupus associated membrane protein(s)].

Here we show that: (1) immunoglobulins eluted from kidneys of autoimmune MRL/lpr/lpr mice strongly react with LAMP.

(2)Anti-LAMP antibodies are present in large amount in MRL/lpr and B/W mice sera. (3) Anti-LAMP are present in 25 out of 25 human S LE sera ranged as SLE on the basis of revised American Rheumatism Associated classification. Interestingly, two of these sera did not dysplay anti DNA anti-body activity.

Taken together, these results strongly suggest a role of LAMP in the pathogeny of SLE..

INTRODUCTION. — Les anticorps anti-ADN double brin sont un marqueur de LED et sont considérés comme responsables de lésions tissulaires en particulier rénales par l'intermédiaire du dépôt de complexes immuns ADN anti-ADN [1]. Cependant, il est paradoxal qu'il soit très difficile de produire par immunisation des anticorps anti-ADN [2] alors que de tels anticorps sont spontanément produits en grande quantité au cours du LED humain et murin.

Nous avons récemment montré qu'un anticorps monoclonal anti-ADN le PME 77, reconnaît 5 polypeptides de 34, 33, 17, 16 et 14 K à la surface de différents types cellulaires humains concernés dans la pathogénie du LED ([3], [4]).

Des données récentes suggèrent le rôle pathogène de cette ou de ces protéines de surface cellulaire.

MATÉRIEL ET MÉTHODES. — Sérums. Les sérums de souris MRL/lpr, B/W et BALB/c sont chauffés à 56°C pendant 30 mn puis stockés à —20°C. Les sérums de patients atteints de LED, de polyarthrite rhumatoïde, de sclérodermie, de syndrome de Goujerot-Sjogren et les sérums humains normaux sont stockés à — 20°C dans les mêmes conditions.

Anticorps anti-ADN monoclonal murin. — L'hybride PME77 sécrétant des anticorps anti-ADN a été isolé par fusion entre une lignée myélomateuse non sécrétante (P3 x63 Ag. 8653) et des cellules de rate de souris

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C. R., 1986, 2e Semestre (T. 303) Série III - 16


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B/W F1 (NZBxNZW). L'anticorps PME 77 est une IgG 2 b, Kappa spécifique de l'ADN double brin ([5], [6]).

L'élution des immunoglobulines des reins de souris lupiques MRL/lpr est effectuée selon la technique décrite par Woodroffe et Wilson [7].

Lignées cellulaires. — La lignée érythroleucémique de souris IW 32 fournie par le Dr N. Casadevall et Mme O. Muller a été utilisée pour cette étude [8].

Technique d'immunotransfert d'un extrait de cellules IW 32. — La technique est effectuée selon la méthode précédemment décrite [3].

Comparaison de l'aspect obtenu en immunotransfert avant et après action de l'élastase. — Deux extraits de cellules IW 32 sont préparés. Un premier extrait est préalablement traité à l'élastase à une concentration de 100 ug/ml. Un deuxième extrait n'est pas traité. Dans les 2 cas, la viabilité cellulaire est supérieure à 95 %.

Traitement des cellules IW 32 à l'élastase. — Des cellules viables IW 32 sont traitées à l'élastase dans un tampon contenant du tris 50 mM, NaCl 0,15 M, à pH 8,0 à une concentration finale de 10 ug/ml pendant 7 mn à 4°C. Les protéines membranaires sont ainsi décapées des cellules puis libérées dans le milieu par le traitement à l'élastase. Le « surnageant élastase » est ensuite étudié.

RÉSULTATS ET DISCUSSION. — En utilisant un extrait total de la lignée cellulaire IW 32, nous montrons, par la technique d'immunotransfert que les IgG éluées des reins de souris lupiques MRL/lpr/lpr réagissent fortement avec les 5 polypeptides. Pour confirmer qu'il s'agit bien de polypeptides membranaires, un traitement à l'élastase (100 ug/ml) est effectué sur les cellules vivantes. Après ce traitement, l'intensité des 5 bandes est fortement diminuée. Lorsque les IgG éluées sont préincubées avec l'ADN double brin l'intensité de la réaction est également fortement diminuée, démontrant qu'il existe une réaction antigénique croisée entre ces polypeptides membranaires et l'ADN double brin. En revanche, aucune bande n'est observée avec les IgG éluées des reins de souris normales BALB/c.

Ces résultats démontrent que les IgG éluées des reins de souris MRL/lpr/lpr réagissent spécifiquement avec la LAMP, exprimée à la surface des cellules IW 32. La LAMP pourrait donc bien jouer un rôle dans le déclenchement des lésions rénales d'autant qu'elle est présente à la surface des cellules glomérulaires humaines normales. Ceci pourrait constituer une alternative au dépôt de complexes immuns ADN-anti-ADN.

Nous avons aussi étudié la présence d'anticorps anti-LAMP dans le sérum de patients atteints de LED et de souris lupiques B/W et MRL/lpr/lpr. Le « surnageant élastase » décrit plus haut est utilisé comme source d'antigène car nous avons récemment montré qu'il contient les 5 polypeptides de surface cellulaire [9]. Nous démontrons par la technique d'immunotransfert en utilisant le « surnageant élastase » comme antigène, que des anticorps anti-LAMP sont présents dans l'intégralité des 25 sérums de patients atteints de LED.

Fait intéressant, 2 sérums de patients atteints de LED, défini suivant la classification de l'American Rheumatism Association, bien que négatifs en anti-ADN ont des anticorps anti-LAMP.

En revanche, 10 sérums de patients atteints de polyarthrite rhumatoïde, 4 sérums de patients atteints de sclérodermie, 2 sérums de patients atteints de syndrome de Gougerot-Sjogren et 10 sérums humains normaux sont négatifs en anticorps anti-LAMP.

Nous montrons enfin que des anticorps anti-LAMP sont présents en forte quantité dans le sérum des souris lupiques MRL/lpr/lpr et B/W mais pas dans le sérum des souris normales BALB/c.

Par ailleurs, nous avons récemment produit un antisérum polyclonal anti-LAMP en immunisant un lapin avec la LAMP [9], démontrant son pouvoir immunogène contrairement à l'ADN double brin.


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L'ensemble de ces données indiquent que la LAMP pourrait bien déclencher une réponse autoimmune similaire à celle rapportée pour le récepteur de l'acetylcholine dans la myasthénie ([10], [11]). Ces observations suggèrent fortement le rôle pathogène de la LAMP dans le LED. Reçue le 30 juin 1986.

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[8] P. TAMBOURIN, N. CASADEVALL, J. CHOPPIN, C. LACOMBE, J. M. HEARD, S. FICHELSON, F. WENDLING, W. D. HANKINS et B. VARET, Prod. Natl. Acad. Sc. U.S.A., 80, 1980, p. 6269-6373. [9] L. JACOB, M. A. LETY, J. F. BACH et D. LOUVARD, Proc. Natl Acad. Sc. U.S.A., 1986 (sous presse). [10] I. KAO et D. B. DRACHMAN, Science, 196, 1977, p. 527-529.

[11] S. HEINEMAN, S. BEVAN, R. KULLBERG, J. LINDTROM et S. RICE, Proc. Natl. Acad, Sc. U.S.A., 74, 1977, p. 3090-3094.

L. J.: I.N.S.E.R.M., Hôpital Necker,

161, rue de Sèvres, 15015 Paris;

Département de Médecine interne, Hôpital Cochin,

27, rue du Faubourg-Saint-Jacques, 75014 Paris;

M. A. L. et J. F. B. : I.N.S.E.R.M., U 25, Hôpital Necker,

161, rue de Sèvres 75015 Paris;

D. L. : Institut Pasteur, Département de Biologie moléculaire,

Unité de Biologie des Membranes 75015 Paris.

C. R., 1986, 2e Semestre (T. 303)

Série III - 17



C. R. Acad. Sc. Paris, t. 303, Série III, n° 6, 1986

197

BIOLOGIE GÉNÉRALE. — Synthèse de novo d'hydrocarbures potentiellement aphrodisiaques chez les Drosophiles. Note de Tchoy-Pek Chan Yong et Jean-Marc Jallon, présentée par Jean Roche.

La synthèse de novo d'hydrocarbures cuticulaires potentiellement aphrodisiaques a été mise en évidence après injection d'acétate radioactif à dès femelles ou des mâles D. melanogaster Canton S vierges et matures. Les taux d'incorporation de la radioactivité dans ces hydrocarbures ont été comparés suivant le sexe et l'âge. Il est maximum chez les femelles de deux jours.

GENERAL BIOLOGY. — De novo synthesis of potentially aphrodisiac cuticular hydrocarbons in Drosophila.

The de novo synthesis of potentially aphrodisiac cuticular hydrocarbons was demonstrated by injection of radiolabelled acetate into virgin and mature males and females D. melanogaster Canton S. The relative incorporation of radioactivity into the hydrocarbons were compared with sex and age. It is maximum in the 2 day old females.

INTRODUCTION. — Le système phéromonal des Drosophiles D. melanogaster comprend au moins [1] :

- des composés excitateurs pour les mâles. Il s'agit d'hydrocarbures linéaires insaturés à longues chaînes ayant au moins une double liaison en' position 7 et une longueur de chaîne supérieure ou égale à 25 carbones [2]. Les plus efficaces sont les diènes 7, 11, très vraisemblablement avec une géométrie cis,. cis, produits par les seules femelles dans la cuticule desquelles ils sont très abondants, en particulier le 7, 11-heptacosadiène [2].

— un composé inhibiteur pour les mâles, l'acétate de cis-vaccényle, produit dans le bulbe éjaculateur des mâles ([3], [4]).

— le 7-tricosène est un aphrodisiaque pour les mâles de l'espèce jumelle et sympatrique D. simulans. Ce composé est produit en abondance par les deux sexes de l'espèce D. simulans aussi bien que par les mâles D. melanogaster.

Nous avons décrit les compositions des hydrocarbures dans les espèces D. melanogaster et D. simulans ainsi qu'un certain nombre de leurs variations dans des races géographiques ou des souches mutantes avant d'aborder l'étude de la biosynthèse de ces divers composés qui présentent des analogies structurales marquées ([1], [5]). Les travaux pionniers de Jackson et Blomquist ([6], [7]) suggèrent que les hydrocarbures linéaires à longues chaînes dérivent chez les insectes comme chez la plupart des organismes, sauf certains microorganismes [8], des acides gras homologues par décarboxylation. Les acides gras sont synthétisés par un mécanisme d'élongation par addition d'unités de deux carbones aux homologues de longueur au moins C16 ou C18 et les doubles liaisons sont introduites par des désaturases spécifiques [9].

MATÉRIEL ET MÉTHODES. — Les mouches sont de l'espèce D. melanogaster souche Canton S. Dans l'heure qui suit l'émergence, les mouches des deux sexes sont séparées et maintenues par 5 sur milieu nutritif standard à 25°C. Immédiatement avant leur utilisation pour les expériences, les mouches sont immobilisées par éthérisation.

L'acétate de Sodium [1-14C] (52 mCi/mmole) est fourni par le C.E.A., sous forme de solution aqueuse stérile (0,5 mCi/ml). Il est injecté dans l'abdomen des mouches à l'aide d'un capillaire relié à une micropompe. Sauf cas particulier, les insectes sont maintenus 2 heures à 25°C dans des tubes vides après l'injection, puis leurs hydrocarbures sont extraits par lavage doux à l'hexane : dix mouches à chaque fois sont placées dans des tubes à hémolyse et immergées durant 5 mn dans 150 ul d'hexane, puis agitées au moyen d'un vortex pendant 1 mn. Les mouches sont ensuite rincées avec 150 ul d'hexane et les deux fractions hexaniques rassemblées et concentrées sous un courant d'azote. La radioactivité des hydrocarbures est mesurée par comptage par scintillation liquide dans une solution de toluène contenant du Butyl-PBD (4 g/l de toluène). Le compteur utilisé est un 1211 Rackbeta de LKB; le rendement de comptage pour le 14C est estimé à 85%.

0249-6313/86/03030197 $ 2.00 © Académie des Sciences


198 C. R. Acad. Sc. Paris, t. 303, Série III, n° 6, 1986

TABLEAU I

Synthèse de novo des hydrocarbures cuticulaires de femelles

et de mâles matures et vierges de D. melanogaster Canton S.

De novo synthesis of cuticular hydrocarbons in virgin and mature

females and males D. melanogaster Canton S.

Age et sexe H B R

10 ? 2 jours 36100 1204000 2,9

36600 1249000 2,8

10 $ 3 jours 35400 1580000 2,2

31600 1532000 2,0

10 $ 6 jours 12900 861000 1,5

10 $ 21 jours 25600 1007000 2,5

24600 961000 2,5

5 $ 3 jours éthérisées 2900 1600000 0,2

10 S 2 jours 27000 637000 4,1

33 300 676000 4,7

10 S 3 jours 15600 568000 2,7

18 500 391000 4,5

10 S 6 jours 12300 619000 1,9

5 6" 3 jours éthérisés 1200 362000 0,3

Injection d'acétate radioactif à des mouches mâles et femelles d'âges différents. Durée d'incubation constante : 2 h. H : radioactivité dans les hydrocarbures (cpm). B : radioactivité dans le broyat solubilisé (cpm). R : rendement d'incorporation (%) R = H/H + B.

Injection of radiolabeled acetate into males and females of different ages. Incubation time: 2 hrs. H: radioactivity in the hydrocarbons (cpm). B: radioactivity in the solubilized homogenate. R: radioactivity incorporation (%) R = H/H+B.

Le rendement d'incorporation d'acétate dans les hydrocarbures est calculé en estimant le rapport de la radioactivité des hydrocarbures à celle des hydrocarbures ajoutée à la radioactivité résiduelle dans les mouches. Pour mesurer cette dernière, on broie des lots de 10 mouches à l'aide d'un Potter dans environ 2 x 1 ml d'éther refroidi à 0°C. Après évaporation de l'éther, le broyat est solubilisé dans 200 ul de Soluène-350 Packard (1 nuit à température ambiante), puis compté par scintillation liquide dans 2 ml d'une solution à base de xylène (Insta-Fluor Packard). La radio-chromatographie des hydrocarbures cuticulaires est effectuée sur un chromatographe à détecteur à ionisation de flamme (FID) Intersmat IGC-120FL couplé à un détecteur de radioactivité — dérivation 1 (FID) : 9 (RA). Les échantillons sont analysés sur une colonne remplie SE-30 10% de manière isotherme à 280°C.

RÉSULTATS. — La synthèse de novo des hydrocarbures cuticulaires de mâles et de femelles matures est mesurée en suivant l'incorporation de radioactivité dans les composés cuticulaires après injection aux mouches d'acétate radioactif (14C). Nous avons d'abord étudié cette synthèse chez des femelles vierges de 2 jours. La figure 1 montre qu'elle a

EXPLICATIONS DE LA PLANCHE

Fig. 1. — Cinétique de la synthèse de novo des hydrocarbures cuticulaires de femelles D. melanogaster Canton

S vierges et âgées de 2 jours. : H-quantités de radioactivité incorporées dans les hydrocarbures.

: B-quantités totales de radioactivité incorporées dans toutes les molécules des mouches (cf. Matériel

et méthodes). Fig. 1. — Kinetics of the de novo synthesis of cuticular hydrocarbons in 2 day—old virgin females D. melanogaster

Canton S. : H-radioactivity incorporated into the hydrocarbons. : B-total radioactivity incorporated

incorporated the whole fly (cf. Materials and methods).

Fig. 2. — Radiochromatogramme des hydrocarbures cuticulaires synthétisés de novo par des femelles D. melanogaster Canton S matures. (A) : tracé des pics de radioactivité. (B) : chromatogramme FID. (1), (2), (3) et (4) correspondent aux hydrocarbures avec respectivement 23, 25, 27 et 29 carbones (intensités en unités arbitraires).

Fig. 2. — Radio-GLC chromatogram of the de novo synthesized cuticular hydrocarbons of mature females D. melanogaster Canton S. (A): radioactivity. (B): FID. (1), (2), (3) and (4) represent C23, C25, C27 and C29 hydrocarbon components.


PLANCHE I/PLATE I

TCHOY-PEK CHAN YONG

Fig. 1

Fig. 2


PLANCHE II/PLATE II

TABLEAU I

Synthèse de novo des hydrocarbures cuticulaires de femelles

et de mâles matures et vierges de D. melanogaster Canton S.

De novo synthesis of cuticular hydrocarbons in virgin and mature

females and males D. melanogaster Canton S.

Age et sexe H B R

10 $ 2 jours 36100 1204000 2,9

36600 1249000 2,8

10 $ 3 jours 35400 1580000 2,2

31600 1532000 2,0

10 $ 6 jours 12900 861000 1,5

10 $ 21 jours 25600 1007000 2,5

24600 961000 2,5

5 $ 3 jours éthérisées 2900 1600000 0,2

10 6* 2 jours 27000 637000 4,1

33 300 676000 4,7

10 S 3 jours 15600 568000 2,7

18 500 391000 4,5

10 6* 6 jours 12300 619000 1,9

5 ô* 3 jours éthérisés 1200 362000 0,3

Injection d'acétate radioactif à des mouches mâles et femelles d'âges différents. Durée d'incubation constante : 2 h. H : radioactivité dans les hydrocarbures (cpm). B : radioactivité dans le broyat solubilisé (cpm). R : rendement d'incorporation (%) R = H/H + B.

Injection of radiolabeled acetate into males and females of different ages. Incubation time: 2 hrs. H: radioactivity in the hydrocarbons (cpm). B: radioactivity in the solubilized homogenate. R: radioactivity incorporation (%) R = H/H + B.

TABLEAU II

Composition des hydrocarbures synthétisés de novo par les Drosophiles D. melanogaster de chacun des deux

sexes, matures et vierges établie à partir des radio-chromatogrammes. Composition of de novo synthesized hydrocarbons in mature and virgin males and females

D. melanogaster—deduced from radio-GLC chromatograms.

C23 25 C27 C29

$ 2 jours RA (%) 14,2 27,2 44,0 14,5

CPG (%) 10,6 23,7 45,8 19,9

§ 3 jours RA (%) 8,9 30,7 46,0 14,4

CPG (%) 8,6 17,4 51,8 25,5

S 2 jours RA (%) 57,4 34,5 8,2

CPG (%) 46,3 33,5 10,0 7,6

S 3 jours. . . RA (%) 60,2 39,8

CPG (%) 50,6 25,7 6,7 6,2

RA : surface relative des pics de radioactivité en pourcentage. CPG : surface relative des pics de chromatographie en phase gazeuse en pourcentage (Colonne remplie SE-30 10%, température 280°C). RA: relative area of radioactivity traces in percent; CPG: relative area of GLC traces in per cent (10% SE-30 filled column, temperature 280°C).


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TABLEAU II

Composition des hydrocarbures synthétisés de novo par les Drosophiles D. melanogaster de chacun des deux

sexes, matures et vierges établie à partir des radio-chromatogrammes. Composition of de novo synthesized hydrocarbons in mature and virgin males and females

D. mélanogaster—deduced from radio-GLC chromatograms.

C23 C25 C27 C29

$2 jours RA(%) 14,2 27,2 44,0 14,5

CPG (%) 10,6 23,7 45,8 19,9

9 3 jours RA(%) 8,9 30,7 46,0 14,4

CPG(%) 8,6 17,4 51,8 25,5

.<? 2 jours RA(%) 57,4 34,5 8,2

CPG (%) 46,3 33,5 10,0 7,6

ô» 3 jours . . . RA(%) 60,2 39,8

CPG (%) 50,6 25,7 6,7 6,2

RA : surface relative des pics de radioactivité en pourcentage. CPG : surface relative des pics de chromatographie en phase gazeuse en pourcentage (Colonne remplie SE-30 10%, température 280°C). RA: relative area of radioactivity traces in percent; CPG: relative area of GLC traces in percent (10% SE-30 filled column, temperature 280°C).

effectivement lieu et que le taux des hydrocarbures marqués augmente quasi linéairement au cours du temps pendant 2-3 heures, puis semble plafonner. Étant donné que la quantité d'acétate injectée par mouche présentait expérimentalement une certaine variabilité, nous avons d'une part moyenne les quantités de radioactivité incorporées dans les hydrocarbures sur des lots de 10 mouches (H) et d'autre part mesuré les quantités totales de radioactivité incorporées dans toutes les molécules des mouches — moyennées de la même manière— (B). Les valeurs de B ne varient pas significativement pendant 2 h après l'injection et décroissent lentement ultérieurement. Une durée de 2 h nous semble donc convenable pour comparer les taux d'incorporation dans des mouches de génotypes ou d'âges différents. Chez les femelles D. melanogaster Canton S vierges âgées de 2 jours, le rendement d'incorporation (R = H/H+B) a une valeur voisine de 2,9. Le tableau I compare les valeurs des taux de synthèse de novo des hydrocarbures chez des femelles vierges de 2 à 21 jours et chez des mâles vierges de 2 à 6 jours. Après 2 h d'incubation, ce taux est maximal chez les individus vierges de 2 jours, un peu plus élevé chez les femelles que chez les mâles (environ 1,2 fois plus). Dans les deux sexes, ce taux décroît ultérieurement.

y Le tableau I compare aussi les valeurs des rendements d'incorporation. En ce qui concerne les femelles, ce paramètre ne varie pas beaucoup; sa valeur moyenne de 2,3 est plus de dix fois supérieure à la valeur du taux d'incorporation chez des femelles de 3 jours éthérisées, presque nulle. Elle est plus élevée chez les mâles, essentiellement parce que la radioactivité totale (B) est beaucoup plus faible, alors que la radioactivité intégrée dans les hydrocarbures n'est qu'un peu plus faible.

Nous avons ensuite essayé de préciser par radio-chromatographie la composition des hydrocarbures synthétisés de novo. Malheureusement, nous ne pouvons utiliser avec l'appareil à notre disposition qu'une colonne remplie pour la séparation. Le détecteur FID qui fonctionne simultanément avec le détecteur de radioactivité à la sortie de la colonne permet d'assigner les pics de radioactivité. Les conditions de séparation (propriétés de la colonne, température isotherme) sont assez proches de celles utilisées dans notre première caractérisation des extraits cuticulaires de Drosophiles [10]. Le radio-chromatogramme (fig. 2) révèle les groupes de pics des hydrocarbures avec 23, 25, 27 et 29 carbones, groupes montrant des épaulements comparables à ceux observés avec ce genre de colonne. Nous avons évalué les aires relatives de chacun de ces groupes de


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pics de radioactivité (tableau II) et les avons comparées avec celles mesurées en FID auparavant [11] et dans les expériences rapportées dans cette Note.

Bien qu'il existe des différences dans les valeurs absolues, les hiérarchies des groupes de pics qui sont complexes et les ordres de grandeur de leurs proportions respectives sont comparables, mais il y a des différences dans les valeurs absolues de ces proportions. La radioactivité semble majorer par rapport à l'ionisation de flamme les composés plus légers et minorer les composés plus lourds, ce qui ne permet pas pour autant de conclure à un taux différent d'incorporation.

CONCLUSION. — Nous apportons la preuve d'une synthèse de novo des hydrocarbures

cuticulaires par les Drosophila melanogaster de chacun des deux sexes, quel qu'en soit

l'âge, à partir de l'acétate qui est donc un précurseur commun. Le taux d'incorporation

est maximal chez les femelles de 2 jours; il est presque deux fois supérieur à celui mesuré

lors de la synthèse de novo des hydrocarbures de Musca domestica [7]. Pour mieux cerner

les voies de biosynthèse et leurs carrefours spécifiques d'un sexe ou d'une espèce, une

étude en cours utilise des précurseurs plus longs et plus spécifiques.

Ce travail est soutenu par la F2RCB (Fondation pour la Formation par la Recherche à l'Interface Chimie-Biologie) C.N.R.S.-P.I.R.M.E.D.

Reçue le 12 mai 1986.

RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES

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[2] C. ANTONY, T. DAVIS, D. CARLSON, J. M. PECHINE et J. M. JALLON, J. Chem. Ecol., 11, 1985, p. 1617-1629. [3] J. M. JALLON, O. BENAMAR et C. ANTONY, Comptes rendus, 292, série m, 1981, p. 1147-1149. [4] S. MANE, L. TOMPKINS et R. RICHMOND, Science, 222, 1983, p. 419-421. [5] I. LUYTEN, Comptes rendus, 295, série III, 1982, p. 723-726. [6] G. BLOMQUIST et L. JACKSON, in Prog. Lipid Res., 17, 1979, p. 319-345. [7] J. DILLWITH, G. BLOMQUIST et D. NELSON, Insect Biochem., 11, 1981, p. 187-197. [8] T. P. CHAN YONG, C. LARGEAU et E. CASADEVALL, Nouv. J. Chim., 1986 (sous presse). [9] R. JEFFCOAT, in Essays in Biochemistry, 15, 1979, p. 1-36. [10] J. M. JALLON, C. ANTONY, M. GALLOIS et R. VENARD, Comptes rendus, 291, série D, 1980, p. 717-719.

[11] C. ANTONY, Thèse de doctorat de spécialité, Univ. Paris-VI, 1980.

Laboratoire de Biologie et Génétique évolutives du C.N.R.S.,

91190 Gif-sur-Yvette.


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BIOLOGIE MARINE. — Coût énergétique de la locomotion chez le Copépode Eurytemora hirundoides (Nordquist, 1888). Note de Jésus-Manuel Veiga et Jacques Castel, présentée par Jean-Marie Pérès.

L'énergie dépensée au cours de la nage par le Copépode Eurytemora hirundoides est évaluée. Le coût énergétique de la locomotion est calculé en considérant la demande métabolique (exprimée en calories) nécessaire pour faire mouvoir une unité de poids corporel sur une distance unitaire. E. hirundoides dépense plus d'énergie, à poids égal, que les animaux fusiformes. L'activité locomotrice pour une nage à vitesse constante ne représente que 0,26 % du métabolisme total mais peut dépasser 50 % si l'on tient compte des réactions d'évitement.

MARINE BIOLOGY. — Energy cost of locomotion for the Copepod Eurytemora hirundoides (Nordquist, 1888),

The energy expended by the estuarine copepod Eurytemora hirundoides as it swims through water is evaluated. The energy cost of locomotion is calculated using the amount of fuel (expressed as calories) it takes to transport one unit of body over one unit of distance. It is found that E. hirundoides is not very efficient in swimming because of the poor streamlining of its body. The rate of energy expenditure for constant velocity swimming of the copepod only represents 0.26% of the metabolic rate but considering the escape reactions it can reach up to 50%.

I. INTRODUCTION. — Les Copépodes sont des organismes connus pour avoir un métabolisme élevé. Si l'on arrive, à l'heure actuelle, à bien cerner les problèmes relatifs au métabolisme respiratoire, à la croissance et à la reproduction, on a du mal, en revanche, à déterminer le coût énergétique de la locomotion et l'on serait tenté de penser que celui-ci est élevé du fait de la grande vivacité que montrent ces animaux. Un certain nombre de chercheurs ([1] à [4]) ont essayé de déterminer la quantité d'énergie dépensée par des organismes aquatiques (dont les Copépodes) au cours de la nage mais ces aspects énergétiques de la locomotion font encore l'objet de controverses multiples ([5] à [7]).

Le Copépode Eurytemora hirundoides (Nordquist, 1888) est un élément essentiel des réseaux trophiques pélagiques dans l'estuaire de la Gironde. En nombre, il représente à lui seul toujours plus de 80-90 % du zooplancton dans la zone oligo-mésohaline et peut, à certains moments, coloniser pratiquement tout l'estuaire sur une distance de plus de 70 km [8].

II. MÉTHODES. — Toutes les expériences ont été. réalisées entre 18 et 20°C.

La vitesse de sédimentation de E. hirundoides a été déterminée en déposant, à l'aide d'une micropipette, des individus préalablement fixés au formol au sommet d'une colonne d'eau de 50 cm de hauteur et en chronométrant le temps nécessaire pour qu'ils atteignent le fond; Au total 189 Copépodes dont le prosome mesurait entre 0,36 mm (copépodite 3) et 0,84 mm (femelle adulte) ont été utilisés dans cette expérience.

Les distances moyennes parcourues par unité de temps ont été calculées en introduisant des individus isolés dans un tube horizontal (40 cm de long et 0,5 cm de diamètre) gradué en centimètres. Le tube, rempli d'eau du milieu filtrée sur 63 um, est bouché à une extrémité et recourbé vers le haut à l'autre extrémité de façon à y introduire les animaux, Pour chaque catégorie retenue (mâles, femelles, femelles ovigères et copépodites) 15 individus ont été éprouvés six fois.

Le métabolisme respiratoire deE. hirundoides a été évalué à partir de petites populations d'une centaine d'individus grâce à un respiromètre volumétrique Gilson.

Les pesées ont été faites sur une microbalance Mettler (sensibilité 0,1 ug) après séchage à 60°C pendant 24 h. Le volume des Copépodes a été estimé en assimilant le corps antérieur à un ellipsoïde de révolution et l'urosome à un cylindre [9], Ces mesures ont permis d'estimer la masse volumique à 1,09 g. cm- 3.

III. RÉSULTATS. — Contre toute attente la vitesse de sédimentation de 139 individus de tailles très différentes est apparue relativement constante : v —1,926±0,063 mm. s- 1. Un cas particulier est constitué par les femelles ovigères. Des expériences ont été faites sur une série de 50 individus ayant en moyenne 5,3 oeufs par sac ovigère. La vitesse de

0249-6313/86/03030203 $ 2.00 © Académie des Sciences


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C. R. Acad. Sc. Paris, t. 303, Série III, n° 6, 1986

sédimentation est de 3,400+0,081 mm. s- 1. Ces résultats sont comparables à ceux obtenus chez d'autres espèces de Copépodes dont la vitesse de sédimentation est de l'ordre de 0,4 à 8,3 mm. s- 1 [10].

Les mesures portant sur la vitesse de déplacement montrent que les adultes, exceptées les femelles ovigères, ont une plus grande activité locomotrice que les copépodites (tableau). Cette différence est probablement liée à la reproduction, le rapprochement des sexes étant difficile dans un milieu turbide et en perpétuelle agitation. En outre, il semble bien établi que la vitesse de nage augmente avec le stade de développement [11]. Chez E. affinis, la vitesse moyenne de déplacement des nauplii est de 0,6 à 1,1 mm. s- 1 [12].

TABLEAU

Paramètres biométriques, vitesse moyenne et coût énergétique de la locomotion

chez le Copépode Eurytemora hirundoides.

Biometric parameters, mean speed and energy cost of locomotion

for the copepod Eurytemora hirundoides.

Longueur Volume Poids Vitesse Puissance Coût

prosome total humide moyenne dépensée énergétique

Stades (mm) (mm 3) (ug) (mm.s- 1) (cal. kg- 1, h- 1) (cal.kg-1.m- 1)

Mâles 0,60 1,32. 10- 2 14,3 3,4+0,36 20,8 1,27.103

Femelles 0,84 2,81.10- 2 33,4 3,3 + 0,40 19,7 1,30.103

Femelles ovigères 0,8±0,19

Copépodites 0,36 0,33.10- 2 3,7 1,2+0,18 2,6 3,59.103

La consommation d'oxygène de E. hirundoides, à 18-20°C, est évaluée à 12,88+0,76.10- 3 ul O2.h-1/ug de poids sec (n=27). Cette consommation peut être considérée comme représentative d'un métabolisme actif de l'ensemble des copépodites et des adultes. Si l'on prend 4,8 kcal. l- 1 comme valeur moyenne du coefficient thermique de l'oxygène, ce qui correspond à une utilisation équilibrée de glucides, lipides et protides, on peut évaluer le métabolisme respiratoire à 61,9 kcal.kg-1.h- 1 en poids sec ou 15,5 kcal. kg- 1. h" 1 en poids humide, en supposant que le poids humide représente 4 fois le poids sec.

Connaissant la vitesse moyenne de déplacement d'un organisme et la valeur de son métabolisme actif, on peut estimer le coût global du transport de sa masse corporelle en fonction de la distance parcourue. Il a été montré [2] que ce coût (C) était lié au poids individuel (W) selon l'équation C = a Wb, avec

Les résultats présentés dans le tableau sont comparés (fig.) à ceux obtenus pour des organismes se déplaçant dans un milieu liquide. Il apparaît que le coût global du transport des organismes hydrodynamiques est moins élevé que celui des nageurs de surface (homme, canard). Par ailleurs, l'augmentation de ce coût chez les animaux de petite taille semble liée à l'élévation de leur métabolisme (par unité de poids) et non à un accroissement de la difficulté à se mouvoir dans le milieu. E. hirundoides dépense un peu plus d'énergie, à poids égal, que les animaux fusiformes probablement à cause d'un faible hydrodynamisme.

Les calculs précédents permettent de faire des comparaisons interspécifiques pour juger du degré d'adaptation des organismes à leur milieu mais ils ne donnent aucune indication quant à la part du métabolisme énergétique consacré à l'activité motrice. Chez les Copépodes, le quotient d'exploitation de l'énergie absorbée utilisée pour la croissance est


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d'environ 50 % dans les conditions favorables. Seule la moitié de l'énergie mise en jeu dans le métabolisme respiratoire est donc utilisée pour la maintenance de l'organisme (métabolisme de base) et pour le métabolisme d'activité, soit 7,75 kcal.kg-1.h- 1 dans le cas du Copépode E. hirundoides.

Il reste donc à évaluer l'énergie dépensée pour la locomotion et notamment pour lutter contre les forces de frottement visqueux. Les mesures de la vitesse de sédimentation permettent de calculer un coefficient de résistance (k) lié à la morphologie. La sédimentation dès particules est régie par la loi de Stokes, valable pour les Copépodes qui ont un petit nombre de Reynolds :

avec V: volume du corps, p: masse volumique du corps (1,09 g.cm-3), P0 : masse volumique du liquide (1 g.cm-3), g: accélération de la pesanteur (9,81.102 cm.s-2), n : coefficient de viscosité du liquide (10- 2 g. s-11), v : vitesse de chute (0,19 cm. s-). Puisque cette dernière est constante, on peut admettre que k varie en fonction du volume V(V/k = Cte). Comme il existe une force permanente induisant la sédimentation, le Copépode, au cours de ses déplacements, dépensera plus ou moins d'énergie selon qu'il se dirigera dans le sens de la pesanteur ou à son opposé. La résultante peut être connue puisque toute forcé exercée dans le milieu est contrariée par une force de frottement visqueux R=k n v. Cette force est appréciée à partir de la vitesse moyenne de déplacement et peut être calculée connaissant l'angle formé entre la trajectoire du Copépode et la verticale. Si l'on considère que l'animal se déplace dans toutes les directions de l'espace au hasard et que finalement la résultante moyenne R est pratiquement égale à la force exercée par le Copépode, la puissance fournie par celui-ci sera fonction de sa vitesse de déplacement Pe=k n v 2. L'appareil locomoteur des organismes vivants a une efficience de l' ordre de 20 %. La puissance réellement fournie par E. hirundoides pour un déplacement quelconque sera donc Pi =5 Pe.

Coût énergétique de la nage pour différents organismes en fonction de leur poids (d'après Schmidt-Nielsen, 1972). La valeur pour Calanus helgolandicus a été calculée à partir dès données de Minkina et Pavlova (1981). Energy cost of swimming for various organisms relative to body size (after Schmidt-Nielsen, 1972). The value for Calanus helgolandicus has been computed from Minkina and Pavlova's (1981) data.


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Connaissant la vitesse de locomotion, l'énergie dépensée peut être évaluée à 20 cal.kg- 1, h- 1 pour un adulte et 2,6 cal.kg-1.h- 1 pour un copépodite ce qui représente 0,26 à 0,03 % de la dépense énergétique totale. Cet ordre de grandeur est comparable à celui obtenu pour le Copépode Labidocera trispinosa chez qui l'activité locomotrice représente 0,1 à 0,3 % du métabolisme de base [1].

Les précédents calculs sont basés sur des vitesses moyennes de déplacement. Or les Copépodes se déplacent par à-coups et peuvent atteindre des vitesses instantanées considérables, de l'ordre de 50 cm. s- 1 pendant quelques millisecondes [7]. Si l'on suppose que E. hirundoides présente des réactions de ce type (sauts, évitements) pendant 1 % du temps, le calcul montre qu'il dépensera 4,5 kcal.kg- 1 en 1 h, soit 58 % de son métabolisme total.

Les difficultés rencontrées dans l'estimation du coût énergétique de la locomotion chez les Copépodes proviennent en grande partie de la complexité du comportement de ces organismes. Reçue le 2 juin 1986.

RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES

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Institut de Biologie marine, Université de Bordeaux-I, 33120 Arcachon.


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SYSTÉMATIQUE ANIMALE. — Isolement génétique et taxonomie des huitres plates dans une lagune du sud de la méditerranée occidentale. Note de Françoise Blanc, Hassan Jaziri et Patrick Durand, présentée par Lucien Laubier.

L'analyse du polymorphisme enzymatique à 17 locus de 97 huîtres plates de la lagune de Nador (Maroc) issues d'un même captage, montre que les 49 individus à croissance normale appartiennent à l'espèce Ostrea edulis; par contre le lot des 48 individus à croissance ralentie est constitué de 19 % d'O. edulis et 81 % d'une deuxième espèce O. sp. Cette deuxième espèce qui diffère d'O. edulis par trois locus diagnostiques est une espèce naine morphologiquement semblable à O. edulis qui pourrait être O. stentina, mais son identification reste à vérifier.

ANIMAL SYSTEMATICS. — Animal systematics: genetic isolation and taxonomy of flat oysters from a lagoon in the southwestern Mediterranean sea.

Nador lagoon (Morocco) remains unexploited during the last centuries and flat oysters cultivation began only in 1983 [1]. Oysters are collected as spat from natural populations near the eastern coast inside the lagoon; the size distribution after six months of settling is bimodal: the first mode is at 5,5 cm and the second at 2,5 cm, the smallest individuals are about 1,5 cm.

A number of recent studies have suggested the existence of a strong positive correlation between growth rate and the degree of multiple locus heterozygosity of individuals measured at some electrophoretically detectable enzyme loci [2]. Besides, heterozygotes deficiencies relative to Hardy-Weinberg expectations, were reported to be less among faster growing mussels [4] or american oysters [2]. These findings seem specially to affect natural populations [4] and the present work proposes an attempt to extend these results to the flat oyster Ostrea edulis which has never been studied for this purpose.

Enzymatic polymorphism at 17 presumptive gene loci is reported for 91 flat oysters settled in June 1984, and sampled in April 1985. The size distribution of these oysters was clearly bimodal allowing to divide the sample in two sets: 49 fast-growing and 48 slow-growing individuals. Electrophoretic procedures are described elsewhere [6]. Allelic frequencies are listed in Table.

The data allow us to ascribe the fast-growing sample from Nador (O.e.n.) to Ostrea edulis on the basis of our previous data relative to seven samples of Atlantic and mediterranean french coasts [6]. But amongst the 48 slow-growing oysters, 19% only are to be considered as O. edulis (O. e. b.) while 81% belong to another species O. sp. This second species differs from O. edulis by three diagnostic loci and appears as a dwarf sibling species of Ostrea edulis, with similar larvae and spat. Nei [8] genetic similarity between O.sp. and O. edulis is 0.450 but 0.988 between seven conspecific populations of O. edulis [6]. O. sp. may be O. stentina which range encompasses Mediterranean sea and Atlantic coasts but more data are needed to check this taxonomic identification. If these two flat oysters occur in sympatry in Nador lagoon, physiological and ethological character displacement are to be expected between them.

La lagune de Nador, située sur le littoral méditerranéen du Maroc, est restée non exploitée pendant plusieurs siècles, la passe qui la fait communiquer avec la mer ayant été comblée plusieurs fois, la transformant en sebkha, chott ou marais salant notamment au moment de la conquête arabe et après le tremblement de terre de 1755 (qui détruisit Lisbonne) [1]. Depuis 1983, elle s'est révélée particulièrement propice à la culture des huîtres plates. Ces huîtres sont captées au voisinage du grau et si la croissance de la majorité d'entre elles est supérieure à celles que l'on élève sur les côtes françaises de l'Atlantique, il existe toutefois une fraction non négligeable d'huîtres dites « boudeuses » dont la croissance est plus lente. Ainsi la distribution des tailles 6 mois après la fixation est bimodale le premier mode étant à 5,5 cm et le deuxième à 2,5 cm, les plus petits individus mesurant environ 1,5 cm [1].

Ce ralentissement dans la croissance est connu chez d'autres espèces de Bivalves comme l'huître creuse Crassostrea virginica ou diverses espèces de Moules. Il a souvent été corrélé avec des anomalies de structure génotypique à plusieurs locus génétiques se manisfestant par des déficits d'hétérozygotes (revue in Zouros et Foltz, [2]). Ce phénomène semble affecter davantage les populations naturelles que les populations expérimentales et plusieurs hypothèses explicatives ont pu être rejetées après des analyses confrontant les résultats à des simulations, notamment chez Mytilus edulis; ainsi les effets de consanguinité

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TABLEAU

Fréquences alléliques dans les trois lots d'huîtres plates de la lagune de Nador.

Allelic frequencies in three samples of flat oysters from Nador lagoon.

Alleles O.e.n. O.e.b. O.sp.

Locus

AAT-1 100 477 .611

120 .023 - .269

145 .500 .389

160 (a) - - .731

AAT-2(b) 90 - - 1

100 1 1 -

AK 85 .023

100 .965 1 n.c.

110 .012

IDH-1 87 (a) - - .983

90 .122

100 .878 1 .017

MDH-1(b) 80 .052

90 - - .948

100 1 1 —

MDH-2 100 .635 .778

123 .365 .222 abs.

PGI 74 .020 .111

79 .031

100 .949 .889 .189

130(a) - - .777

150 (a) - - .017

165 (a) - - .017

PGM.. 93 .031

100 .388 .500 .120

106 .500 .437 .362

116 .081 .063 .414

120 (a) - - .069

130 (a) - - .035

6-PGD 90 .020

100 .970 1 n.c.

130 .010

Locus monomorphes : à allèles identiques dans les trois lots : ME-1, IDH-2, SOD-2; à allèles identiques dans les deux lots d'O. edulis: SOD-1; uniquement chez O.sp. : ME-2; n.c, non comptabilisé; (a) allèles spécifiques O.sp.; (b) locus diagnostiques O.sp./O. edulis; O.e.n., Ostrea edulis à croissance normale; O.e.b., Ostrea edulis « boudeuses »; O. sp., Ostrea species.

Monomorphic loci: with identical alleles in the samples: ME-1, IDH-2, SOD-2; with identical alleles in both samples of O.edulis: SOD-1; only in O.sp.; ME-2: n.c, not included; (a) O.sp.: specific alleles; (b) O. sp./O. edulis: diagnostic loci; O. e. n., fast-growing Ostrea edulis; O. e. b., slow-growing Ostrea edulis; O. sp., Ostrea species.

ou de mélanges de populations génétiquement différenciés (effet Wahlund) ne semblent plus pouvoir être considérées comme seules valides à cet égard [3]. Un suivi temporel précis de la structure génotypique d'un échantillon naturel de Mytilus edulis, provenant du détroit de Long Island (U.S.A.), montre que s'il existe, 2 mois après la fixation, une corrélation positive entre le taux de croissance et le taux d'hétérozygotie à cinq locus [4], 4 mois après la fixation, cette corrélation s'est légèrement mais significativement inversée [5].

MATÉRIEL ET MÉTHODES. — Afin de détecter l'existence éventuelle d'une telle corrélation chez Ostrea edulis qui n'a jamais été étudiée à cet égard, nous avons analysé en avril 1985, deux échantillons d'huîtres plates captées en juin 1984 dans la lagune de Nador (Maroc), et appartenant à la même cohorte : 49 individus à croissance normale, 48 individus à croissance ralentie. Ces analyses ont été menées selon les techniques électrophorétiques mises au point précédemment à 17 locus sur sept échantillons d'huîtres plates des côtes de Bretagne et du Languedoc [6]. Ces techniques permettent de comparer le polymorphisme des électromorphes dont l'activité enzymatique est spécifique.


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Les informations fournies par le polymorphisme des électromorphes détectés dans chaque échantillon et traduites en terme de fréquences alléliques se situent à deux niveaux :

1°.: à l'intérieur de chaque échantillon, elles permettent d'estimer la diversité intrapopulationnelle par des indicés comme le taux d'hétérozygotes attendus [7]; il est alors possible d'éprouver par des méthodes statistiques appropriées l'existence de déficit ou d'excès d'hétérozygotes observés dans l'échantillon analysé;

2°. en comparant les échantillons, elles permettent d'évaluer la divergence interpopulationnelle qui est une estimation de la différenciation génétique par le calcul d'indices de similitude ou de distance [8]. Il est évident que deux unités reproductrices possédant, aux mêmes locus, des électromorphes fixés alternatifs, sans que des hétérozygotes soient détectés, sont des unités génétiques entièrement isolées dont la divergence sera élevée au rang spécifique. Ces locus sont dits « diagnostiques » car ils permettent immédiatement de faire la distinction entre individus appartenant à l'une ou l'autre de ces espèces que l'on appelle jumelles si elles sont, par ailleurs, morphologiquement identiques.

Notre but, en comparant le polymorphisme des deux lots d'Ostrea edulis l'un à croissance normale et l'autre à croissance ralentie, était de rechercher l'existence d'une corrélation entre la taille et la diversité génétique. Or, les résultats de notre analyse montrent que le lot à croissance normale O.e. n. est une population d'Ostrea edulis, assez proche des autres populations déjà étudiées [6]; par contre, le lot à croissance ralentie est hétérogène et constitué de deux espèces différentes dont la divergence génétique est élevée.

En effet, parmi les 48 individus de ce lot, 9 seulement (O.e.b) possèdent aux 17 locus analysés des électromorphes déjà identifiés chez O. edulis à croissance normale et appartiennent sans aucun doute à cette espèce. Ces individus constituent les huîtres dites « boudeuses » qui peuvent différer des huîtres à croissance normale par une réduction de l'hétérozygotie à quelques locus. Par suite de l'hétérogénéité de notre échantillon d'huîtres à croissance ralentie, celui des « boudeuses » devient trop faible pour éprouver cette éventuelle réduction.

Les 39 autres individus (O. sp.) se distinguent d'O. edulis (O.e.n. et O.e.b.) par l'existence de 10 électromorphes nouveaux n'ayant été répérés chez aucun spécimen d'O. edulis de l'échantillon de Nador ni chez aucune des 511 huîtres plates adultes appartenant à sept échantillons des côtes françaises analysés auparavant [6]. Le tableau résume ces données traduites en termes alléliques les plus probables présents aux locus étudiés. L'examen de ce tableau montre que, non seulement, les trois locus AAT-2, MDH-1 et ME-2 sont diagnostiques et justifient le classement des 39 individus dans une espèce séparée O.sp., mais que, de plus, deux autres locus (AK et 6-PGD) ne peuvent être révélés dans les mêmes conditions expérimentales qu'O. edulis, ce qui indique une divergence génétique encore plus élevée entre ces deux espèces. Ainsi, l'indice d'identité génétique [8] entre O.sp. et O. edulis peut être estimé à 0,450 alors qu'il atteint 0,988 entre sept échantillons d'O. edulis [6].

DISCUSSION. — D'après les résultats ci-dessus, il semble hautement probable que les huîtres plates à croissance ralentie de la langune de Nador appartiennent à deux espèces différentes : une part est constituée d.O. edulis « boudeuses » dont la croissance est plus lente que la normale; la part la plus importante (81 %) est constituée d'une espèce naine O. sp., actuellement non rentable pour la conchyliculture.

L'huître naine pourrait éventuellement être O. stentina Payr. dont la taille maximale atteint 40 mm [9] et qui semble exister sur les enrochements du port de Nador [1]. Le naissain et les prodissoconques d'O. stentina de même que ceux d'O. sp. sont morphologiquement identiques à ceux d'O. edulis et n'en diffèrent que par la taille ([10]; [11]).

L'identification de cette petite espèce nécessite, l'analyse électrophorétique d'autres échantillons et, d'autre part, la recherche de critères morphologiques diagnostiqués,


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notamment par l'examen en microscopie à balayage de la charnière des prodissoconques

([12]; [13]).

O. stentina est largement distribuée dans le monde : abondante dans le bassin méditerranéen et sur la côte atlantique depuis le golfe de Gascogne jusqu'à la province du Cap en Afrique du Sud [10]; on la trouve aussi bien en zone tropicale ou tempérée chaude sur tous les continents, que dans des zones plus froides comme la côte Sud de l'Argentine ou le littoral Sud Est de l'Australie [10]. Cette vaste distribution suppose une large plasticité adaptative (notamment des températures de ponte) et une longue durée de vie larvaire; elle peut aussi suggérer l'existence d'un complexe d'espèces cryptiques qu'il serait intéressant d'explorer. Notons que dans sa révision de 1967, Ranson [10] réunit sous la dénomination Ostrea stentina, un ensemble de sept taxons, décrits précédemment comme spécifiques. Il semblerait que la validité de ce regroupement mérite d'être éprouvée.

Enfin, la présence en sympatrie en Méditerranée et sur une partie du littoral atlantique

de ces deux espèces congénétiques, qui se traduit par un déplacement des critères alléliques,

devrait également se manifester par un déplacement des caractères physiologiques et

éthologiques tels que les périodes d'émission larvaire, l'éthologie larvaire, etc. Un suivi

temporel et spatial et une étude comparée précise de la reproduction en écloserie pourrait

permettre une approche de l'analyse des mécanismes d'isolement reproducteur entre ces

deux espèces sympatriques d'huîtres plates.

Les auteurs sont très reconnaissants des critiques apportées à la lecture du manuscrit par M. L. Laubier, I.F.R.E.M.E.R., Paris.

Reçue le 26 mai 1986.

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Laboratoire de Zoogéographie génétique, Université Paul-Valéry, B.P. n° 5043, 34032 Montpellier Cedex.


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CYTOLOGIE ANIMALE. — Caractéristiques structurales et innervation du tissu chromaffine de la glande interrénale de l'Axolotl. Note de Gérard Lascar et Jacques Taxi, présentée par René-Jean Couteaux.

La glande interrénale de l'Axolotl est située au bord médio-ventral des reins. Elle est composée principalement de cellules interrénales (CI) et de cellules chromaffines (CC). Les CI, de forme allongée, possèdent un reticulum endoplasmique lisse, des globules lipidiques polymorphes ainsi que des mitochondries à crêtes tubulo-vésiculaires. Deux types de CC à longs prolongements cytoplasmiques ont pu être identifiés suivant l'osmiophilie, la taille et la forme des granules qu'elles renferment : les cellules à noradrénaline (NA) et les cellules à adrénaline (A). Un nombre restreint de contacts synaptiques a été observé à la surface des cellules à NA. Les différences morphologiques, histologiques et ultrastructurales avec la glande interrénale des Anoures sont discutées.

ANIMAL CYTOLOGY, — Structural characteristics and innervation of the chromaffin tissue in the adrenal gland of the Axolotl.

Each adrenal gland of the Axolotl consists of a strip lying all along the medio-lateral edge on the ventral surface of the kidney. The gland is composed of interrenal cells (IC) and chromaffin cells (CC). The IC contained a great number of pleomorphic lipid droplets, smooth endoplasmic reticulum and elongated mitochondria with tubulo-vesicular cristae. Two types of CC, always disposed in clusters and exhibiting long cytoplasmic processes were described according to the electron density, size and shape of granules distributed in their cytoplasm; noradrenalin cells (NA) and adrenalin cells (A). The innervation and ultrastructural differences from the adrenal gland of other Anurans were discussed.

Bien que quelques travaux aient été consacrés à la morphologie, l'histologie et à la

morphogenèse des glandes interrénales des Amphibiens Urodèles ([1] à [4]), un seul article

a traité de l'étude ultrastructurale des cellules chromaffines (CC) chez la Salamandre [5].

C'est pourquoi nous présentons un ensemble d'observations sur ce tissu dans la glande

interrénale de l'Axolotl, Urodèle néoténique (Ambystoma mexicanum).

MATÉRIEL ET TECHNIQUES. — Les Axolotls, préalablement anesthésiés au MS 222 (Sandoz) à la concentration de 1 %, ont été fixés par perfusion intracardiaque de 50 ml d'un mélange de paraformaldéhyde à 1 % et de glutaraldéhyde à 1 % dans du tampon phosphate de sodium 0,2 M pH 1,2.

Après 15 mn, des blocs de glande interrénale sont disséqués et immergés dans le même fixateur pendant 2 h. On a également réalisé des fixations par immersion de petits blocs de tissu dans du glutaraldéhyde à 2 % Dans tous les cas les pièces ont été post-fixées au tétroxyde d'osmium à 1% dans du tampon phosphate pendant 1 h. Des fixations directes au tétroxyde d'osmium à 2 % dans le tampon phosphate ont aussi été pratiquées. D'autre part, une partie des pièces perfusées a été traitée selon la modification de la méthode chromaffine adaptée à la microscopie électronique par Tranzer et Richards [6]. Cette méthode a été utilisée en vue d'identifier plus facilement les CC. Les pièces sont ensuite déshydratées par les alcools, puis l'acétone, et incluses dans l'araldite. Les coupes sont faites en alternance : les semi-fines, qui seront colorées à l'Azan-Bleu de toluidine et les ultrafines qui seront contrastées à l'acétate d'uranyle et au citrate de plomb.

Des données quantitatives sur. micrographies électroniques ont été obtenues à l'aide d'un analyseur d'images Digiplan (Kontron).

RÉSULTATS. — Les glandes interrénales forment deux bandelettes continues, de couleur jaune clair, localisées au bord ventro-médian des reins; comme eux, elles vont en s'épaississant de l'avant vers l'arrière.

En microscopie photonique, avec la méthode de Tranzer et Richards, on peut reconnaître deux types de cellules formant deux ensembles généralement séparés par une mince cloison conjonctive mais pouvant s'interpénétrer par endroits :

(1) les cellules interrénales (CI) ont un noyau sombre et un cytoplasme clair montrant par réfringence les globules lipidiques. Elles sont de grande taille, fusiformes et toujours groupées en cordons cellulaires très contournés (fig. 1);

(2) les cellules chromaffines (CC), très sombres, au point que le noyau se distingue difficilement du cytoplasme, sont beaucoup moins nombreuses que les CI. Elles sont

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souvent très allongées et flexueuses, toujours disposées par petits groupes au voisinage immédiat de grosses veines (fig. 1). Elles ont été rencontrées dans tous les prélèvements et semblent donc présentes d'un bout à l'autre de la glande. Leur cytoplasme ne contient jamais de globules lipidiques.

En microscopie électronique, les CI se distinguent facilement par la présence dans leur cytoplasme de globules lipidiques de taille très inégale, dont le contenu est mal conservé avec la méthode de Tranzer et Richards (fig. 2), et de mitochondries à crêtes tubulovésiculaires.

Les CC sont de forme généralement allongée, mais peuvent présenter un contour polygonal en fonction de l'orientation de la coupe. Elles possèdent des prolongements lamelliformes, eux-mêmes pourvus de fines expansions, qui s'insinuent entre les corps cellulaires (fig. 3). Ces cellules sont caractérisées par l'abondance dans leur cytoplasme de granules denses aux électrons. La méthode de Tranzer et Richards permet de distinguer deux types cellulaires contenant des granules de densité différente, dans lesquels on peut reconnaître des cellules à noradrénaline (NA) et des cellules à adrénaline (A), par référence à ce qui a été établi chez les Mammifères [7] (fig. 3).

Les cellules à NA, les plus nombreuses, sont souvent très allongées avec un noyau elliptique. Elles contiennent essentiellement des granules en majorité très fortement denses aux électrons dans un cytoplasme souvent parsemé de grains de glycogène (fig. 4). La forme et la taille des granules varie considérablement d'une cellule à l'autre et à l'intérieur d'une même cellule : ils sont ronds, ou plus souvent elliptiques, avec une matrice homogène entourée d'une membrane peu visible, sauf dans le cas assez fréquent où la fixation, notamment le glutaraldéhyde, entraîne une certaine rétraction du matériel dense, faisant apparaître un halo clair entre celui-ci et la membrane. Leur diamètre moyen est de 196 + 45 nm avec des valeurs extrêmes pouvant aller de 45 nm à 260 nm.

Les autres organites n'occupent qu'une modeste part de la cellule : les mitochondries peu nombreuses sont le plus souvent disposées immédiatement sous la membrane plasmique, laquelle présente fréquemment des images d'endocytose ou d'exocytose; l'appareil de Golgi et le reticulum endoplasmique sont peu développés (fig. 4).

EXPLICATIONS DES PLANCHES

Planche I

Fig. 1. — Glande interrénale de l'Axolotl. Cordons cellulaires montrant les cellules interrénales (astérisques) disposées au voisinage des tubules rénaux (T) et les cellules chromaffines beaucoup plus sombres (flèches). Méthode de Tranzer et Richards (G x 200).

Fig. 1. — Adrenal gland of the Axolotl. Cellular cords with interrenal cells (asterisks) lying near renal tubules (T) and darker chromaffin cells (arrows). Method of Tranzer and Richards (M x 200).

Fig. 2. — Champ montrant les aspects très différents des cellules interrénales à gros globules lipidiques (CI) et des cellules chromaffines à granules très denses (CC). Méthode de Tranzer et Richards (G x 6 350).

Fig. 2. — Field showing the different aspects of interrenal cells with large lipoid droplets (CI) and chromaffin cells with very electron dense granules (CC). Method of Tranzer and Richards (M x 6,350).

Fig. 3. — Groupe de CC. La méthode de Tranzer et Richards permet de distinguer les cellules à noradrénaline très sombres (NA) et les cellules à adrénaline sensiblement plus claires (A). On remarque de longs prolongements, des cellules à NA pouvant former des faisceaux (flèches) (G x 6400).

Fig. 3. — Group of CC. The method of Tranzer and Richards well demonstrates the cytological differences between darker noradrenaline cells (NA) and clearer adrenaline cells (A). Note long cytoplasmic processes, of the NA cells sometimes arranged in bundles, (arrows) (M x 6,400).


PLANCHE I/PLATE I

GÉRARD LASCAR


PLANCHE II/PLATE II


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Planche II

Fig.4. - Cellule à NA montrant le polymorphisme des granules chromaffines, un petit dictyosome (D) et des grains de glycogène (G). Méthode de Tranzer et Richards (Gx 23650).

Fig. 4. —A NA cell showing pleomorphic chromaffin cells, a small dictyosome (D) and glycogen granules (G). Method of Tranzer and Richards (Mx23,650).

Fig. 5. - Les granules chromaffines sont beaucoup: plus rétractés dans la cellule à A que dans la cellule à NA

(flèches) (Gx18150).

Fig. 5. — To show that chromaffin granules are much more retracted in A cell than in N A cell (arrows)

(M*18,150).

Fig. 6.- Synapse de type ganglionnaire (flèche) dans un microganglion associé au tissu chromaffine. Fixation

au tétroxyde d'osmium (G x 12300). Fig. 6. — Ganglionic-like synapse (arrow) in a microganglion close to the chromaffin tissue, OsO4 fixation (Mx 12,300).

Fig. 7 et 8.— Contacts de type: synaptique sur des cellules chromaffines. Méthode de Tranzer et Richards (fig. : Gx31500; fig. 8: Gx40000).

Figs. 7 and 8. — Synaptic contacts on chromaffin cells. Method of Tranzer and Richards (Fig, 7 : M x 31,500;

Fig. 8: Mx40,000

Les cellules à A, beaucoup moins nombreuses, mais de même forme, se distinguent des cellules à NA par la moindre densité aux électrons de leurs granules, ce qui donne à l'ensemble de la cellule un aspect beaucoup plus clair (fig. 3 et 5). La partie dense de ces granules est souvent rétractée, le halo clair étant bien plus large en moyenne que dans le cas des grains à NA. Le diamètre moyen de ces grains est sensiblement inférieur à celui des grains à NA : 144+43 nm, avec des valeurs extrêmes pouvant aller de 100 à 200 nm; lesy autres caractéristiques cytoplasmiques ne diffèrent pas de celles des cellules à NA.

Après fixation au seul glutaraldéhyde, bien que, comme prévu, la conservation des organites soit dansl'ensemble meilleure, la distinction entre cellules à NA et à A est encore beaucoup plus délicate, voire impossible.

Après fixation au tétroxyde d'osmium pur, la rétraction du contenu dense des grains est beaucoup plus forte.

Au voisinage des cellules chromaffines on trouve dans certaines coupes, des faisceaux de fibres amyéliniques, et, dans un cas, des neurones y étaient associés formant un microganglion intramural où a été observée une synapse ganglionnaire typique de Batracien [11] (fig. 6). Au sein même des groupes de cellules chromaffines, malgré une recherche systématique, seules quelques images ont été rencontrées (fig. 7 et 8), interprétables comme des synapses axosomatiques, bien que toutes les caractéristiques morphologiques des synapses n'y soient pas toujours réunies.

DISCUSSION. - Nos observations Sur la glande interrénale de l'Axolotl font ressortir certaines particularités. (1) Les CI aussi bien que les CÇ sont beaucoup plus allongées, à noyau elliptique et à prolongements cytoplasmiques souvent très longs, par comparaison avec ce qui a été trouvé chez les Amphibiens Anoures ([8] à [10]) ou chez d'autres

Urodèles ([2], [5]). Il est possible que les fixations utilisées aient amené certaines rétractions mais, dans l'ensemble, ces particularités de forme ne paraissent pas pouvoir être rapportées

à un artefact de fixation. (2) L'utilisation d'une technique signalétique a permis de mieux démontrer l'existence de deux types de CC, déjà évoquée par Berchtold [2] chez la

Salamandre et le Triton sur la base de la méthode de Hillarp et Hökfelt à l'iodate de


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potassium : les cellules à NA d'aspect très sombre et les cellules à A plus claires et beaucoup moins nombreuses. Ceci est en accord avec les données des auteurs qui ont travaillé sur les interrénales d'Amphibiens, tant d'Anoures ([8] à [10]) que d'Urodèles [5]. Les valeurs du diamètre des granules rapportées ici sont du même ordre de grandeur que celles données pour le Xénope [8]. Elles sont sensiblement plus faibles que celles observées chez d'autres Anoures : 200 nm au heu de 230 à 250 nm pour les cellules à NA et 145 nm au lieu de 240 à 250 nm pour les cellules à A [9]. Il ressort clairement de nos chiffres que le polymorphisme des granules est beaucoup plus accusé dans les cellules à NA, comme il est généralement de règle dans les autres espèces. Il est possible que les traitements cytologiques, en particulier la fixation, soient responsables de ces différences, bien que les procédés utilisés par les différents auteurs soient assez voisins. (3) Alors que nous avons assez souvent rencontré des fibres nerveuses et même des neurones formant des sortes de microganglions au voisinage immédiat des CC, nous n'avons trouvé que quelques rares images susceptibles d'être interprétées comme des contacts synaptiques entre des fibres nerveuses d'origine inconnue, identifiables par leur contenu en vésicules « synaptiques », et les cellules à NA. Il ne semble donc pas que chaque CC soit innervée. De ce point de vue, l'innervation de la glande interrénale de l'Axolotl semble assez comparable à celle de certains Anoures considérés comme primitifs [10].

Les auteurs remercient bien sincèrement les Professeurs C. Gallien et Ch. Houillon de leur avoir aimablement fourni les Axolotls.

Reçue le 2 juin 1986.

RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES

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[11] J. TAXI, Comptes rendus, 252, 1961, p. 174-176.

Laboratoire de Cytologie, Université Pierre-et-Marie-Curie,

Institut de Neurosciences, U.A.-C.N.R.S., n° 1199,

7, quai Saint-Bernard, 75252 Paris Cedex 05.


C.R. Acad, Sc. Paris, t. 303, Série III, n° 6, 1986 217

PHYSIOLOGIE ANIMALE. — Variation des capacités osmorégulatrices au cours du développement post-embryonnaire de Penaeus japonicus Bate, 1888 (Crustacea Decapoda). Note de Guy Charmantier, présentée par Théodore Monod.

Les stades larvaires zoé 2 et 3 et mysis 1 à 3 sont légèrement hyper-osmoconformateurs. Après la métamorphose, la régulation des post-larves devient hyper- hypo-osmotique comme elle l'est chez les adultes; l'intensité de la régulation s'accroît progressivement jusqu'au cinquième stade post-larvaire.

ANIMAL PHYSIOLOGY. — Variation of osmoregulatory capacity during the post-embryonic development ofPenaeus japonicus Bate, 1888 (Crustacea Decapoda).

Osinotic regulation was studied in larval and post-larval stages of Penaeus japonicus at 25°C (fig. 1). Due to the small size of the larvae, measurements of hemolymph osmotic pressure has only been possible from stage zoea 2. In larval stages zoea 2 and 3 and mysis 1 to 3, the animals were slightly hyper-osmoconforming. After metamorphosis, regulation in post-larvae changed to the adult type (hyper- hypo-osmotic). The strength of the hyper- and hypo-regulation gradually increased up to the fifth post-larval stage (ten days after metamorphosis), at which stage the adult level of osmotic regulation was reached. Preliminary studies showed that the ability to survive in low salinities decreases during metamorphosis, while the animals shift from the larval to the adult type of osmoregulation. Changes affecting the hydro-mineral metabolism may be considered as one of the physiological consequences of metamorphosis.

Chez les Crustacés, les caractéristiques de la régulation osmotique et ionique au cours de l'ontogenèse n'ont été étudiées que chez un petit nombre d'espèces de Décapodes ([1] à [9]). Aucune tendance générale ne se dégage pour l'instant de ces travaux quant à l'évolution des capacités osmorégulatrices au cours du développement post-embryonnaire [9]. Le type adulte d'osmorégulation apparaît ainsi à des stades différents du développement selon les espèces. Il est donc souhaitable d'augmenter le nombre d'espèces étudiées de ce point de vue, en particulier pour des groupes; tels que celui des Natantia chez lequel les données sont peu nombreuses [6]. Cette Note a pour but de préciser les principales caractéristiques de l'osmorégulation au cours de l'évolution larvaire et post-larvaire de Penaeus japonicus, dont on connaît chez l'adulte les types d'ionorégulation [10] et d'osmorégulation (Thuet, Charmantier-Daures, Charmantier et Trilles, résultats non publiés). La connaissance des capacités osmorégulatrices de Penaeus japonicus à divers stades de son développement peut également contribuer au choix de salinités optima d'élevage.

MATÉRIEL ET MÉTHODES. — Les animaux ont été obtenus en janvier et février auprès de la station Ifremer

(Deva-Sud) de Palavas-les-flots (Hérault). Les larves y sont produites selon une technique d'élevage en eau

plaire, à une température de 25 à 27°C ([11], et G. Le Moullac, équipe Méréa, communication personnelle).

Après le transport des animaux au laboratoire, nous avons déterminé les différents stades larvaires et

post-larvaires d'après leurs particularités morphologiques ([12] à [14]) résumées sur des fiches [Decouture,

Hirata, Yamabe, Ledorven et Mollo, non publié]. Le développement de Penaeus japonicus comporte de

nombreux stades larvaires : six stades nauplius (durant en tout environ 36 h à 25°C), trois stades zoé

(24h chacun) et trois stades mysis (durant ensemble environ 4 jours). Le troisième stade mysis s'achève par

une mue de métamorphose donnant la première post-larve : les stades post-larvaires se succèdent ensuite avec,

pour les premiers, des intermues de 24 à 48 h ([12] à [15]); les post-larves sont désignées, soit par le nombre de

jours écoulés depuis la métamorphose (P5 : 5 jours après la métamorphose) soit par leur stade (PL5 : cinquième

stade post-larvaire).

Les élevages en salinité contrôlée ont été menés à 25°C, dans des boîtes en plastique transparent fermées, contenant environ 300 ml de milieu constamment aéré. Les milieux de faible salinité (jusqu'à 200 mosm. kg- 1, soit environ 6,8 %) ont été obtenus en diluant de l'eau de mer avec de l'eau du robinet.. La faible taille des animaux nous a contraint à pratiquer des prélèvements d'hémolymphe sous huile minérale (afin d'éviter des phénomènes d'évaporation et dessiccation) par insertion dans le coeur d'une micropipette en verre. Les mesures de pression osmotique ont été réalisées sur un micro-osmomètre Kalber-Clifton requérant 30 à 50 nl. Cette

0249-6313/86/03030217 $ 2.00 © Académie des Sciences


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C. R. Acad. Sc. Paris, t. 303, Série III, n° 6, 1986

technique nous a permis d'obtenir des résultats reproductibles à partir du stade zoé 2, soit pour des animaux mesurant 1,3 à 2,0 mm de long. Chaque série de mesures de la pression osmotique de l'hémolymphe a toujours été accompagnée de celle de l'eau d'élevage, dont la pression osmotique a été également contrôlée sur un osmomètre Roebling.

RÉSULTATS. — Temps d'adaptation. — Après un transfert rapide depuis l'eau de mer (1050 mosm. kg- 1, 35,7 °/°°) dans un milieu dilué (500 mosm. kg- 1, 17 °/00), la pression osmotique de l'hémolymphe est stabilisée en 1 heure au stade zoé 3, 2 à 3 h chez les post-larves P6 PL4, moins de 6 h en stade post-larvaire P20 PL10. Par la suite, nous avons maintenu les animaux de 6 à 24 h dans chaque milieu avant la mesure de leur pression osmotique.

Osmorégulation (fig. 1). — Les stades zoé 2 et 3 sont légèrement hyperosmoconformateurs sur toute l'étendue de l'échelle des salinités. L'hyper-osmoticité augmente légèrement en fin de stade zoé 3. Les trois stades mysis présentent également une régulation hyper-osmoconformatrice, mais dès le stade mysis 2, la mortalité augmente dans le milieu à 500 mosm. kg- 1 (17 °/00) où les larves deviennent isosmotiques; pour les mysis 3, la plus faible salinité compatible avec la survie est de 700 mosm. kg- 1 (23,8 °/00).

Le type de régulation change après la métamorphose : dès la fin du premier stade post-larvaire (qui dure environ 48 h à 25°C), la régulation est légèrement hyper- (en


PLANCHE I/PLATE I

GUY CHARMANTIER

Penaeus japonicus : variations de la différence entre les pressions osmotiques de l'hémolymphe et du milieu (HL-ML) en fonction de la pression osmotique du milieu (ML). Chaque point est la moyenne de 10 à 15 mesures (exceptionnellement 5 dans certains milieux très dilués), encadrée par l'intervalle de confiance. Z : stade zoé; M : stade mysis; P: nombre de jours après la métamorphose; PL : stade post-larvaire; d : début; f :fin.

Penaeus japonicus: variations of the difference between osmotic pressures of hemolymph and medium (HL-ML), relative to the osmotic pressure of the medium (ML). Each point represents the mean value from 10 to 15 animals (except in some very low salinities: 5), with confidence interval. Z: zoea stage; M: mysis; P: number of days after metamorphosis; PL: post-larval stage; d: beginning; f: end.



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milieux dilués) hypo- (en eau de mer) osmotique; Tisosmoticité correspond à environ 900 mosm. kg- 1 (30,6 9/00). Ces tendances s'accentuent danslés jours suivant la métamorphose, avec augmentation respective de l'hyper- et de l'hypo-osmoticité : le gradient osmotique entre l'hémolymphe et le milieu atteint + 300 mosm, kg- 1 (milieu dilué à 300 mosm.kg- 1, 10,2 0%) et — 150 mosm. kg- 1 (eau de mer, 1050 mosm. kg- 1, 35,7 °/00) à partir du stade P10 PL5. Corrélativement, les capacités de survie en milieu dilué s'accroissent : la survie est possible dans un milieu à 500 mosm. kg r1 (17 °/0o) au stade P6 PL4 et dans un miheu à 200 mosm.kg- 1 (6,8 %0) à partir du Stade P10 PL5. Au-delà, les capacités osmorégulatrices ne varient pratiquement plus.

RÉSUMÉ, DISCUSSION ET CONCLUSION. — La régulation osmotique subit des changements au cours du développement post-embryonnaire de Penaeus japonicus. Durant la vie larvaire (stades zoé 2 et 3 et mysis 1 à 3), les animaux sont légèrement hyperosmoconformateurs sur toute l'étendue de l'échelle des salinités utilisées. Le gradient osmotique entre l'hémolymphe et le milieu extérieur augmente légèrement en fin de zoé 3 (ce qui peut provenir d'un effet de la prémue) et durant le stade mysis 1.

A partir du premier stade post-larvaire, la régulation devient hyper- hypo-osmotique, du même type que celle de l'adulte. L'intensité de l'hyper-régulation en milieux dilués et de l'hypo-régulation en eau de mer augmente progressivement avec le temps et la succession des stades, jusqu'au.5e stade post-larvaire (PL5) soit 10 jours après la métamorphose (P10) : à partir du stade PL5, les gradients osmotiques entre l'hémolymphe et le milieu sont semblables à ceux des adultes (Thuet et coll., résultats non publiés). -

En résumé, à une régulation larvaire hyper-oSmoconforrnatrice succède une régulation post-larvaire de type adulte hyper- hypo-osmotique dont l'intensité augmente jusqu'au stade P10 PL5. Comme chez Homarus americanus [8], la métamorphose de Penaeus japonicus, outre ses incidences morphologiques, anatomiques, écologiques et éthologiques ([12] à [14]), s'accompagne également de modifications physiologiques telles que celles qui affectent l'osmorégulation. L'étude comparée d'autres métabolismes chez les larves et les post-larves permettrait de préciser le contexte physiologique général de la métamorphose.

Bien que nous n'ayons pas encore étudié en détail les répercussions des baisses de salinité sur la survie de Penaeus japonicus, il apparaît clairement que celle-ci varie avec le stade de développement. En effet, la salinité limite inférieure compatible avec la survie est d'environ 17 °/00 pour les larves zoé 2 à mysis 2; elle s'élève à 24 °/00 depuis le stade mysis 3 jusqu'au stade PL3 soit durant environ 5 jours, avant de s'abaisser ensuite progressivement jusqu'à environ 7 7% à partir du stade PL5, 10 jours après la métamorphose. Celle-ci s'accompagne donc d'une moindre résistance de Penaeus japonicus aux fluctuations de salinité. Une connaissance plus précise de ces limites serait utile en élevage et des travaux dans ce sens seront entrepris très prochainement. De plus, les stades les plus fragiles vis-à-vis d'une baisse de la salinité sont ceux durant lesquels le type de régulation est modifié : on peut proposer comme cause des moindres performances de survie, la métamorphose physiologique affectant le métabolisme hydrominéral. Des travaux en cours, concernant les modifications des mécanismes de régulation hydrominérale mis en jeu, permettront peut-être d'ètayer cette hypothèse.

Nous avons déjà eu l'occasion de souligner l'importante hétérbgênéité interspécifique de l'ontogénie de rosmorégulation chez les Crustacés [9]. Des convergences physiologiques peuvent cependant être mises en évidence entre des familles éloignées de Décapodes. Le développement post-embryonnaire des Homards (Nephropidae) ne comporte qu'un petit nombre de stades larvaires, assimilables à des mysis (caractérisés par la présence de


222 C. R. Acad. Se. Paris, t. 303, Série III, n° 6,1986

péréiopodes pourvus d'exopodites, lesquels assurent la locomotion); au contraire, parmi les Décapodes, les Penaeidae se signalent par leur éclosion au stade nauplius et le nombre élevé de leurs stades larvaires. Dans les deux cas, la régulation larvaire est cependant de type hyper-osmoconformateur et la métamorphose, conduisant à l'apparition d'une mégalope, se traduit par l'apparition d'un type d'osmorégulation semblable à celui de l'adulte. Ce changement, rapide chez Homarus americanus [9], est évidement plus progressif chez Penaeus japonicus, ce qui est certainement à mettre en relation avec le développement plus graduel chez cette dernière espèce. De telles comparaisons étendues à un plus grand nombre d'espèces permettraient peut-être de dégager, si elles existent, les diverses tendances générales de l'ontogénie de l'osmorégulation chez les Décapodes.

Nous remercions Monsieur G. Le Moullac (équipe Méréa, Ifrémer, Palavas) pour la fourniture des animaux et Monsieur le Professeur J.-P. Trilles pour la lecture critique du manuscrit.

Reçue le 2 juin 1986.

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Laboratoire de Physiologie des Invertébrés,

Université des Sciences et Techniques du Languedoc,

place Eugène-Bataillon, 34060 Montpellier Cedex.


C. R. Acad. Sc. Paris, t. 303, Série III, n°6, 1986 223

PHYSIOLOGIE ANIMALE. — Initiation des gamétogenèses et ecdystéroïdes chez les larves du Doryphore Leplinotarsa decemlineata SAY (Coléoplère, Chrysomelidée). Note de Noëlle Richard-Mercier, Patrick Porcheron et Robert Poulhe, présentée par André Thomas.

Des dosages radio-immunologiques des ecdystéroïdes hêmolymphatiques et gonadiques ont été effectués chez les larves du Doryphore durant les deuxième et troisième stades. Les pics d'ecdystéroïdes hémolymphatiques comparables chez les larves mâles et femelles du deuxième stade, diffèrent beaucoup pendant le troisième stade. Au cours de ces stades les gamétogenèses s'établissent dans les gonades et la morphogenèse des voies génitales mésodermiques est terminée à la fin du troisième stade larvaire. Dans les testicules comme dans les ovaires, trois pics hormonaux sont contemporains de ces événements. Les ecdystéroïdes pourraient être impliqués dans le contrôle des premières étapes des gamétogenèses et dans le développement des voies génitales mésodermiques.

ANIMAL PHYSIOLOGY. — Ecdysteroids and gamelogenesis initiation in Colorado beetle larvae Leptinotarsa decemlineata SAY (Coleoptera, Chrysomelidae).

Ecdysteroids were sludied in haemolymph and gonads of the Colorado potato beetle during the 2nd and 3rd larval instars using radioimmunoassay. Rises in hemolymphatic ecdysteroid litres were similar during the 2nd instar in male and female larvae, but they differed markedly during the 3rd instar. During these two larval instars, fundamenlal processes occur in gonads of both sexes: gonial mitosis, beginning of meiosis and organogenesis of mesodermic gonoducts. In testes as well as in ovaries three hormonal peaks were temporally related with these phenomena. Ecdysteroids might be involved in the control of early steps of gametogenesis and the development of mesodermic genital tracts.

INTRODUCTION. — L'intervention des ecdystéroïdes dans la physiologie de la reproduction des imagos d'insectes a été élucidée essentiellement pour les femelles. En effet, les ovaires imaginaux d'un grand nombre d'insectes synthétisent des ecdystéroïdes qui participent au contrôle de Povogenèse et de l'embryogenèse [1]. Au contraire, la synthèse d'ecdystéroïdes testiculaires n'a été montrée que chez Heliolhis virescens [2]. Chez Gryllus bimaculatus ([3], [4]) et Calliphora vieinia [5] les teneurs gonadiques sont plus élevées dans les testicules que dans les ovaires; en revanche l'hémolymphe des femelles contient davantage de 20-hydroxyecdysone que celle des mâles. La morphogenèse de l'appareil reproducteur et la reproduction dépendraient des ecdystéroïdes [5].

Dans les gonades larvaires, la 20-hydroxyeçdysone stimule les divisions goniales ([6], [7]); par contre les dernières divisions goniales précédant la méiose s'effectuent en présence d'un taux bas d'ecdystéroïdes hémolymphatiques chez Rhodnius prolixus [8], La prophase méiotique a été corrélée avec la formation d'une barrière aux macromolécules entre l'hémolymphe et le testicule; l'établissement de cette barrière est contrôlé par la 20-hydroxyecdysone chez Locusta migratoria [9] et Schistocerca gregaria [10]. La fin de la méiose et la spermiogenèse chez Hyalophora cecropia dépendraient de l'ecdysone et d'un facteur macromoléculaire d'origine hémocytaire ([11], [12]); de même, chez Drosophila hydei [13], la 20-hydroxyecdysone provoque l'augmentation du nombre des cystes contenant des spermatides dans les testicules larvaires. Les ecdystéroïdes paraissent donc impliqués dans la gamétogenèse bien que, selon Durnser [14], l'entrée en prophase méiotique ne nécessite aucune intervention hormonale.

Par contre, chez Panstrongylus megistus [14] une nèurohormone protocérébrale stimulerait directement les mitoses tandis qu'une autre agirait sur la glande de mue, entraînant une sécrétion d'ecdystéroïdes qui permettrait le déclenchement de la méiose.

La chronologie de l'évolution des cellules germinales du Doryphore Leptinotarsa decemlineata a été établie précédemment ([15], [16] et résultats non publiés). Chez ce Coléoptère, mitose et méiose s'établissent au cours de stades larvaires différents dans

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les testicules et les ovaires. Nous avons réalisé des dosages radio-immunologiques des ecdystéroïdes hémolymphatiques et gonadiques lorsque commencent les gamétogenèses.

MATÉRIEL ET MÉTHODES. — Les Doryphores sont élevés dans une enceinte climatique à 25PC en jours longs sous une photophase de 16 h; l'humidité relative est de 80%. Ils sont nourris avec des feuilles de mprelle douce-amère (Solanum dulcamard). Dans ces conditions, le développement larvaire dure 13 jours et comporte quatre stades. Les larves utilisées sont issues d'une même ponte afin de disposer d'une population ayant un développement homogène. Malgré ces précautions, nous avons observé que l'exuviation des larves peut être désynchronisée de plusieurs heures; ces larves ont des poids variables et nous avons choisi des larves ayant des poids voisins.

Pour chacun des trois stades étudiés I, II et III, de 6 à 20 prélèvements ont été effectués dans une même population toutes les 12 h à partir de l'exuviation puis plus fréquemment, toutes les 6 et/ou 3 h. Nous avons rassemblé les échantillons recueillis à partir de cinq larves pour le stade I et de deux larves pour le stade U. Les autres prélèvements réalisés sur des larves du troisième stade ont été analysés pour chaque animal.

L'hémolymphe prélevée au moyen d'une micropipette calibrée est recueillie dans 1 ml de méthanol. Les volumes hémolymphatiques minimaux et maximaux dans lesquels les ecdystéroïdes ont été dosés sont pour le premier stade 2,6 et 5,2 ul, pour le second stade 0,4, 4,3 ul, 1,3 et 14,0 ul pour le troisième stade. Les gonades sont disséquées puis lavées dans du sérum physiologique et conservées dans 1 ml méthanol. Les échantillons gonadiques pèsent 0,016 mg pour le premier stade, 0,12 mg pour le second et 19,72 mg pour le troisième. Les ecdystéroïdes sont extraits à partir de ces échantillons par deux broyages successifs dans 1 ml de méthanol.

Après centrifugation, les extraits méthanoliques sont évaporés à sec et dilués dans un tampon phosphate (0,1 M, pH 7,4) avant leur utilisation dans le dosage radio-immunologique pratiqué dans les conditions précédemment décrites [17]. Dans ce dosage, 20-hydroxyecdysone et ecdysone sont reconnues de la même façon, les autres ecdystéroïdes présentent une réaction croisée plus faible; le minimum d'ecdystéroïdes détectables est de 5 pg [18]. Les courbes de référence sont obtenues en utilisant la 20-hydrpxyecdysone et tous les résultats sont exprimés en picogramme d'équivalent 20-hydroxyecdysone par microlitre d'hémolymphe ou par gonade.

RÉSULTATS. — 1. Larves mâles du deuxième stade (fig. 1). — (a) Ecdystéroïdes hémolymphatiques. — A la fin du premier stade larvaire, la concentration des ecdystéroïdes hémolymphatiques est très faible (10 pg/ul). Elle s'accroît ensuite régulièrement jusqu'à la 6e heure où elle atteint 340 pg/ul. La concentration des ecdystéroïdes chute à la 42e heure pour devenir pratiquement nulle 3 h avant la deuxième exuviation.

(b) Ecdystéroïdes testiculaires. — Les ecdystéroïdes testiculaires, indétectables 6 h avant la première exuviation, sont voisins de 4 pg/gonade à la 24e heure. A ce moment, presque toutes les spermatogonies sont en mitose. Après une légère baisse à la 28e heure, la teneur en ecdystéroïdes atteint 80 pg/gonade à la 36e heure. Ce pic testiculaire, synchrone du pic hémolymphatique correspond à la période où l'on observe les premières prophases méiotiques.

2. Larves mâles du troisième stade (fig. 1). — (a) Ecdystéroïdes hémolymphatiques. — Durant le troisième stade larvaire, quatre pics ecdystéroïdes ont été mis en évidence, à la 6, 36, 54 et 66e heure; ils s'élèvent respectivement à 180, 200, 290 et 140 pg/ul.

(b) Ecdystéroïdes testiculaires. — Le taux des ecdystéroïdes testiculaires varie au cours de ce stade parallèlement aux taux hémolymphatiques au moment des premier et quatrième pics. En revanche, à partir de la 2e heure, l'augmentation très légère qui se poursuit

EXPLICATIONS DE LA PLANCHE

Fig. 1. — Variations du taux des ecdystéroïdes hémolymphatiques (—..—..—) et gonadiques (— — —) chez les larves mâles des deuxième (LII) et troisième (LIII) stades. E, exuviation; n, nombre de larves dont l'hémolymphe et les gonades ont été prélevées. Les barres représentent l'erreur standard.

Fig. 1. — Variations of ecdysteroids levels in haemolymph (—.. — ..—) and in gonads (- - - ) in 2nd and 3rd

instars mqle larvae. E, ecdysis; n, number of larvae whose haemolymph and gonads has been collected. Bars represent standart error.

Fig. 2. — Variations du taux des ecdystéroïdes hémolymphatiques (—.. —. — ) et gonadiques ( ) Chez les

larves femelles des deuxième (LII) et troisième (LIII) stades. E, exuviation; n, nombre de larves dont l'hémolymphe et les gonades ont été prélevées. Les barres représentent l'erreur standard.

Fig. 2. — Variations of ecdysteroids levels in haemolymph (—.—.—) and in gonads ( .) in 2nd and 3rd

instars female larvae. E, ecdysis; n, number of larvae Whose haemolymph and gonade has been collected. Bars represent standart error.


PLANCHE I/PLATE I

NOËLLE RICHARD-MERCIER

Fig. 1

Fig. 2



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jusqu'à la 48e heure est décalée par rapport aux pics hémolymphatiques 2 et 3. Les trois pies présents à la fin du stade sont synchrones de la période de différenciation des spermiductes mésodérmiques. Les autres variations du taux des ecdystéroïdes testiculaires ne peuvent être corrélées avec des étapes importantes de révolution testiculaire.

3. Larves femelles du premier stade (fig. 2). — (a) Ecdystéroïdes hémolymphatiques. — La concentration des ecdystéroïdes hémolymphatiques des larves femelles à la fin du premier stade est semblable à celle des larves mâles, soit environ 10 pg/ul. Elle augmente progressivement dès le début du deuxième stade et atteint 295 pg/ul à la 28e heure. Cette concentration chute brusquement à 10 pg/ul lors de la deuxième exuviation.

(b) Ecdystéroïdes ovariens. — Voisine de zéro à la fin du premier stade, la teneur en ecdystéroïdes des ovaires atteint 25 pg/gonade, 12 h après la deuxième exuviation. Cette teneur décline et devient nulle entre 36 et 42 h. Lorsque la concentration hémolymphatique est basse, à la fin du deuxième stade, 23 pg/gonade ont été décéles dans les ovaires.

4. Larves femelles du troisième stade (fig. 2). — (a) Ecdystéroïdes hémolymphatiques. — Trois pics d'ecdystéroïdes hémolymphatiques ont été mis en évidence; leurs maximums, situés aux 12e, 54e et 61e heures atteignent respectivement 180, 200 et 190 pg/ul.

(b) Ecdystéroïdes ovariens. — Le petit pic contemporain de la deuxième exuviation correspond au début de l'activité miotique ovogoniale. La teneur en ecdystéroïdes baisse puis remonte à partir de la 24e heure pour atteindre entre la 36e et la 48e heure 25 pg/gonade. Le taux des ecdystéroïdes ovariens s'élève ensuite à 75 pg/gonade lorsque se différencient les cellules préfolliculaires formant la zone transitoire des ovarioles.

y CONCLUSION. — Pour la première fois, les variations du taux des ecdystéroïdes hémolymphatiques et gonadiques ont été étudiées chez des larves des premiers stades d'insectes, seules les variations de la concentration des ecdystéroïdes circulants des larves mâles et femelles du deuxième stade sont comparables. Par contre, au troisième stade larvaire trois pics ont été détectés chez les femelles, quatre chez les mâles; seuls les deux derniers pies sont synchrones dans les deux sexes. Les maximums de concentration des ecdystéroïdes hémolymphatiques sont comparables chez les larves mâles et femelles. Chez d'autres espèces, les variations cycliques des concentrations d'ecdystéroïdes hémolymphatiques ont été corrélées avec une activité périodique de la production d'ecdystéroïdes par les glandes de mue ([19], [20], [21]).

Chez les larves du Doryphore du troisième stade, les Valeurs que nous avons obtenues sont du même ordre de grandeur que celles déjà publiées [22]. Les courbes de dosages gonadiques indiquent que les variations des taux d'ecdystéroïdes testiculaires sont concomitantes des pics hémolymphatiques dans les testicules; par contre, elles en sont indépendantes dans les ovaires. Nous avons observé un synchronisme entre l'élévation du taux des ecdystéroïdes gonadiques et le début de la phase mitotique goniale. Ces observations sont en accord avec l'étude in vitro chez Locusta migratoria [7] qui montre que l'indice mitotique croît avec la concentration de 20-hydroxyecdysone, Cette hormone induit également des multiplications spermatogoniales chez le Myriapode Lithobius forficatus [23].

Le taux des ecdystéroïdes augmente de 25 fois par rapport au niveau de base, dans les ovaires comme dans les testicules lorsque commencent les prophases méiotiques chez le Doryphore. Ces résultats semblent corroborer ceux acquis chez les femelles de Panstrongylus mègistus [14] dans lesquelles la prophase de méiose se réalise lorsque le taux des ecdystéroïdes hémolymphatiques s'élève; cependant, il n'est pas certain que les fluctuations

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des ecdystéroïdes hémolymphatiques et gonadiques soient parallèles (les dosages ovariens n'ayant pas été réalisés chez Panstrongylus megistus). Néanmoins, des injections multiples d'ecdysone provoquent des divisions de maturation anticipée dans les testicules de Lithobius forficatus [24]. La 20-hydroxyecdysone stimule aussi, chez Tenebrio molitor, la synthèse de protéines testiculaires dont certaines seraient impliquées dans la production des spermatocytes II et des spermatozoïdes [24]. De plus, chez le Lépidoptère Diatraea grandiosella [25] en diapause, ainsi que chez Rhodnius en période de repos, l'injection d'ecdysone provoque la reprise de la méiose et la spermatogenèse [8].

L'évolution des cellules germinales semble donc dépendre des ecdystéroïdes; il en est de même pour les gonoductes. En effet, à la fin du troisième stade larvaire, nous avons mis en évidence un pic d'ecdystéroïdes dans les testicules et dans les ovaires du Doryphore. Ce pic se situe durant la période de morphogenèse des voies génitales mèsodermiques [16]. Les ecdystéroïdes stimuleraient chez cet insecte les mitoses des cellules des gonoductes. La morphogenèse des voies génitales serait également contrôlée par les ecdystéroïdes chez les nymphes de Tenebrio molitor car ils augmentent in vitro des mitoses dans la zone transitoire des ovarioles [26] comme celles des glandes accessoires mâles [27], Les ecdystéroïdes auraient chez le Doryphore un rôle important, dans la différenciation des voies génitales et dans la gamétogenèse. Reçue le 17 mars 1986, acceptée le 26 mai 1986.

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Laboratoire Sexualité et Reproduction des Invertébrés, Bât. A, U.A. n" 040678,

Université Pierre-et-Marie-Curie, 4, place Jussieu, 75230 Paris Cedex 05;

Laboratoire Activation cellulaire, communication chimique, U.A. n° 040681,

Université Pierre-et-Marie-Curie, 105, boulevard Raspail, 75006 Paris.


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PHYSIOLOGIE CELLULAIRE ANIMALE. — Comportement des protéines contractiles de fibres musculaires de rats soumis à la microgravité. Note de Xavier Holy, Victor Oganov, Yvonne Mounier et S. Skuratova, présentée par Pierre Buser.

L'effet de la microgravité a été étudié sur trois muscles de rats après les vols biocosmos 1514 et 1667 : le gastroenémien latéral, le plantaris et le diaphragme. Les résultats montrent une diminution de l'activité mécanique maximale sur le gastroenémien et le plantaris. Aucun effet n'est Observé sur le diaphragme. La vitesse de création des ponts entre l'actine et la myosine est diminuée sur les muscles gastroenémien et plantaris. De plus, l'affinité calcique des protéines contractiles est diminuée sur le muscle gastroenémien.

ANIMAL CELLULAR PHYSIOLOGY. - Contractile protein behaviour of rat muscle fibres in microgravity conditions.

Microgravity effects were studied on three muscles: gastroenemius lateralis, plantaris and diaphragm, after the biocosmos 1514 and 1667 space flights. Results showed a decrease of maximal mechanical. activity on both gastroenemius and plantaris while no modification was observed on diaphragm. Cross-bridge cycling speed was reduced on both gastroenemius and plantaris. Moreover, a reduced calcium binding affinity appeared in gastroenemius.

Nos activités de mouvement, de déplacement spatial ou de maintien de la posture se font dans le champ de gravité appartenant au système newtonien. L'expérience des vols spatiaux habités, les données recueillies à partir d'animaux embarqués dans des biosatellites, permettent de décrire des changements importants dans l'état du système musculosquelettique. En effet, de façon très nette pour les muscles des jambes mais également pour les muscles du thorax, on note une perte de masse musculaire, une diminution du tonus et de la force musculaires, une diminution enfin de la tolérance à la fatigue ([1], [2]). Après les vols Soyuz et Salyut on a également pu mesurer sur les muscles soleus de rats des diminutions de la longueur et du diamètre des fibres musculaires.

La microgravité conduit à une atrophie musculaire dite fonctionnelle dans la mesure où elle correspond à une inutilisation de certains muscles en condition d'impesanteur. Une telle atrophie a également été observée sur des muscles dénervés, des muscles à tendon sectionné, dans le cas de myopathies et enfin sur des muscles de sujets sains ayant subi une longue immobilisation ([3]-[6]). Dans toutes ces situations, les auteurs décrivent des modifications des mécanismes biochimiques et physiologiques.

Nous étudierons ici l'effet de la microgravité sur les propriétés contractiles de différents muscles de rats soumis à un vol spatial de 5 jours (vol biocosmos 1514, U.R.S.S., décembre 1983), ou 7 jours (vol biocosmos 1667, U.R.S.S., juillet 1985).

TECHNIQUE. '— Les expériences sont réalisées à la température ambiante ( + 19°C) sur trois muscles de rattes. Deux des muscles sont impliqués dans la posture et considérés comme des muscles antigravitationnels: le gastroenémien latéral et le plantaris ([7], [8]) (vol biocosmos 1514). Le troisième muscle est le diaphragpe supposé non influencé par la microgravité (vol biocosmos 1514 et 1667).

Le protocole expérimental porte sur trois lots d'animaux: (1) des rattes dites «Vivarium» (V) servant d'animaux témoins laissés sans contrainte au sol; (ii) des rattes dites « Synchrone » (S) qui ont reçu au sol une simulation complète du vol (bruit, lumière, nourriture, vibrations, accélération du décollage, choc d'atterissage...) et qui sont utilisées dans le but de contrôler les effets propres du stress; (iii) des rattes dites « Vol » (F) ayant subi l'influence de la microgravité et sur lesquelles nous recueillerons les résultats propres au vol associés aux effets dus au stress.

La technique utilisée pour contrôler le fonctionnement des protéines contractiles est basée sur l'enregistrement des tensions isométriques de fibres pelées [9] à l'aide d'un capteur de force « BGlOj 211 » (Kulite Semiconductor products, Inc. Ridgefield, U.S.A.). Pour comparer les résultats obtenus sur différentes fibres, les tensions sont exprimées par unité de surface de fibre. Les diamètres des fibres sont mesurés lors de chaque expérimentation. Ils sont compris, pour le muscle gastroenémien entre 75 et 85 um, pour le muscle plantaris

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entre 56 et 75 uni, pour le muscle diaphragme enfin, entre 50 et 55 um. Au repos, les longueurs des sarcomères pour ces différents muscles sont comprises entre 2,13 et 2,71 um [10]. Pour toutes les expérimentations les fibres sont étirées à 120% de leur longueur de repos. Les comparaisons des mesures de tension sont estimées par le test de Student.

La solution de base qui permet le relâchement des fibres après chaque contraction est la solution dite « R » : 5 mMK2EGTA (EGTA : Ethylene glycol bis ((3-amino ethyl ether) N,N'-tetraacetic Acid), 2,5 mM acétate de magnésium, 170 mM propionate de potassium, 10 mM MOPS (3-[morpholino] propane sulfonic Acid), 2_,5 mM ATP. Les solutions contenant différentes concentrations en calcium libre (solutions de différentes pCa; pCa=—log[Ca++]) permettent de déclencher les contractions. Ces solutions sont confectionnées à l'aide de tous les composants de la solution R auxquels est ajouté du Ca-EGTA. La concentration finale en EGTA est de 5 mM et la valeur de la pCa est déterminée par les concentrations relatives de CaEGTA et K2EGTA. Les concentrations de tous les composants d'une solution pCa donnée sont calculées selon le programme 3 de Fabiato et Fabiato [11]. Avant chaque application d'une solution de pCa donnée, la fibre est lavée par une solution « W » (solution R sans EGTA). Le pH de toutes les solutions est ajusté à 7,00 + 0,02 à l'aide d'acide propionique ou de KOH.

RÉSULTATS. — 1. Amplitude et cinétique des tensions développées par les muscles. — La force maximale est mesurée par l'amplitude des contractions provoquées par 0,3 mM CaCl2 (pCa : 3,52) quantité de calcium largement suffisante pour saturer tous les sites des protéines contractiles.

Sur le muscle gastroenémien, les tensions maximales mesurées sur les animaux S et V ne diffèrent pas significativement alors que le vol induit une nette diminution sur toutes les fibres éprouvées (fig. 1). Les valeurs moyennes (+ESM, erreur standard de la moyenne), sont respectivement de 1,70+0,22 kg/cm 2 (n=7) et 1,61+0,26 kg/cm 2 (n=8) pour les animaux Synchrone et Vivarium. La diminution après le vol est significative (p<0,01) et la tension maximale devient alors égale à 1,13+0,41 kg/cm 2 (n = 14) (fig. 2, partie gauche).

EXPLICATIONS DE LA PLANCHE

Fig. 1. — Tensions maximales enregistrées sur le muscle gastroenémien après application d'une solution de pCa 3,52 sur les animaux Vivarium (V), Synchrone (S) et Vol (F). Le relâchement de la tension est produit par la solution R. Les déflections rapides correspondent à des artefacts d'enregistrement au moment de l'application des solutions indiqué également par les flèches.

Fig. 1. — Maximal tensions recorded on gastroenemius muscle after application of a pCA 3.52 solution on vivarium (V), synchronous (S) and flighi (F) animais. Tensions are relaxeà by the application of the R solution. Fast transient déflections are recording artefacts due to the application of solutions also mentionned on the records by arrows.

Fig. 2. — Histogrammes des valeurs des tensions maximales (m + ESM) pour les muscles gastroenémien, plantaris et diaphragme sur les trois types d'animaux Vivarium (V), Synchrone (S) et Vol (F).

Fig. 2. — Histogram of maximal tensions (m + SEM) on gastroenemius, plantaris and diaphragm muscles for vivarium (V), synchronous (S) and flight (F) animais.

Fig. 3. — Enregistrements des tensions produites sur le muscle gastroenémien par une solution de pCa 6,00 pour les trois types d'animaux, V, S, F. Les artefacts de tracés et les flèches indiquent l'application et le retrait des solutions comme à la figure 1.

Fig. 3. — Records of calcium-activated tensions for a pCa 6.00 solution on V, S, F animais. The recording artefacts and arrows show the application and withdrawal ofthe solutions as described in Figure 1.

Fig. 4. — Relations entre les tensions (exprimées en % de la tension maximale) et les variations de la concentration calcique (pCa) sur les muscles gastroenémien (à gauche) et plantaris (à droite) pour les animaux Vivarium (V, triangle), Synchrone (S, cercle) et Vol (F, étoile).

Fig. 4. — Relative tension-pCa relationship on gastroenemius (on the left) and plantaris (on the right) muscles for vivarium (V, triangle), synchronous (S, filled circles) and flight (F, stars) rats.


PLANCHE I/PLATE I

XAVIER HOLY



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Les résultats obtenus sur le muscle plantaris (fig. 2, au centre) sont similaires à ceux décrits pour le muscle gastroenémien. Les valeurs des tensions maximales sont respectivement de 1,85 + 0,32 kg/cm 2 (n=6) et 1,49+0,07 kg/cm 2 (n=8) pour les animaux Vivarium et Synchrone (différence non significative). Elle chute significativement à 0,95+0,17 kg/cm 2 (n=10) pour les animaux Vol (F).

La figuré 2 (partie droite) donne l'histogramme des tensions maximales obtenues sur le muscle diaphragme lors du vol biocosmos 1667. Les valeurs sont égales à 146+0,18 kg/cm 2 (n=7), 0,94±0,12 kg/cm 2 (n = 9) et 1,06±0,19 kg/cm 2 (n=7) pour les animaux V, S et F respectivement. Les différences ne sont pas significatives,

Pour présenter de façon claire les changements de cinétique observés nous donnons ici (fig. 3) les enregistrements à pCa 6,00 (qui ne déclenche pas la contraction maximale) sur les trois types de rattes V, S, F pour le muscle gastroenémien. Les vitesses de mise sous tension sont en effet d'autant plus rapides et donc, moins facilement mesurables, que la solution appliquée pour déclencher la contraction a une pCa plus faible. La vitesse de mise sous tension est nettement accélérée pour les rattes S alors que le vol provoque un ralentissement. Ce dernier résultat est également observé sur le muscle plantaris et, pour les deux muscles, à toutes les valeurs de pCa appliquée. 2. Affinité calcique des protéines contractiles. — L'affinité calcique des protéines contractiles est éprouvée par les relations entre l'amplitude de la force (exprimée en % de la force maximale) et la concentration en calcium libre dans le myoplasme (fig. 4). Les courbes présentent un décours sigmoïde classique. Pour le muscle gastroenémien (fig,.4, partie gauche), la courbe S (rattes Synchrone) est déplacée significativement (p<0,02) le long de l'axe des abeisses de 0,2 unité vers les pCa plus fortes tandis que l'effet du vol ramène cette courbe à une position voisine de celle obtenue pour les animaux Vivarium, Ainsi, les pCa 50 (1) sont égales à 6,06 pour les animaux Vivarium, 6,10 pour les animaux Vol (F) et 6,26 pour les animaux Synchrone. Sur le muscle plantaris par contre (fig. 4, partie droite), les résultats ne diffèrent pas significativement et la pCa50 est égale à 6,28. Indépendamment de la variation due aux conditions V, S, F,et que nous allons discuter ensuite, signalons que les valeurs obtenues se situent dans la gamme de celles proposées par différents auteurs, les valeurs étant comprises entre 5,4 et .6,7, avec une moyenne voisine de 6 sur d'autres fibres musculaires squélettiques pelées (pCa 5,9 : [12], pCa 6,05 : [13]).

CONCLUSION. — L'ensemble de nos résultats met en évidence, sur deux muscles antigravitationnels, une diminution de la force musculaire après le vol. Ce résultat peut tout d'abord être déduit de la comparaison entre les mesures de forces effectuées sur les animaux V, S. et F. Il apparaît en effet une diminution de la force maximale des muscles gastroenémien et plantaris après le vol, ce qui permet de conclure à un effet inotrope négatif net de la microgravité, les conditions de stress des animaux n'ayant pas d'influence sur l'amplitude de la tension maximale. Cette conclusion est également étayée par la comparaison des résultats obtenus d'une part sur les muscles gastroenémien et plantaris et d'autre part sur le muscle diaphragme. En effet, sur le diaphragme, supposé non influencé par la microgravité, aucune différence significative n'est relevée entre les animaux Synchrone et Vol.

De plus, sur le muscle gastroenémien, il a été possible de mettre en évidence une variation de la relation Tension/pCa pour les animaux Synchrone et Vol. La courbe est déplacée vers des pCa plus faibles pour les animaux Vol. La position d'une telle courbe est généralement interprétée comme le reflet des caractéristiques de la fixation du Ca sur


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la troponine C (TnC) [14] et également reliée à la cinétique et à la durée du mouvement cyclique des ponts actine-myosine [15]. A la lumière de ces résultats, le déplacement de la courbe vers des pCa plus faibles après le vol peut suggérer une diminution de l'affinité calcique de la troponine C. Il peut également être envisagé une diminution de la durée d'existence des ponts actine-myosine dans la configuration attachée ainsi qu'un ralentissement de la cinétique de formation des ponts actine-myosine. Cette dernière interprétation est d'ailleurs étayée par le net ralentissement des vitesses de mise sous tension observées sur les animaux Vol, aussi bien pour le muscle gastroenémien que pour le muscle plantaris. Le fait que nous n'ayons pas retrouvé sur le muscle plantaris tous les résultats obtenus sur le muscle gastroenémien pourrait être interprété par la différence initiale de composition relative en fibres lentes et rapides de ces deux muscles ainsi que par leurs rôles respectifs dans le maintien de la posture et le mouvement. Enfin, la courte durée du vol spatial pourrait être elle-même un facteur limitant pour l'ensemble des modifications musculaires.

Travail réalisé grâce à l'appui financier du Centre national d'Études spatiales (contrats C.N.E.S. n° 524 et 580).

(1) pCa50 : pCa pour laquelle la contraction est à demimaximale c'est-à-dire pour laquelle 50% des sites de la troponine sont saturés.

Reçue le 26 mai 1986.

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X. H. et Y. M. : Laboratoire de Physiologie des Structures contractiles,

U.A.-C.N.R.S. n° 308, Université des Sciences et Techniques de Lille, 59655 Villeneuve-d'Ascq Cedex;

V. O. et S. S. : Institut des Problèmes médico-biologiques, Khoroshevskoje Shosse 76e, 123007 Moscou, U.R.S.S.


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NEUROPHYSIOLOGIE. - Persistance d'un rythme cireddien de la déhydroépiandrostérone dans le cerveau, mais non dans le plasma, de rats castrés et mrrénaleciomisés. Note de Paul Robel, Monique Synguelakis, Franz Halfoerg et Étienne-Émîle Baulieu, présentée par Étienne-Émile Baulieu, Membre de l'Académie.

L'ablation des glandes endocrines stéroïdogènes (surrénale et testicule) entraîne un effondrement du taux de la côrticosterône [B] plasmatique et cérébrale et l'abolition de ses variations circadiennes, ainsi que de celles de la déhydroépiandrostérone [D] plasmatique. Par contre l'analyse par la méthode du cosinor des résultats concernant la D cérébrale démontre la persistance d'un rythme circadien.

NEUROPHYSIOLOGY.— Persisting circadian rhythm of dehydroepiandrosterone in brain, but not plasma, of adrehalectomized and orchidectomized rats.

In adrenalectomized and orchidectomized rats, the removal of the steroidogenic endocrine glands is associated witha near-disppearance of corticosterone (B) from plasma, and brain; circadian variations of B and of plasma dehydroepiandrosterone (D), characteristic of the intact rat, are no more detected. By contrast, analyses of brain D measurements by the cosinor method demonstrate a persisting circadian rhythm of large amplitude.

La concentration cérébrale et plasmatique de la corticostérone et de son ester sulfate (collectivement désignés comme B) et celle de la déhydroépiandrostérone et de son ester sulfate (collectivement désignés comme D) sont caractérisées par une rythmicité circadienne [1]. Robel et Baulieu ont démontré l'indépendance partielle de la concentration de D (et de son précurseur biosynthétique, la prégnénolone P), par rapport à la sécrétion surrénâlienne [2].T1 a paru intéressant de vérifier ce concept qui suggère un rôle spécifique dans l'accumulation de « neurostéroïdes » par le cerveau, en procédant à l'ablation des glandes stéroïdogènes périphériques (surrénale et testicule), afin de vérifier si les variations rythmiques des stéroïdes cérébraux et plasmatiques persistent après l'opération.

MATÉRIEL ET MÉTHODES. — Des groupes de rats mâles de souche Sprague-Dawley âgés de 11 à 12 semaines ont été maintenus, pendant au moins 12 jours, six par cage (de 40 x 30 x 30 cm), dans un local éclairé de 8 h à 20 h. La moitié des groupes avaient au préalable subi une castration et une surrénalectomie, au contraire des animaux témoins. Quinze jours après l'opération, six rats opérés et six témoins ont été sacrifiés 2, 5, 10, 13, et 16 h après le début de l'éclairernent. Les stéroïdes du plasma et du cerveau ont été soumis à une technique combinée d'extraction et de solvolyse [3]. Dans ces conditions on mesure la somme du stéroïde conjugué et du stérôïde libéré de son ester-sulfate, sauf dans le cas de la B des animaux témoins où la solvolyse n'a pas été pratiquée. P, D, et B ont été séparées par chromatographie de partage sur une microcolonne de Célite, par une modification de la technique décrite précédemment [3], B étant éluée de la colonne par le benzène. Les fractions contenant P, D et B ont été utilisées pour le dosage radioimmunologique avec des anticorps spécifiques; Les données ainsi obtenues ont été analysées par la méthode du cosinor [4].

RÉSULTATS. — Les mesures effectuées dans le plasma et le cerveau des rats intacts confirment l'existence d'une accumulation cérébrale de P et D et sa prépondérance pendant la période d'obscurité (tableau I) ([1], [3]). La castration et la surrénalectomie provoquent un effondrement des concentrations de B plasmatique et cérébrale, les valeurs résiduelles observées n'étant pas significativement différentes du blanc de la technique. Par contre, l'ablation des glandes endocrines stéroïdogènes n'a pas provoqué la disparition des A5-3(3-hydroxystéroïdes cérébraux.

Les caractéristiques de l'analyse des rythmes des trois stéroïdes étudiés, D, P, et B, sont indiquées dans le tableau II. Leurs variations obéissent à une chronologie circadienne tant dans le plasma que dans le cerveau avec, chez le rat mâle intact (en régime de lumière de 8 h à 20 h alternant avec l'obscurité), des valeurs basses le matin et des valeurs élevées l'après-midi et en Soirée. Chez les rats opérés, il n'existe plus de variation

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TABLEAU I

Corticostérone (B), prégnénolone (P), et déhydroépiandrostérone (D)

dans le plasma et le cerveau de rat.

Corticosterone (B), Pregnenolone (P) and Dehydroepiandrosterone (D)

in the plasma and brain ofrats.

Plasma (ng/ml) Cerveau (ng/g)

H (a) B P D B P D

(a) Rats intacts

2 26,1 (b) 0,58 0,27 9,61 8;76 1,07

±8,7 ±0,20 ±0,13 ±1,65 ±2,15 ±0,38

5 38,8 0,89 0,26 14,85 11,88 2,05

±11,8 ±0,20 ±0,10 ±2,27 ±2,95 ±0,76

10 122,6 1,20 0,49 14,46 22,56 2,20

±26,5 ±0,39 ±0,08 ±2,17 ±4,34 ±0,56

13 132,3 1,70 0,49 23,80 26,73 3,16

±17,5 ±0,43 ±0,09 ±3,57 ±5,24 ±0,98

16 174,5 1,48 0,44 29,81 26,45 3,66

±19,7 ±0,50 ±0,09 ±5,65 ±5,24 ±0,92

(b) Rats castrés et surrénalectomisés O

2 1,38 0,26 0,08 2,01 3,23 0,79

±0,49 ±0,10 ±0,07 ±0,41 ±1,68 ±0,23

5 1,08 0,44 0,14 1,81 4,55 1,06

±0,49 ±0,17 ±0,04 ±0,68 ±1,78 ±0,19

10 1,75 0,26 0,13 1,63 4,53 1,56

±0,48 ±0,17 ±0,05 ±0,42 ±1,04 ±0,85

13 1,23 0,23 0,14 2,26 5,03 1,76

±0,54 ±0,10 ±0,14 ±1,04 ±0,64 ±0,47

16 1,18 0,17 0,14 2,26 3,38 " 1,70

±0,36 ±0,04 ±0,08 ±0,56 ±1,54 ±0,43

(a) La lumière était allumée entre 8 h et 20 h, Les heures indiquent le temps écoulé depuis le début de l'éclairement. (b) Les résultats sont la moyenne de six mesures individuelles, ± écart-type. (b) Les rats ont été sacrifiés 15 jours après l'opération.

(a) The "light-on" span was from 8 am to 8 pm. The indicated time is from the onset of light ("light-on"). (b) The results are expressed as mean ± sd of six individual determinations. (c) The rats were killed 15 days after opération.

circadienne de la B, ni de la D plasmatique, par contre l'analyse des résultats concernant la D cérébrale par la méthode du cosinor démontre la persistance d'un rythme. Une tendance similaire est observée pour la P, mais elle n'atteint pas le seuil de signification statistique.

DISCUSSION. — La périodicité de la secrétion surrénalienne est susceptible de persister après une décérébration suprapontique [5]. Par contre, divers rythmes circadiens disparaissent chez les rongeurs après la surrénalectomie [6], suggérant indirectement l'abolition du rythme circadien des glucocorticostéroïdes en absence de surrénales. Le présent travail indique la quasi disparition de la côrticosterône circulante et cérébrale au cours du nycthémère, 15 jours après la surrénalectomie chez le rat. Cependant, de la prégnénolone et de la déhydroépiandrostérone persistent encore dans le cerveau du rat. Les taux sont quelque peu inférieurs à ceux précédemment rapportés [3], mais ils n'infirment pas la conclusion selon laquelle ils sont largement indépendants de la sécrétion des glandes


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TABLEAU II

Caractéristiques des variations circadiennes de B, P, et D

dans le Cerveau et le plasma de rat.

Characteristics of the circadian variations of B, P and D

in rat brain and plasma.

Amplitude

Rythme (moyenne .... Acrophase

Variable (%)(?) MESOR ± êrreur-type) (o)

Cerveau (ng/g) :

témoins.... B 69<0,001 19,38±1,00 9,05+1,68 -254±8

P . 76<0,001 18,18±0,94 9,16 + 1,64 —211+ 7

D 49<0,001 2,43 + 0,19 1,02±0,34 —234+11

opérés... ...... . B 9 0,27 2,10±0,15 0,40+0,19 -289±36

P 15 0,11 3,78±0,33 1,25+0,34 . 141 + 27

D 37 0,002 1,30±0,11 0,47+0,19. —203 + 17 Plasma (ng/ml) :

témoins B 87<O,001 96,12±4,90 67,57±8,79 -227± 4

P 49<0,001 1,10±0,09 0,49±0,16 - 215 + 12

D 48<0,001 0,37±0,02 0,13±0,04. —191 + 14

y opérés .... B 4 0,56 1,26+0,12 0,23 + 0,12 : —135 ± 53

P 30 0,008 0,24±0,03 0,14±0,05 — 92 + 18

D 3 0,63 0,12+0,02 0,03 + 0,03 -170±72

Chaque détermination a été faite individuellement sur un groupe de six rats mâles adultes, soit intacts, soit castrés et surrénalectomisés. Cosinor individuel. Pour l'acrophase, 360° correspondent à 24 h; 0° = 0 h.

Measurements were performed on each individual of a group of six adult male rats, either intact or operated (orchidectomized and adrenalectomized). Simple cosinor. For acrophase, 360° correspond to 24 h, 0° = 0 h.

stéroïdogènes périphériques. De plus, la persistance d'un rythme circadien de la D cérébrale après surrénalectomie confirme l'existence de mécanismes cérébraux autonomes contrôlant l'accumulation des A5-3p-hydr0xystéroïdes. Il ne s'agit pas nécessairement d'une biosynthèse locale, car une conversion rythmée à partir d'esters d'acides gras et de stéroïdes [7], et/ou la variation circadienne d'une protéine de liaison [8] pourraient aussi expliquer nos résultats. Quoi qu'il en soit, la mise en évidence d'une régulation cérébrale autonome du rythme de la déhydroépiandrostérone est tout à fait compatible avec un rôle direct de ce stéroïde sur le comportement du rat [9].

Les altérations du cycle du cortisol, et un décalage de l'acrophase de DS ont été rapportées chez des malades psychotiques par rapport aux individus normaux [Revue dans (1)]. Bien plus, chez des femmes normales, il existe une relation inverse entre la concentration du sulfate de déhydroépiandrostérone plasmatique et le caractère égocentrique et expansif de la personnalité [10]. Une compréhension des mécanismes qui soustendent la régulation du rythme des A5-3J3-hydroxystéroïdes cérébraux pourrait avoir des implications psychophysiologiques importantes, y compris pour l'espèce humaine.

Reçue le 9 juin 1986.

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P.R., M. S., a E. E. B. : I.N.S.E.R.M. U33, Laboratoire Hormones,

94275 Bicêtre Cedex; F. H. : Chronobiology Laboratories, 5-187 Lyon Laboratories,

University of Minnesota, Minneapolis, 55455, U.S.A.


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PHYSIOLOGIE VÉGÉTA LE. — Étude biochimique d'une dormance rythmique chez le Frêne (Fraxinus excelsior L.) cultivé en conditions contrôlées (12EC jours longs). Note de Paul Bamola, Suzanne Lavarenne, Michel Gendratid et Nicole Jaillut, présentée par

Jean-Louis Bonnemain.

De jeunes plants de. Frênes (Fraxinus excélsior L.) de 2 ans cultivés à 12°C en jour long montrent une croissance rythmique. Deux vagues de croissance sont séparées par un repos de 14 à 16 mois. Durant cette période de dormance, bourgeons apieaux et tissus de l'axe qui leur sont sous-jacents présentent, séparément, une fluctuation rythmique de leurs capacités à utiliser un apport exogène d'adénosine. Ce n'est que lorsque ces deux territoires peuvent, ensemble, le réaliser que la croissance est possible, ta tige devancé les bourgeons dans les processus d'installation et de sortie de dormance.

PLANT PHYSIOLOGY. — Biochemical study of a rhythmical dormance of the ash tree growing in conditionned room (12°C, long days).

Two yearso ld ash trees (Fraxinus excélsior L.) growing at 12°C±1°C with long day exhibit a rythmical growth: The period of rest between two flushes is from fourteen to sixteen months long. . During this period the apical buds and their underlying tissues of the stems exhibit a rhythmical fluctuation of their abilities to utilize a supply of exogenous adenosin (Figs. l,2 and 3).

The stems are unable to synthesize NTP (non adenylic nucleotid) after a five month culture period (Fig. 36). When the stems recoved their possibilities to synthesize NTP the buds have lost this property (Fig. 2c). They have become dormant. An inhibition has progressed from the tissues of the stem to the apical buds. It is when both organs can produce NTP at the same time that growth is possible.

The stems precede the apical buds in the evolution of the dormancy. The influence of cool temperatures and ofwarm temperatures on the dormancy of ligneous plants are discussed.

INTRODUCTION. — Il est connu depuis longtemps que les arbres en conditions non limitantes de croissance ne sont pas capables d'un développement continu. A des températures moyennement élevées, le Frêne, le Châtaignier, le Tilleul, présentent un rythme de croissance que caractérisent de longues périodes d'inactivité apicale entre deux « flushs » parfois supérieures à l'année ([l]-[2]). S'il s'agit là d'espèces communes des zones tempérées, des cas d'arrêts longs existent aussi chez les ligneux tropicaux [3].

C'est récernrnent que ces périodes de repos ont été caractérisées. Ainsi les bourgeons apieaux du Frêne, inactifs pendant 15 mois à 25°C en jour long de 16h et nuit de 8 h ne

Fig. 1. — Aptitude au débourrement de 20 bourgeons apieaux en boutures de noeuds isolés placés à 25°C ( + 1°C) jour long, a, b, c, d: respectivement 2, 5, 7 et 12 mois de culture à 12°C (± 1°C) jour long, Fig. l. — Bursting capacity of twenty ash tree apical buds measuredby the test ofisolated nodes cuttings setted in conditionned roqm at 25°C (±1°G) with long day. a, b, c, d: successivly\2, .5, 1 and 12 months of culture at 12°C (±l°C) with long day.

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sont à aucun moment dormant (soumis à publication aux Comptes rendus). A des températures plus basses, de 5 ou de 12°C, les bourgeons entrent en dormance et en sortent sans qu'aucun facteur du milieu n'ait varié ([4]-[5]). Cette évolution se produit aussi bien en boutures de noeuds isolés, en rameaux entiers isolés et défoliés qu'en plantes entières. L'ensemble de ces observations conduit à penser, en fait, qu'une température a plusieurs sortes d'effets et que selon l'état physiologique initial du bourgeon, l'un ou l'autre de ces effets prédomine [1].

Cette présente Note confirme chez un arbre, le Frêne, les résultats obtenus sur le Noisetier [6]. Elle apporte des données nouvelles qui montrent qu'un développement végétatif dépend tout à la fois des propriétés du bourgeon et de celles des tissus de l'axe qui lui sont sous-jacents. Il apparaît clairement, entre autre, que les possibilités d'évolution d'une nouvelle pousse feuillée résultent d'une régulation entre ces deux territoires illustrée par l'évolution des nucléotides adényliques et non adényliques (ATP, NTP).

MATÉRIEL ET MÉTHODES. — Lorsque la dormance est éliminée dans les conditions naturelles, au début du mois de mars, les jeunes plants de Frênes de 2 ans sont disposés en chambres climatisées à 12°C± 1°C en jours longs (J. L.) de 16 h. L'énergie reçue est de 18000 ergs cm-2.s- 1, et l'humidité relative de 70 %±5 %.

A cette température ils épanouissent une pousse feuillée dont la croissance se termine en 4 semaines. Le développement du bourgeon terminal ne reprend que 14 à 16 mois plus tard. L'acrotorde est totale.

Régulièrement 2, 5, 7, 10 et 12 mois, après leur entrée en chambre climatisée à 12°C les expériences suivantes sont réalisées.

1. Mise en place de boutures de noeuds isolées effeuillées du bourgeon terminal. — Les bourgeons sont observés pendant 30 jours. Il s'agit là d'une méthode biologique classique d'appréciation de la dormance des bourgeons des végétaux ligneux [7], Elle consiste à disposer dans un substrat humide 20 boutures, soit les 7 cm de l'extrémité terminale de la tige. Elles sont placées à 25°C + 1°C en jour long et chaque jour est noté le nombre de bourgeons ayant éventuellement débourré.

2. Dosage des nucléotides adényliques et non adényliques, ATP et NTP, des bourgeons terminaux et des tissus de l'axe sous-jacent à ces bourgeons. — L'analyse concerne d'une part trois bourgeons apicaux et d'autre part trois sections complètes d'axe correspondant à chacun d'entre eux. Elle est répétée trois fois à chaque stade d'arrêt retenu. Les résultats sont figurés sous forme d'histogramme où chacun est la moyenne des neuf mesures effectuées. La dispersion des mesures est figurée sur chaque histogramme (fig, 2-3). Les caractéristiques de cette technique biochimique récente d'appréciation des capacités à croître d'un organe ont fait l'objet de mises au point chez les tubercules de Topinambour [8], les semences de Pommier [9], et les bourgeons du Frêne [11]. Il faut rappeler qu'elle repose sur une évaluation du potentiel énergétique après incubation à 16°C sur eau et sur

EXPLICATIONS DE LA PLANCHE

Fig. 2. — Mesures du « pool » des nucléotides triphosphates de neuf bourgeons apicaux de Frênes (Fraxinus excélsior L.) cultivés à 12°C (±1°C) en jour long, a, b, c, d: respectivement après 2, 5, 7 et 12 mois de culture. Valeurs moyennes en ATP (nucléotides adényliques) et NTP (nucléotides non adényliques) après incubation 12h à 16°C: sur eau; sur adénosine.

Fig. 2. — Measures of nucleotidic triphosphates pool of nine ash tree apical buds (Fraxinus excélsior L.) growing at 25°C (±1°C) with long day. a, b, c d: successivly after 2, 5, 7 and 12 mOnths of culture. Mean measures. of ATP (adenylic nucleotid) and NTP (non adenylic nucleotid) after an incubation during 12hrs. at 16°C: |" on water, on adenosin.

Fig. 3. — Mesures du « pool » des nucléotides triphosphates de neuf sections de tiges sous-jacentes aux bourgeons apieaux de Frênes (Fraxinus excelsior L.) cultivés à 12°C (±1°Q en jour long, a, b, c, d: respectivement après 2, 5, 7 et 12 mois de culture. Valeurs moyennes en ATP (nucléotides adényliques) et NTP (nucléotides non adényliques) après incubation 12h à 16°C: sur eau; sur adénôsine.

Fig. 3. — Measures of nucleotidic-triphosphates pool of nine stem cuttings underlying the apical buds of ash tree (Fraxinus excelsior L.) growing at 12°C (+1°C) with long day. a, b, c, d: successivly after 2, 5, 7 and 12 months of culture. Mean measures of ATP (adenylic nucleotid) and NTP (non adenylic nucleotid) after an incubation during 12 h at 16°C: on water; on adenosin.


PLANCHE I/PLATE I

PAUL BARNOLA

Fig. 1.

Fig. 2.



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adénosine pendant 12 h, du matériel choisi. Les possibilités d'accroître le « pool » énergétique et, notamment, la quantité de NTP synthétisés après apport de l'adénosine, sont considérées comme une aptitude à croître caractéristique d'un état de non dormance.

RÉSULTATS ET DISCUSSION. — Les expériences réalisées après un séjour de 2 mois à 12°C±rC J. L. montrent que les bourgeons apieaux sont aptes à se développer. Ils débourrent en 10 jours, en boutures de noeuds isolés, à 25°C. J. L. (fig. 1 a) et ils augmentent leur capacité à synthétiser les NTP après incubation sur adénosine tout comme les portions d'axe qui leur sont sous-jacentes (fig. 2 a et3 a).

C'est après 5 mois passés à 12°C J. L. que les possibilités de croissance des bourgeons apieaux sont fortement amoindries (fig. l b). En boutures de noeuds isolés et effeuillés, aucune évolution à température élevée n'a pratiquement lieu. Les dosages de nucléotides adényliques et non adényliques révèlent que les bourgeons augmentent encore, mais plus faiblement, leurs aptitudes à synthétiser les NTP après passage sur adénosine (fig. 2b). Par contre, la perte de cette aptitude chez les tissus de l'axe sous-jacent aux bourgeons est plus accentuée (fig. 3 b).

Deux mois donc après leur introduction à 12°C, les bourgeons apieaux du Frêne sont non dormants. Leur incapacité à donner une nouvelle pousse résulte d'une inhibition dont l'origine est foliaire [5]. Après 5 mois de culture, l'inertie qui succède à cet état, se traduit à la fois au niveau de propriétés énergétiques du bourgeon apical et des tissus de Taxe qui lui sont sous-jacents (fig. lb, 2b et 3b). Les tissus de l'axe seraient même certainement plus rapidement touchés que le bourgeon.

A 12°C, l'inhibition foliaire prolongée conduit à un état dormant. Nous avons montré qu'à des températures plus élevées, de l'ordre de 25°C±1°C, cette inhibition n'entraîne à aucun moment une dormance du bourgeon apical [4]. Les temps d'inactivité sont cependant, aux deux températures employées relativement longs et comparables, supérieurs à Tannée. Cette expérience confirme pour la première fois biochimiquement l'efficacité des températures fraîches sur l'installation de la dormance chez les ligneux ([4]-[5]). On peut néanmoins se demander si, ce que nous décrivons avec le Frêne, n'est pas propre à un ligneux de zone tempérée. L'inhibition foliaire longue, en effet, chez Gnetum africanum semble conduire à un état de dormance dans les conditions naturelles chaudes et humides des zones tropicales où il croit [3].

Sept mois après l'entrée à 12°C J. L., si les bourgeons sont tout à fait incapables d'augmenter la synthèse de NTP après apport d'adénosine, les tiges ont retrouvé, elles, la faculté à le faire (fig. 2 c et 3 c). La carence en glucides réalisée en plaçant le bourgeon 5 jours sur un milieu nutritif minéral (solution de Knop diluée 1/2) avant incubation, ne modifie pas les résultats. L'intérêt de cette technique réside dans la confirmation ou non de l'impossibilité de synthèse de NTP par un organe ([8]-[10]). Les. caractéristiques biochimiques décrites se concrétisent en boutures de noeuds isolés par une figure de dormance à 25°C J. L. : pente faible de la courbe de débourrement et incapacité de 50 % des bourgeons à croître (fig. le).

Lorsque le séjour atteint 12 mois la dormance n'existe pas plus au niveau des tissus de l'axe (fig. 3 d) qu'au niveau du bourgeon apical (fig. 2 d). Ces deux ensembles sont à nouveau aptes à synthétiser les NTP après incubation sur adénosine. Les résultats biochimiques concordent avec ceux obtenus en boutures de noeuds isolés à 25°C où tous les bourgeons apieaux débourrent en 10 jours (fig. 1 d). Mais ce n'est que 2 à 4 mois plus tard que la croissance sera effective à 12°C J. L., température qui est très peu favorable au grandissement des bourgeons.

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De cette étude, il faut retenir que :

1. Les températures fraîches (12°C+ 1°C) sont tout aussi actives sur l'entrée en dormance que sur la sorite ([l]-[6]). — Mais il est important de rappeler que la situation des bourgeons dans l'espace, de même que la localisation distale ou proximale des tissus des axes qui leur sont proches (ici le bourgeon apical et l'extrémité distale de la tige) influent sur les aptitudes à la croissance [11]. L'étude biochimique en cours chez de jeunes Châtaigniers appuie très largement ce résultat (publication en préparation).

2. L'état dormant est marqué par deux fluctuations rythmiques au niveau de l'énergétique cellulaire, l'une concernant la tige, l'autre le bourgeon. — De leurs rapports dépend ou non de la croissance du bourgeon apical, le fait original étant la difficulté du bourgeon à évoluer en boutures lorsque l'un des territoires, le tissu de l'axe proche au bourgeon ou le bourgeon lui-même, ne peut augmenter son « pool » énergétique en nucléotides non adényliques. Il faut de plus remarquer que l'évolution des nucléotides dans la portion d'axe sous-jacent au bourgeon terminal concerne un ensemble où le cambium, seul tissu pouvant être le siège de croissance, ne représente qu'une très faible partie. Il est possible d'avancer, par analogie avec les tubercules, que l'évolution des nucléotides n'est pas que la propriété des seuls méristèmes [8].

3. Dans le processus d'installation de la dormance l'inertie de la tige pourrait devancer celle des bourgeons. — Cette situation est aussi celle d'échantillons de Frênes prélevés dans les conditions naturelles [10]. Septembre marque la période d'inertie des tiges et novembre celle des bourgeons. L'installation de la dormance pourrait être caractérisée par une succession de corrélations entre ensembles de plus en plus proches qui se mettrait en place plus ou moins rapidement selon la température.

Reçue le 3 février 1986 acceptée après révision le 2 juin 1986.

RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES

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[11] P. CHAMPAGNAT, S. LAVARENNE et P. BARNOLA, Comptes rendus, 280, série D, 1975, p. 2219-2222.

Université de Clermont-Ferrand, U.E.R. Sciences et Nature,

Groupe de Recherches Biologie et Physiologie végétales,

4, rue Ledru, 63000 Clermont-Ferrand.


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PHYSIOLOGIE VÉGÉTALE. —Méthode d'obtention d'endomycorhizes à vésicules et arbuscules en conditions axéniques. Note de Désiré-Georges Strullu et Corinne Romand, présentée par Paul Qzenda.

Une nouvelle méthode d'obtention ira vitro d'endomycorhizes à vésicules et arbuscules est décrite. Les champignons ont été cultivés à partir de racines de Fraisier. Les mycéliums ont été ré-associés in vitro à plusieurs plantes-hôtes.

PLANT PHYSIOLOGY. — Method for obtaining vesicular-arbuscularmycorrhizae in axenic conditions.

A new method for obtaining in vitro vesicular-qrbuscular mycorrhizae is described. The fungi have been cultivated from mycorrhizal roots of strawberry plants. The mycelia have been reinoculated to several host-plants.

Les Endogonacées, champignons filamenteux appartenant aux Zygomyeètes forment des endomycorhizes à vésicules et arbuscules. Il a été démontré à plusieurs reprises que ce type de mycorhizes joue un rôle important dans la nutrition des plantes [1]. Les mycorhizes à vésicules et arbuscules intéressent tous les végétaux, notamment ceux qui présentent un grand intérêt économique ; Légumineuses (Trèfle, Soja.,.), Solanacées (Pomme de terre, Tomate...), Rosacées (Pommier, Fraisier...), Graminées (Blé. Maïs...), etc.

Contrairement à d'autres symbiotes (comme ceux qui forment des ectomycorhizes ou ceux qui entrent dans la constitution des endomycorhizes des Orchidées) les Endogonacées, responsables des endomycorhizes à vésicules et arbuscules, ne se cultivent in vitro qu'en présence de la plante-hôte [2]. Les méthodes d'obtention d'endomycorhizes à vésicules et arbuscules en conditions axéniques sont nombreuses ([3]-[13]). Toutes les techniques, dérivées de celles de Mosse [3] et [4], sont basées sur l'utilisation de spores désinfectées comme inoculum fongique.

Plusieurs tentatives d'isolement de mycélium à partir de racines non stériles ont été réalisées. Jones [14] et Magrou [15] ont obtenu différents types d'hyphes qui n'ont jamais été ré-associés à des plantes-hôtes. Barrett [16] a isolé, à partir de racines non stériles, des champignons cultivables sur un milieu gélose malté comprenant des extraits de graine

Aspect des mycéliums obtenus.

Aspect, of the mycelia obtained.

Fig. a. — Noter la présence de spores terminales ou intercalaires.

Fig. a. — Note the présence of terminal or intercalar spores.

Fig. 6. — Détails des filaments non cloisonnés et des spores terminales ovoïdes.

Fig. b. — Details of the aseptate hyphae and of the ovoid terminal spores.

0249-6313/86/03030245 $2.00 © Académie des Sciences


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de chanvre; l'auteur a précisé que l'un des champignons forme des mycorhizes à vésicules et arbuscules. Avec les mêmes mycéliums et d'autres obtenus suivant la même technique, Gerdemann [17] n'a pas pu reproduire ces résultats. Une mise au point sur ces recherches a été faite récemment par Hepper [18]. L'utilisation de racines non stériles comme inoculum est classique, mais ce matériel peut héberger des micro-organismes phytopathogènes [19].

Le but de cette Note est de décrire une méthode permettant d'obtenir en conditions axéniques des endomycorhizes à vésicules et arbuscules en utilisant des mycéliums obtenus à partir de racines mycorhizées.

DESCRIPTION DU MATÉRIEL ET MÉTHODES. — De jeunes plants de Fraisier (Fragaria x ananassa Duch.) provenant de stolons récoltés au jardin de l'Université d'Angers et cultivés dans les serres de l'Institut de Biologie et Physiologie végétales, ont été utilisés pour les expériences. Ils ont été infectés par des inoculums de Glomus mosseae (Nicol. et Gerd.), Glomus fasciculatus (Thaxter sensu Gerdemann) et Glomus sp. prélevés dans la nature. Au départ, l'infection mycorhizienne est reconnue par l'existence d'un réseau extramatriciel d'hyphes non cloisonnées, de troncs et de vésicules intercellulaires ainsi que d'arbuscules intracellulaires. Ces données anatomiques sont caractéristiques des endomycorhizes à vésicules et arbuscules [2]. Ces racines mycorhizées sont utilisées pour les études expérimentales.

Méthode d'obtention in vitro des mycéliums. — Des fragments de racines mycorhizées de Fraisier sont lavés, traités aux ultrasons durant 10 mn environ puis divisés en segments de 0,3 à 1 cm de longueur. Ces échantillons sont aseptisés dans l'éthanol à 95 % pendant 2 à 3 mn et rincés à l'eau distillée stérile. Sous hotte stérile, les pièces sont traitées par une solution d'hypochlorite de calcium à 6 % durant 1 à 2 mn puis rincées trois fois à l'eau distillée stérile. Enfin l'aseptie complète est réalisée par un passage dans une solution antibiotique (200 ug.g- 1 streptomycine + 20 g.l- 1 chloramine T) durant 5 à 20 mn suivi d'un rinçage à l'eau stérile. Les temps indiqués peuvent être modifiés en fonction du matériel de départ; ils peuvent, en particulier, être allongés de quelques minutes dans le cas de racines épaisses ou envahies par d'autres micro-organismes. Si les mycorhizes sont initialement aseptiques, il est évident qu'il n'y a pas lieu de les traiter. Les pièces stérilisées sont placées dans des boîtes de Pétri contenant le milieu suivant :

(a) Éléments minéraux de Hepper [18] (Fe modifié) :

Macroéléments :

- KN03 : 3 mM;

- Ca(NOa)2, 4H20 : 8,6 mM;

EXPLICATIONS DE LA PLANCHE

Isolement et ré-association des mycéliums. Production and re-association of the mycelia.

Fig. a. — Aspect des échantillons mis en culture en boîte de Pétri. Une dizaine de fragments racinaires sont ' visibles (flèches). Un échantillon contaminé a été enlevé (cercle). Fig. a. — Aspect of the root pieces layed in a Petri dish. Ten root pieces are visible (arrows). A contaminated

root piece bas been taken off (circle). Fig. b. — Mycorhize de Fraisier en culture. Les hyphes (flèches) prolifèrent à partir des sections de la racine

et se développent en surface et dans la gélose. Fig. b. — Sirawberry mycorrhiza in culture. Hyphae (arrows) are growing from the root sections on the surface

and in the agar médium. Fig. c. — Dispositif permettant la ré-association in vitro des mycéliums obtenus à des racines excisées; exemple

de la ré-association d'un mycélium issu du Fraisier (astérisque) à des racines excisées d'Oignon (O). Noter

que l'inoculum a produit plusieurs spores (flèche). Fig. c. — System allowing the in vitro re-association of the mycelia obtained from the root pieces; example of a

re-association between mycelium issued from sirawberry mycorrhiza (asterisk) and an onion root piece (O). The

inoculum produced several spores (arrow). Fig. d. — Ré-association de mycéliums issus du Fraisier à un plant de la même espèce. Noter la ramification

du mycélium (flèche) avant son entrée en contact et sa pénétration dans la racine. Fig. d. — Re-association between mycelia issued of sirawberry mycorrhiza and a plant of the same species. Note

the mycelium ramification (arrow) before its contact and its penetration into the root. Fig. e. — Anatomie des mycorhizes obtenues. Exemple de la ré-association à la Tomate. Noter la présence de

cellules non infestées (c) et de cellules envahies par des arbuscules (ar). Les troncs fongiques (flèche)

progressent dans les méats et produisent des vésicules intercellulaires (vé). Fig. e. — Analomy of the mycorrhizae obtained. Example of a re-association with a Tomato plant. Note the

presence of non infecled cells (c) and celfs invaled by arbuscules (ar). The fungi truhks (arrow) progress in the

intercellular spaces and produce intercellular vesicles (vé).


PLANCHE I/PLATE I

DÉSIRÉ-GEORGES STRULLU



C. R. Acad. Sc. Paris, t. 303, Série III, n° 6, 1986 249

- MgSO4, 7H2O: 1,5 mM;

- KR2PO4: 0,3 mM;

—FeS04, 7H20: 0,1 mM; - Na2EDTA : 0,1 mM.

Oligoéléments: - MnSO4, 4H2O: 11 uM;

- CuSO4, 5H2O : 0,9 uM;

- ZnSO4, 7H2O : 1 uM;

- H3BO3 : 30 uM;

- (NH4)6MO7O24n 4H2O : 0,028 uM.

(b) Vitamines du groupe B :

- panthothénate de Ca : 2 uM; - biotine : 4. 1O- 3 uM; - acide nicotinique : 8,1 uM; - pyridoxine (B6) : 4,6 uM; - thiamine (B1) : 2,9 uM; - cyanocobalâmine (B12) : 0,3 uM;

(c) Saccharose : 43,8 mM. (d) Gélose: 7g.l- 1.

(e) pH avant autoclavage 7.

On peut disposer de 1 à 30 fragments par boîte de Pétri. Les boîtes contaminées sont détruites; dans certains cas il est possible d'enlever les pièces infectées ou de repiquer les inoculums non contaminés.

Méthode de ré-association in vitro au Fraisier. — Les mycéliums portés par la racine mère ou détachés de celle-ci constituent les inoculums. En boîte de Petri contenant le milieu décrit ci-dessus, les inoculums sont mis au contact de racines de jeunes plants de Fraisier micropropagés. Des synthèses ont aussi été réalisées en fioles d'Erlenméyer contenant le milieu nutritif et de la perlite.

Ré-associàtïon in vitro à d'autres plantes-hôtes. — Les protocoles retenus pour le Fraisier sont utilisés pour des plants ou des racines excisées d'Allium cepa (L.) et de Solanum lycopersicum (Mill)..

Ré-isolement in vitro. D'une part, les racines des plantes mycorhizées in vitro peuvent être prélevées et placées sur le milieu de culture; d'autre part, les racines excisées, infestées et en croissance peuvent être fragmentées et constituer autant d'inoculums nouveaux.

RÉSULTATS. — Obtention des mycéliums. — Après quelques jours de culture, des filaments se développent à partir des sections racinaires. Parfois des hyphes sortent des racines en franchissant' l'épiderme. L'étude anatomique des racines mises en culture montre que les vésicules et les hyphes intercellulaires sont à l'origine des filaments obtenus. La planche, a et b, montre l'émergence des hyphes à partir des racines en culture. Les mycéliums sont représentés dans la figure, a et b. Les mycéliums sont constitués d'hyphes grèles et peu ramifiées formant un réseau lâche. Les filaments principaux sont souvent orientés dans le même sens que la racine; après ramification, les hyphes secondaires ont une orientation variable. Observés en microscopie photonique les filaments sont hyalins. Ils possèdent une structure coenocytique. Des déformations irrégùlières leur confèrent un aspect sineux. Certains isolats produisent des spores (fig. b et pl., c). Elles sont globuleuses, hyalines et mesurent de 20 à 100 um de diamètre. Ces spores apparaissent, terminales ou sùbterminales. Des structures vésiculaires de forme plus allongée ont été observées en position intercalaire (fig. à). Les hyphes aériennes montrent des exsudats sous forme de gouttelettes réfringentes.

Ré-associations. — Les mycéliums obtenus ont été ré-inoculés, in vitro a des plants enracinés de Fraisier ainsi qu'à des racines excisées. La ré-association a aussi été réalisée avec l'Oignon et la Tomate. La planche c montre le dispositif utilisé pour effectuer l'union entre un mycélium porté par une racine de Fraisier et une racine excisée d'Oignon. Il convient de noter que le myçéhum a produit de nombreux filaments et plusieurs spores. La planche d montre le contact entre les hyphes et la racine d'un plant de Fraisier. La


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planche e présente les caractères anatomiques des mycorhizes obtenues dans le cas de la Tomate. Le champignon développe des troncs et des vésicules intercellulaires ainsi que des arbuscules intracellulaires. L'épiderme n'est pas colonisé. Le taux de mycorhization après réinoculation par des hyphes dépourvues de cellules racinaires vivantes est élevé. Les hyphes constituant ces inoculums mesurent de 1 à 5 cm. Elles peuvent survivre durant plusieurs semaines. Le mycélium détaché des vésicules mères est capable de croître à ses deux extrémités. Des expériences en cours permettront de préciser les conditions de réinoculation par ce mycélium.

Ré-isolements. — Des racines mycorhizées en conditions stériles prélevées sur des plants de Fraisier et de Tomate et placées sur le milieu nutritif produisent des hyphes. Le même résultat a été obtenu en utilisant des racines excisées d'Oignon.

CONCLUSION. — La méthode mise au point permet donc d'obtenir des mycéliums à partir de mycorhizes à vésicules et arbuscules. Lorsque la technique est bien maîtrisée, on peut produire en quelques jours plusieurs dizaines de proliférations mycéliennes qu'il convient de réassocier aux plantes-hôtes pour démontrer leur aptitude à former des mycorhizes. Les mycéliums issus d'éléments intraracinaires sont capables de réaliser in vitro des mycorhizes de synthèse offrant les mêmes caractères que les associations de départ. Par ré-isolements et ré-associations successives la technique aboutit à la culture indéfinie d'Endogonacées formant des Endomycorhizes à vésicules et arbuscules.

Ces résultats permettent d'exploiter l'immense gisement naturel que constituent les Endogonacées symbiotiques et d'intégrer les isolats obtenus dans des mycothèques. Nos recherches se poursuivent sur la sélection et la production de masse de souches utilisables en agriculture, notamment dans le cadre des semences artificielles. Reçue le 2 juin 1986.

RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES

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Institut de Biologie et Physiologie végétales des Pays de Loire et Université d'Angers, 49000 Angers.


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PHYSIOLOGIE VÉGÉTALE (AGRONOMIE). — La perte de l'aptitude de la racine tubérisée de Cichorium intybus L. à produire un chicon de qualité s'accompagne de modifications profondes dans son métabolisme. Note de Eugène Jolivet, Sylvie Wuillème-Lefèvre et Vincent Fiala, présentée par Alexis Moyse.

Des racines de chicorée Witloof sont conservées à 1°C pendant 4 ou 7 mois. Après 4 mois, les racines donnent de bons rendements en chicons de qualité alors qu'après 7 mois la production se détériore. L'apport, à ces deux lots de racines, d'alanine, de sérine, de glycolate, ou d'acétate, marqués au 14C sur leur carboxyle, montre que la perte de l'aptitude des racines du deuxième lot à produire des chicons de qualité s'accompagne d'une diminution de la pénétration des molécules dans les tissus, d'un fort ralentissement des réactions de décafboxylation, d'une baisse de l'activité métabolique.

PLANTPHYSIOLOGY (AGRONOMY). — The decrease in; the capacity of Cichorium intybus L. tuberous roots to produce chicons of good quality is accompanied with great metabolic modifications.

Two sets of Witloof chicory roots stored at 1° C were supplied with alanine [1-14C], serine [1-14C], sodium glycolate [1-14C], Sodium acetate [1-14C]. The first set is able to produce after 4 months of cold storage chicons of good quality whereas the second set after 7 months of cold storage only produces chicons of poorer quality.

The resulis showed that the decrease in the capacity of the second set roots to produce chicons of good quality is accompanied with a diminution of these molecules absorption by tissues, an important slowering of decarboxylation reactions, a decrease pf metabolic activity.

INTRODUCTION. — La racine tubérisée de chicorée Witloof (Endive) peut donner par forçage (obscurité, 18°C, 3 semaines) un bourgeon appelé chicon. La production de ce chicon dépend de l'évolution physiologique de la racine qui comprend 3 phases :

— Une phase I; au cours du grossissement (août à novembre) formée de deux périodes : là première où les longueurs du chicon et de Taxe diminuent, correspond à une entrée en dormance; la seconde considérée comme une dormance installée, la longueur de l'axe ne dépassant pas 10 mm pour un chicon de 120-130 mm. Au cours de cette phase, la production de chicons est mauvaise.

— Une phase II dont la durée, pour des racines conservées à 1°C est de 4 à 5 mois. La longueur de l'axe s'accroît et représente alors entre le 1/3 et les 2/5 de celle du chicon qui devient compact. Par analogie avec la formation de germes bouleurs par le tubercule de topinambour [1], on peut considérer que cette phase, où la production de chicons devient bonne, correspond à une dormance partiellement levée.

— Une phase III qui s'installe après une conservation au froid au-delà de 5 mois. Elle se caractérise par un accroissement rapide et excessif de l'axe dont la longueur peut

jàtteindre 80 % de celle du chicon qui perd sa compacité et demeure ouvert. Cette phase peut être considérée comme une prémontaison; la production de chicons devient à nouveau mauvaise.

L'entrée de la racine en phase II peut être repérée par les variations du pouvoir réducteur d'extraits de racines à l'égard du 2,6-dichlorophénol-indophénol [2], ou par les variations d'indices de réfraction d'extraits éthanolique et aqueux [3]. Aucune étude de ce type n'a été entreprise pour comprendre l'entrée en phase III après un séjour prolongé au froid. Alors que le froid, au cours de la phase I, agit comme un traitement de vernalisation, il exerce au cours de la phase II une action retardatrice sur l'évolution de Tétait physiologique de la racine vers un état plus avancé qui est celui observé en phase III et qui peut correspondre à une, entrée en sénescence de la racine [4]. Cette évolution rappelle l'installation du phénomène de l'incubation chez le tubercule de pomme de terre dont là manifestation au niveau de la morphologie et de la croissance des germes est dépendante de l'évolution biochimique des réserves du tubercule, comme l'ont montré

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des greffages d'yeux jeunes sur des tubercules vieux et réciproquement [5j. Chez la racine d'endive, des greffages de bourgeons traités par le froid sur des racines non traitées et réciproquement [6] ont aussi montré que les changements morphogénétiques révélés par le bourgeon sont induits par l'état physiologique de la racine, c'est-à-dire par l'évolution de son métabolisme.

Un problème important est donc de repérer des modifications dans le métabolisme de la racine au cours de son passage de la phase II à la phase III. De telles approches ont surtout concerné le Topinambour où il a été montré que l'aptitude de tubercules bouleurs à édifier à 24°C, à l'obscurité, une pousse longue, sous l'effet d'un traitement par le froid suffisamment long pour éliminer leur dormance, s'accompagne d'une synthèse in situ des RNA [7] et d'une modification durable des régulations du métabolisme des nuclêosides di et triphosphates [8]. Chez la racine d'endive, les études n'ont concerné que les variations des teneurs en nucléotides pyridiniques [9], l'évolution de la composition glucidique [10], la mise en évidence d'un accroissement des fuites facinaires [11]. Le métabolisme des acides organiques et des acides aminés libres devrait être affecté. En raison de leur place dans le schéma métabolique à l'entrée du cycle des acides tricarboxyliques nous avons apporté à des racines en phase II et en phase III, avant et après 8 jours de forçage, les composés suivants : a-alanine, serine, glycolate, acétate, marqués au 14C sur leur carboyle.

MATÉRIEL ET MÉTHODES. — Des racines tubérisées d'endive, hybride F1 Flash(R), obtention I.N.R.A.- C.T.I.F.L., arrachées le 3 novembre 1982, sont conservées à 1°C jusqu'au 28 février 1983 (phase II), jusqu'au 24 mai 1983 (phase III).

Des incorporations (925 kBq) d'alanine [1-14C] (C.E.A.; activité spécifique 1739 MBq/mmole), de serine [1-14C] (C.E.A.; activité spécifique 740 MBq/mmole), de glycolate de sodium [1-14C] (Amersham; activité spécifique 185 MBq/mmole) ou d'acétate de sodium [1-14C] (CE.A.; activité spécifique 2028 MBq/mmole) sont effectuées par des fragments de racines en phase II les 1er et 9 mars 1983, avant forçage et après 8 jours de forçage respectivement, et en phase III les 25 mai et 2 juin 1983, avant forçage et après 8 jours de forçage respectivement.

Les incorporations sont faites sur des lots de 8 racines. A partir d'un lot de 8 racines, il est préparé 8 anneaux de hauteur 20 mm, prélevés dans la zone située entre 10 et 30 mm du collet. Ces anneaux sont découpés verticalement en 8 secteurs à peu près égaux. Un anneau expérimental est reconstitué par prélèvement d'un secteur de chacun des 8 anneaux. Cet anneau (13 à 18 gMF), enserré dans un élastique, est mis dans un cristallisoir, en présence de 5 ml de source aqueuse radioactive (925 kBq), le tout étant placé dans une enceinte en verre (volume 850 ml), à l'obscurité, à 20°C, pendant 24 h. L'enceinte est balayée par de l'air débarrassé de CO2 sous un débit de 300 ml/h; le 14C02 dégagé par les fragments de racines est piégé dans un flacon contenant 50 ml de NaOH 6N.

Après 24 h d'incorporation, les fragments de racines sont rincés à l'eau déionisée, lyophilisés et broyés. Une partie aliquote de la poudre obtenue (1 g MS) est traitée par agitations successives en présence de 100 ml d'éthanol 96° G.L., d'éthanol 80 %, d'éthanol 60 % et d'eau déionisée contenant une résine cationique (Dowex 50 H+). Des mesures de radioactivité par scintillation en milieu liquide sont faites, pour chaque lot, sur des parties aliquotes de la source radioactive non absorbée, de la solution NaOH 6N ayant piégé le 14C02, de l'extrait hydroalcoolique et de l'insoluble.

RÉSULTATS. — Pour des racines conservées 4 mois au froid, toujours en phase II et donnant donc de bons rendements en chicons de qualité, les faits suivants peuvent être mis en évidence (tableau) :

— Bonne absorption de l'alanine, de la serine et de l'acétate. L'absorption du glycolate est plus faible et elle l'est encore plus après forçage.

— Dégagement très important de 14C02 à partir de l'alanine [1-14C], dégagement encore important de 14COz à partir des 3 autres molécules, bien qu'après forçage le dégagement ait baissé.

— Marquage très élevé de l'extrait hydroalcoolique à partir de l'acétate.


PLANCHE 1/PLATE I

EUGÈNE JOLIVET

TABLEAU

Distribution comparée de la radioactivité de l'alanine [l-14C], de la serine [1-14C], du glycolate de sodium [1-14C] ou de l'acétate de sodium [1-14C] apportés, à l'obscurité, à 20°C, pendant 24 h, à des fragments de racines tubérisées de Cichorium intybus L. d'états physiologiques différents.

Lots en phase II, conservés au froid du 3 novembre 1982 au 28 février 1983. AF : avant forçage; F8 : après 8 jours de forçage.

Lots en phase III, conservés au froid du 3 novembre 1982 au 24 mai 1983. AF : avant forçage; F8 : après 8 jours de forçage.

Distribution of alanine [1-14C], serine [1-14C], sodium glycolate [1-14C], sodium acetate [1-14C] radioaclivity furnished in the dark at 20°C during 24 h to Cichorium intybus L. roots pieces differing in their physiological State.

Roots stored at VC from 3rd november 1982 to 28 february 1983. AF: before forcing; F8: after 8 days of forcing.

Roots stored at 1°C from 3rd november 1982 to 24 may 1983. A'F: before forcing; B'8: after 8 days of forcing.

Radioactivités des différentes fractions en % de la radioactivité apportée

Non 14CQ2 Extrait

absorbée dégagé hydro-alcoolique Insoluble Métabolisée

Alanine [1-14C] :

AF. 5,7 62,3 7,4 4,8 74,5

A'F.... . 7,2 39,5 7,6 2,7 49,8

F8. ............ . 5,2 66,7 7,1 2,4 76,2

F'8 9,0 53,5 6,1 .2,4 62,0

Serine [1-14C] :

AF 4,7 37,6 20,1 17,7 75,4

A'F . . . .... 7,6 25,5 23,7 10,5 59,7

F8 ... 5,1 24,1 26,8 15,6 66,5

F'8.. ..... . 8,0 .32,9 24,3 15,7 72,9

Glycolate [1-14C]:

AF . . 8,1 33,4 16,4 24,6 74,4

A'F. ,.......... . 25,1 19,8 18,1 15,0 52,9

F8. .............. . 16,5 27,9 15,4 18,9 62,2

F'8 . . . ...... 34,6 15,9 14,5 16,3 46,7

Acétate [l-14C] :

AF ...... . . ...... 1,6 29,9 50,0 8,8 88,7

A'F. 3,3 22,0 39,5 2,2 63,7

F8.. .. 2,6 21,8 50,7 5,6 78,1

F'8.. . ......... 4,9 19,5 37,8 4,2 61,5



C. R. Acad. Se. Paris, t. 303, Série III, n° 6, 1986 255

— Marquage relativement important de la fraction insoluble à partir de la serine et du glycolate.

— Métabolisâtion très importante du 14C apporté, variant pour les 4 molécules entre 62 et 88 % de la radioactivité apportée. Toutefois, en ce qui concerne la serine, le

gyeotate, l'acétate, la métabolisation, diminue chez les tissus racinaires prélevés après forçage.

Là distribution ainsi observée de la radioactivité chez des racines prélevées en phase II subit de profondes modifications quand les racines, après un séjour au froid de près de 7 mois, atteignent la phase III où la production de chicons devient mauvaise. Dans ces conditions, l'évolution de la racine se traduit par les modifications suivantes.:

- Augmentation du pourcentage de la radioactivité non absorbée. Ce fait traduit une diminution de la pénétration des molécules dans les tissus. Cette diminution est particulièrement forte pour le glycolate.

- Baisse importante du dégagement de 14C02 à partir de l'alanine [1-14C] et du glyçolate, nette diminution du dégagement de 14C02 à partir de la serine [1-14C] et de l'acétâte, mais avant forçage seulement.

- Baisse forte de la radioactivité de l'extrait hydroalcoolique marqué à partir de l'acétate.

— Diminution nette du marquage de la fraction insoluble à partir de la serine et du glycolate, observée uniquement avant forçage.

- Baisse importante de la métabolisation des 4 molécules apportées, à l'exception de celle de la serine après forçage.

DISCUSSION ET GONGLUSIONS. — Le passage de la racine de chicorée Witloof de la phase II où elle est capable de donner un chicon de bonne qualité à la phase III où elle devient inapte à produire un tel chicon s'accompagne de modifications profondes dans son Métabolisme :

- Diminution de la pénétration des molécules dans les tissus, particulièrement importante pour le glycolate. Cette diminution de la perméabilité membranaire dans le sens extérieur - intérieur s'accompagne d'une augmentation de la perméabilité dans le sens

intérieur- comme l'ont montré des mesures de fuites racinaires [11]. Ces observations sont en accord avec le fait que le froid agit au niveau des structures de membranes en altérant leur perméabilité ou la balance ionique et le pH intracellulaire

[12].

— Fort ralentissement des réactions de décarboxylation de l'alanine, de la serine, du glycolate et de l'acétate.

- Baisse de l'activité métabolique, mise en évidence surtout au niveau des extraits hydroalcooliques des racines ayant absorbé de l'acétate et au niveau des fractions insolubles des lots ayant reçu de la serine et du glycolate.

Les modifications de la perméabilité des membranes, le ralentissement des réactions de décarboxylation et la baisse de l'activité métabolique sont apparemment liés et, si l'on considère que la racine d'endive, en cette phase III est sénescente [4], il apparaît alors que ces 3 types de modifications biochimiques pourraient compléter la liste des changements caractérisant l'état du vieillissement des tissus parenchymateux [13]. On sait déjà que la sénescence se caractérise par une perte d'intégrité membranaire et par une évolution vers un état plus oxydé [14] qui se traduit par une peroxydation des lipides des membranes [15].


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Le ralentissement des réactions de décarboxylation en accord avec une telle évolution, pourrait conduire à une formation moindre d'aminés, à partir des acides aminés, au fur et à mesure que s'installe la phase III. Il est connu que la putrescine, la spermidine et la spermine possèdent des propriétés anti-sénescence en raison de leur action antagoniste à l'égard de l'éthylène qui partage avec elles le même précurseur, la s-adénosylméthionine et du fait du rôle important qu'elles exercent dans la stabilisation des membranes à l'égard des changements de perméabilité provoqués par la sénescence [16]. L'entrée naturelle en sénescence serait ainsi le résultat d'une diminution des polyamines endogènes et on comprend alors tout l'intérêt d'orienter les travaux vers l'étude des amines pour mieux comprendre comment s'instaure la détérioration de la production des chicons afin d'en tirer les applications agronomiques appropriées. Reçue le 26 mai 1986.

RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES

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Laboratoire du Métabolisme et de la Nutrition des Plantes, I.N.R.A., route de Saint-Cyr, 78000 Versailles.


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BIOLOGIE MOLÉCULAIRE. — Préparation et caractérisation d'antisera specifiques de différents domaines polypeptidiques correspondant à l'oncogène v-ets du virus aviaire de leucémies aiguës E26. Note de Anne Gegonne, Philippe Pognonec, Dominique Leprince, Dominique Demis, Éric Remaut, Dominique Stehelin et Jacques Ghysdael, présentée par Maurice Tubiana.

Nous avons préparé différents antisera dirigés spécifiquement contre trois domaines polypeptidiques distincts correspondant au gène v-ets du rétrovirus aviaire de leucémies aigues E26. Un antiserum dirigé contre un domaine central de v-ets immunoprécipite dans différentes lignées cellulaires et tissus aviaires normaux une protéine de 54000 daltons qui correspond au produit de traduction du gène c-ets (P54c-ets) et trois protéines de 60000, 62000 et 64000 daltons (P60/64) présentant des homologies de séquences avec P54c-ets. Un antiserum dirigé contre le domaine aminoterminal de v-ets ne précipite ni P54c-ets ni P60/64. La séquence codante initialement baptisée v-ets présente donc une structure complexe incluant plusieurs domaines distincts qui pourraient correspondre à des origines génétiques différentes.

MOLECULAR BIOLOGY. — Preparation and characterization of specifie antisera directed against different polypeptidic domains encoded by the v-ets oncogene of the avian acute leukemia virus E26.

We prepared antisera to three distinct portions of the v-ets oncogene of the avian leukemia virus £26. An antiserum directed against the middle v-ets-encoded domain identifies in different chicken cell lines and normal tissues a c-ets-encoded protein of Mr 54,000 (P54c-ets) and three proteins of Mr 60,000, 62,000 and 64,000 partially related to P54c -ets. Antisera directed against the aminotenninal v-ets-encoded domain failed to precipitate P54c-ets or P60/P64. Thus, the E26 specifie v-ets oncogene displays a complex structure that includes several distinct portions, the genetic origin of which could be different.

INTRODUCTION. — Le rétrovirus E26 induit des leucémies mixtes érythroïde et myéloïde chez le poulet ([l]-[2]). Son génome contient le gène v-myb dérivé du proto-oncogène cellulaire c-myb et une séquence v-ets ([3]-[4]). Cette séquence v-ets présente toutes les caractéristiques d'un oncogene : elle est traduite sous forme d'une protéine de fusion (P135gag-myb-ets) dans les cellules transformées par E26 et possède un équivalent cellulaire (c-ets) conservé phylogénétiquement et transcrit dans différents tissus aviaires sous forme d'au moins trois ARN de 7,5 2,2 et 2,0 kb [3]. Les séquences chromosomiques homologues à v-els sont constituées de deux régions séparées par quelques 40 kbp (fig. 1A). La première région est constituée de deux exons potentiels (notés 1 et 2 sur la figure 1A) qui sont homologues aux 220 premiers nucléotides de v-ets et qui ne paraissent pas être transcrits dans l'ARN 7,5 kb. La deuxième région est constituée de 6 exons (notés a à f, fig. 1A) homologues aux 1 200 nucléotides 3 terminaux de v-ets (Gegonne et coll., en préparation). Nous décrivons ici la synthèse à haut taux dans E. Coli de polypeptides correspondant à trois régions du gène v-ets et la caractérisation d'antisera produits chez le lapin contre ces polypeptides.

MATÉRIELS ET MÉTHODES. — Pour obtenir l'expression de fragments nucléotidiques de l'oncogène v-ets dans E. Coli, nous avons utilisé le plasmide pPLC24 [5]. Celui-ci contient le promoteur PL du bactériophage X et permet la synthèse de protéines de fusion (bpXMS2-ets) composées de 98 acides aminés du gène de la polymérase du pliage MS2 et d'un polypeptide codé par l'ADN étranger inséré au niveau des sites de clivage pour les endonucléases de restriction BamHI et HindIII.

L'expression à haut taux des polypeptides correspondant aux différents plasmides recombinants est obtenue dans une bactérie hôte E. Coli K12 AH1 A trp [6] contenant un prophage X lysogène portant la mutation ts 857 dans le gène cI. Ce gène porte l'information génétique du répresseur spécifique du promoteur PL. Dans les cultures bactériennes maintenues à 28°C, le produit du gène cI est actif et le promoteur PL réprimé; à 42°C le produit du gène cl est inactivé et la transcription à partir du promoteur PL activée.

Les lapins ont été immunisés par injections intradermiques en 10 points tout le long de l'épine dorsale (primo-injection) et par voies sous-cutanées et intra-muscuiaires (injections de rappel). Chaque injection

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correspond à 200 ug des différents polypeptides émulsionnés dans de l'adjuvant de Freund complet (primoinjection) ou dans de l'adjuvant de Freund incomplet (injection de rappel). Les injections de rappel se font à 15 jours d'intervalle. Les sera sont récupérés 10 semaines après le troisième rappel.

RÉSULTATS ET DISCUSSION. — Nous avons préparé trois antisera dirigés contre différentes régions correspondant au gène v-ets du rétrovirus E26 ([3]-[4]) : un sérum dirigé contre 56 acides aminés de la région centrale de v-ets (anti-ets A), un sérum dirigé contre les 83 premiers acides aminés de v-ets (anti-ets B), un sérum dirigé contre les 135 derniers acides aminés de la P135gag-myb-ets. La stratégie utilisée est schématisée dans la figure 1A. Ces trois classes d'antisera immunoprécipitent de manière spécifique la protéine

Fig. 1. — (A) Schéma décrivant les constructions de vecteurs utilisés pour préparer trois antisera spécifiques de différents domaines du gène v-ets du rétrovirus E26. E : EcoRI; H : HindIII; Hp : Hpal; N ; Ndel; P : PstI; R : Rsal; S : Sali; * sites positionnés uniquement dans les séquences myb et ers. (B) Expression des polypeptides v-ets dans E. Coli. Les bactéries contenant les vecteurs recombinants ou le plasmide parental pPLC24 sont maintenues 2 h à 28°C ou à 42°C. Un millilitre de chaque culture est ensuite centrifugé. Le culot est repris dans 100 ul de Tampon Tris-HCl 50 mM pH 6,5; SDS 2,5%; 2-mercaptoéthanol 5%; glycerol 10%; bleu de bromophénol 0,05% puis solubilisé à 100°C. Les polypeptides de fusion sont isolés par électrophorèse en gel de polyacrylamide en présence de 10% de SDS et visualisés par coloration au Bleu de Coomassie : (1) lysat de bactéries contrôle contenant le plasmide pPLC24 parental et cultivées à 28°C ou 42°C, (2) lysat de bactéries utilisées pour l'expression de bpl7MS2-ets à 28°C ou 42°C, (3) lysat de bactéries utilisées pour l'expression de bp20MS2-5ets à 28°C ou 42°C, (4) lysat de bactéries utilisées pour l'expression de bp26MS2-3ets à 28°C ou 42°C.

Fig. 1. — (A) Shematic outline describing the constructions of vectors used to prepare three specifie antisera to different domains of the E26 v-ets oncogene. E: EcoRI; H: HindIII; Hp: Hpal; N: Ndel; P: PstI; R: Rsal; S: Sali; * only the restriction sites in the myb and ets sequences were represented. (B) Expression of v-ets polypeptides in E. Coli. Bacteria containing the recombinant vectors or the plasmid pPLC24 were incubated for 2 hrs, at 28 or 42°C. One milliliter from each culture was centrifuged. The proteins from the pellet were solubilized by boiling in 100 ul of Tris-HCl 50 mM pH 6.5; SDS 2.5%; 2-mercaptoethanol 5%; glycerol 10%; bromophenol Mue 0.05%, separated by electrophoresis in SDS-polyacrylamide gel and visualized by staining with Coomassie brilliant blue. Transformants are as follows: (1) pPLC24, 28°C or 42°C; (2) bp17MS2-ets, 28°C or 42°C; (3) bp20MS2-5etu, 28°C or 42°C; (4) bp26MS2-3ets, 28°C or 42°C.


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P135gag-myb-ets produit de traduction du virus E26 (fig. 2A). Nous avons alors entrepris d'analyser le(s) produit(s) de traduction de gènes cellulaires apparentés au gène v-ets, en cherchant à mettre en évidence des protéines réagissant avec nos antisera dans différentes lignées cellulaires et différents tissus normaux aviaires.

Les sera anti-ets A et C immunoprécipitent de manière spécifique une protéine de poids moléculaire 54 000 daltons et/ou trois protéines de 60 000, 62 000 et 64 000 daltons dans le lysat de différents types de cellules marquées à la L(35S) méthionine. La P54 est particulièrement exprimée dans les thymocytes (fig. 2B, thymus canal 2) et présente de fortes homologies de séquences avec le domaine carboxyterminal de la protéine virale P135gag-myb-ets [7]. Ceci indique que P54c-ets correspond au produit de traduction d'un gène cellulaire c-ets équivalent à la plus grande partie des séquences v-ets. Les protéines P60/P64 sont fortement exprimées dans une lignée de macrophages (fig. 2B macroph canal 2) et ne présentent qu'un domaine commun limité avec P54c-ets et P135gar-myb-ets (données non présentées). Ces trois protéines pourraient résulter de la traduction d'ARN messagers provenant du gène c-ets par un mécanisme d'épissage alterné. Elles pourraient

Fig. 2. — (A) Analyse par immunoprécipitation des cellules transformées par E26. Environ 107 myéloblastes transformés par E26 ont été incubés pendant 1 h en présence de L(35S) méthionine. Après marquage, les cellules sont lavées, lysées et analysées par immunoprécipitation ([8], [9]). Les protéines immunoprécipitées sont séparées par électrophorèse sur gel de polyacrylamide en présence de SDS et visualisées par fluorographie. Les antisera utilisés sont les suivants : (1) antiserum dirigé contre des protéines structurales internes des rétrovirus du poulet; (2) serum anti-ets A; (4) sérum anti-ets B; (6) serum anti-ets C; (3, 5, 7) sera anti-ets A, B et C épuisés contre les polypeptides bactériens correspondants (B) Identification de produits de traduction du ou des gènes cellulaires apparentés au gène v-ets. Une lignée de macrophages et des thymocytes aviaires ont été incubés en présence de L(35S) méthionine et les lysats de ces deux types de cellules sont immunoprécipités par : (1) un sérum anti-ets B; (2) un serum anti-ets A; (3) un serum anti-ets A épuisé contre bpl7MS2-ets; (4) un sérum de lapin non immunisé.

Fig. 2. — (A) Immunoprécipitation analysis of E26 transformed cells. About 107 E26-transformed myeloblasts were labelled for an hour with L (35S) méthionine. After labelling, cells were washed, lysed and immunoprecipitations performed ([8], [9]). Immunoprecipitated proteins were separated by electrophoresis on a SDSpolyacrylamide gel followed by fiuorography. Sera used were as follows: (1) antiserum to avian retroviral structural proteins; (2) anti-ets A serum; (4) anti-ets B serum; (6) anti-ets C serum; (3, 5, 7) anti-ets A-B-C sera blocked by preincubation with an excess of the corresponding bacterially expressed v-ets product. (B) Identification of cellular proteins homologous to v-ets. Macrophage cultures and cell suspensions obtained from chicken thymus were labelled with L(35S) methionine and the lysates of these two types of cells were immunoprecipitated with (1) anti-ets B serum; (2) anti-ets A serum; (3) anti-ets A serum preincubated with an excess of bp17MS2-ets; (4) non immune serum.


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également représenter les produits de traduction d'un (de) gène(s) apparenté(s) mais distinct(s) du gène c-ets.

Le serum anti-ets B dirigé contre les déterminants codés par la région 5 de l'oncogène v-ets ne précipite ni P54c-ets ni les protéines de 60/64000 daltons (fig. 2B canaux 1) et ne semble spécifique d'aucune protéine cellulaire normale dans les différents tissus et cellules éprouvés. De plus, une sonde correspondant à cette région 5' ne détecte pas le transcrit cellulaire majoritaire de 7,5 kb détectable avec une sonde spécifique de la totalité de v-ets dans différentes lignées cellulaires. L'extrémité 5 de v-ets ne peut correspondre à une séquence intronique utilisée pour relier v-ets à v-myb dans E26, car son homologue cellulaire présente une structure classique de gène eucaryote en exons et introns (Gegonne et coll. en préparation; fig. 1). Il est également peu probable qu'elle corresponde à un autre gène dont le transcrit et son produit n'auraient pas été détectés dans les cellules que nous avons étudiées. En effet, la région de l'ADN cellulaire homologué à cette région 5' est en fait retrouvée 40 kbp en amont des séquences homologués aux 1200 nucléotides 3' de v-ets. De plus, ces 40 kbp contiennent des exons cellulaires c-ets qui n'ont pas été retenus par le virus (Gegonne et coll. en préparation). La région 5' de v-ets pourrait donc correspondre à une séquence exonique transcrite dans des ARN minoritaires et non détectés jusqu'ici.

En conclusion il apparait que la séquence v-ets spécifique du génome de E26 ne présente pas une structure simple mais pourrait être constituée d'au moins deux domaines. Les 220 nucléotides correspondant à l'extrémité 5' de cette séquence forment un domaine dont l'expression n'a pas été observée jusqu'ici. Les 1200 nucléotides suivant portent l'information génétique homologue à celle de l'ARN messager codant pour une protéine de 54000 daltons (P54c-ets) fortement exprimée dans les thymocytes. Cette protéine présente des déterminants antigéniques communs avec trois autres protéines cellulaires de 60000, 62000 et 64000 daltons, fortement exprimées dans les macrophages. Reçue le 24 mars 1986, acceptée après révision le 16 juin 1986.

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I.N.S.E.R.M. Unité 186-C.N.R.S., U.A. n° 041160,

Institut Pasteur, 1, rue Calmette, 59019 Lille Cedex;

E. R. : Laboratoire 1 de Biologie moléculaire, Université de Gand, Gand, Belgique.


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BIOLOGIE MARINE. — Sur la présence de bactéries dans la branchie d'un Mollusque Bivalve littoral Spisula subtruncata (Da Costa) (Mactridae). Note de Marc Bouvy, Guy Cahet, Françoise de Billy, Jacques Soyer, Marie-Odile Soyer-Gobillard et Catherine Thiriot-Quiévreux, présentée par Jean-Marie Pérès.

La présence simultanée de deux types de bactéries, localisées dans des bactériocytes à la base des filaments branchiaux, :es décrite par une étude ultrastructurale chez un Bivalve littoral, Spisula subtruncata, caractérisé par son habitat en milieu très oxygéné. Cet exemple d'association et l'accumulation dé molécules organiques dans la masse viscérale laissent supposer des modes de relation bactéries-hôte originaux.

MARINE BIOLQGY. — The presence of bacteria in the gill of the surf clam Spisula subtruncata (Da Costa) (Mollusca Bivalvia Matricae).

The simultaneous presence of two morphologically different types of bacteria, located in bacteriocytes at the base of gill filaments, is described in Spisula subtruncata. This particular association and the accumulation of organic molecules in the visceral mass suggest original relationship.

Les bactéries endosymbiontes chemoautotrophes, décrites chez plusieurs espèces d'Invertébrés marins des sources hydrothermales, contribuent de manière significative à la nutrition de leurs hôtes. En particulier, la présence de poches bactériennes a été observée chez des bivalves Mytilidae de profondeur, ([1], [2], [3]). Une synthèse récente de Jannasch [4] précise les processus bactériens intervenant dans l'écosystème hydrothermal. L'intérêt pour ce type de nutrition [5] a amené le développement de recherches sur des organismes littoraux vivant dans des milieux riches en sulfure ([6] à [14]). Cependant Dando et coll. [15] décrivent l'existence de bactéries chez le Bivalve, Myrtea spinifera, dans un milieu côtier pauvre en sulfures ainsi que Henry et coll. [16] chez Ceratoderma glaucum. La symbiose bactérienne pourrait être assez largement répandue et fournir une partie non négligeable de l'énergie nécessaire à l'hôte [15]. L'examen des branchies de Spisula subtruncata Bivalve Mactridae des sables fins bien calibrés infralittoraux a révélé la présence constante de poches bactériennes de deux types bien distincts. L'objet de cette Note est la signalisation d'un exemple d'association Bactéries-Bivalves en milieu, considéré comme non réducteur et sa description par l'étude ultrastructurale.

MATÉRIEL ET MÉTHODES. — Les exemplaires de Spisula subtruncata ont été obtenus à l'aide d'un microchalut à perche par 15 m de profondeur dans la baie de Banyuls-sur-Mer, et triés sur un tamis de 2 mm de vide de maille. Les branchies des individus étudiés ont été aussitôt disséquées. Pour visualiser les bactéries associées, nous avons effectué tout d'abord des étalements branchiaux colorés au Giemsa ainsi que des colorations par la méthode de Gram. Pour les observations MEB (Hitachi S.520), les branchies ont été préfixées dans une solution de glutaraldéhyde à 3 % dans un mélange de tampon cacodylate 0,2 M (pH 7,2) et de NaCl à 7 %, puis fixées dans le tétroxyde d'osmium à 2 % dans le même tampon. Les échantillons déshydratés dans l'acétone 50, 70, 90 et 100 %, ont été séchés dans un appareil à point critique (Balzers); puis métallisés à l'or (Sputtering EMSCOPE). Pour la préparation des coupes semi-fines (e=l um) et les observations en TEM (Hitachi H-600), les branchies ont été préfixées soit dans le même préfixateur que pour la MEB, soit dans une solution de glutaraldéhyde à 3 % et paraformaldéhyde 1,25% dans un tampon Pipes 0,2 M, pH 7,0 selon M.-O. Soyer [17], puis postfixées dans le tétroxyde d'osmium à 2 % respectivement dans les tampons cacodylate ou Pipes. Les coupes ultra-fines ont été contrastées par l'acétate uranyle et le citrate de plomb, les coupes semi-fines par l'Azur II-bleu de méthylène. La recherche du fer masqué a été réalisée sur coupes semi-fines selon la méthode de Read [18], celle des sulfomucopolysaccharides par la coloration au bleu alcian pH 0,5, selon Lev et Spicer [19].

Pour l'étude de la potentialité chemosynthétique des bactéries, nous avons suivi la biotransformation du bicarbonate marqué au [14C] en matériel organique néoformé. Par l'extraction différentielle selon la méthode de Cuhel et coll. [20] les branchies disséquées ont été rincées à l'eau de mer filtrée sur 0,22 um puis incubées pendant 4, 16 et 24 h à 15°C à l'obscurité dans le bicarbonate marqué [14C] (10 uCi/ml). Des incubations parallèles ont été réalisées sur des animaux in toto.

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RÉSULTATS. — L'examen d'étalements tissulaires d'une partie de la branchie met en évidence des nodules colorés en bleu violacé par le Giemsa dont la taille peut atteindre 30 um (pl. I, fig. 1). L'observation au microscope optique des suspensions cellulaires de tissu branchial montré la présence de deux types de bactéries bacilliformes, groupées en amas bien délimités. La coloration de Gram est négative. En M.E.B., ce n'est qu'après dilacération de la partie apicale des filaments qu'apparaissent ces nodules bactériens affleurant au niveau des jonctions interfilamentaires (pl. I, fig. 2). En coupes semi-fines, les nodules apparaissent généralement répartis dans la partie postérieure non ciliée de l'épithélium branchial et déjà, à faible grossissement, la microscopie optique révèle deux types de poches bactériennes (pl. I, fig. 3, 4). A leur proximité on rencontre très régulièrement des accumulations de granules (jusqu'à 8-10 um), de couleur rosée, après coloration à l'Azur II-bleu de méthylène (pi. I, fig. 4). La réaction cytochimique de mise en évidence du fer selon Read [18] s'est avérée négative. La coloration métachromatique à l'Azur II-bleu de méthylène a révélé la nature mucopolysaccharidique acide de ces granules; la réaction positive au bleu alcian pH 0,5 a montré leur appartenance aux mucopolysaccharides sulfatés. Les observations en M.E.T. confirment la présence de bactéries intracellulaires dans la partie non ciliée de l'épithéliurn branchial (pl. I, fig. 5), parfois dans le même plan de coupe (pl. I, fig. 6). Les bactéries de type I sont localisées dans des bactériocytes en forme de sphère aplatie pouvant atteindre 30 um et renfermant un grand nombre de bactéries en forme de virgule (plus de 200 dans une même section). Elles ont un diamètre de 0,9 à 1 um sur 2,5 à 3 um de long et sont entourées d'une double membrane (pl. II, fig. 3). Le nucléoïde concentré occupe une zone de 0,5 sur 0,8 um. En coupe, les nucléofilaments apparaissent plus ou moins organisés en arceaux (pl. II, fig. 3) au milieu d'un cytoplasme garni d'abondants ribosomes lui donnant un aspect homogène. Ces bactéries observées souvent en division (pl. II; fig. 3) sont groupées au sein d'une matrice claire, légèrement granuleuse, dans une poche limitée par une

EXPLICATIONS DES PLANCHES

Planche I

Fig. 1. — Étalement du tissu branchial: nodules sombres (flèches) contrastés par le Giemsa (G x 400). Fig. 1. — Squash of gill tissue: Giemsa stained dark nodules (arrows) (Mx400).

Fig. 2. — Fragment de tissu branchial en M.E.B. au niveau des jonctions interfilamentâires (ji): nodules

(flèches) (G x 400). Fig. 2. — SEM view of gill tissue: nodules (arrows) at level of interfilament junctions (ji) (M x 400).

Fig. 3. — Coupe semi-fine de l'épithélium branchial : amas denses (flèches), zone axiale (za) et granulations

sombres (G x 900). Fig. 3. — Semi-thin section of the gill epithelium: dense clusters (arrows) and dark granules in the axial zone

(za)(Mx900).

Fig. 4. — Coupe semi-fine de l'épithélium branchial (détail) : poches bactériennes de type (I et II) et granulations denses (gr) l'épithélium non cilié (ec) : (G x 3 750).

Fig. 4. — Semi-thin section of gill epithelium: bacterial packed assemblages I and II dense granules (gr) ciliated epithelium (M x 3,750),

Fig. 5. — Coupe ultra-fine d'un filament branchial au niveau d'une poche, bactérienne de type I : cellules type

riches en petites mitochondries (flèches),(G x 2500). Fig. 5. — TEM view of an ultra-thin section of a gill filament showing a type I bacterial packed assemblages:

epithelium cells with small mitochondria (arrows) (M x 2,500).

Fig. 6. — Coupe ultra-fine montrant les deux types bactériens (I-II) dans le même plan : granulations denses

(gr) à proximité du type I (G x 5000). Fig. 6. — Two bacterial types (I-II). Ultra-thin section dense granules (gr) close to the type I (M x 5,000).


R ANCHE 1/PLATE I

MARC BOUVY


R ANCHE II/PLATE II


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Planche II

Fig. 1. — Coupe ultra-fine d'un bactériocyte de type I. nucléoïde (nu) membrane (mb). zone cytoplasmique

(cy) noyau en division (N) (G x 4800). Fig. 1. — Ultra-thin section of a type I bacteriocyte. Nucleoid (nu) membrane (mb) cytoplasmic zone (cy)

nucleus in division N (M x 4,800).

Fig. 2. — Bactéries de type I (détail) nucléofilaments (nf) en arceaux (flèche) cytoplasme bactérien (cy. b)

détail d'une double membrane (double flèche) (G x 25000). Fig. 2. — Type I bacteria (detail) nucleofilaments (nf) with arch-shaped pattern double membrane (double arrows)

(M x 25,000).

Fig. 3. — Coupe ultra-fine d'un bactériocyte de type II membrane (mb) cytoplasme granulaire (cy) matrice

(m) bactéries libérés (flèche) (G x 4 200). Fig. 3. — Ultra-thin section of a type II bacteriocyte: membrane (mb) (arrow), granular cytoplasm (cy), matrix

(m) spreading bacteria (arrow) (M x 4,200).

Fig. 4. — Bactéries de type II. Détail nucléoïde en cordon (nu) cytoplasme bactérien (cy. b). double membrane

plissée (flèche) (G x 24000). Fig. 4. — Type II bacteria (detail): string-shaped nucleoid (nu) bacterial cytoplasm (cy.b) double folded

membrane (arrow) (M x 24,000).

simple membrane et occupant presque tout le volume du bactériocyte, repoussant à la périphérie le noyau et les organites cytoplasmiques, mitochondries et granules de petite taille (pl. II, fig. 1). Les bactéries de type II sont localisées dans des bactérioeyes sphériques de 20 à 22 um de diamètre. Les nombreuses bactéries (parfois plus de 200 par coupes), incluses dans une matrice très claire, ont une forme ovoïde, courte, de 0,8 um de diamètre sur 1 um de long (pl. II, fig. 2, 4) avec un nucléoïde très étendu (en cordon) et des nucléofilaments organisés irrégulièrement. Les ribosomes sont abondants. Ces bactéries, souvent en division, sont entourées d'une double membrane (pl. II, fig. 4) et groupées dans une poche limitée par une simple membrane comme dans le type I (pl. II,

fig.).

La biotransformation du bicarbonate marqué au [14C] ne révèle aucune fixation significative de molécules marquées au niveau des branchies (0,9 à 3 % de [14C] par rapport aux témoins) quel que soit le temps d'incubation. Par contre, dans le reste de la masse viscérale, on observe une élaboration importante de composés organiques solubles dans TCA 10 % à chaud (10 à 15 % de [14C] par rapport aux témoins), maximale à 24 h. Aucune élaboration de protéines marquées n'a été notée après 24 h par rapport aux témoins.

DISCUSSION. — La découverte de poches bactériennes dans la branchie de Spisula subtruncata présente un certain nombre d'originalités par rapport à ce qui était précédemment connu sur ces associations chez les Bivalves. Anatomiquement, ce Bivalve possède un système branchial intermédiaire entre les Mytilidae et les Lucinidae. Les palpes labiaux sont bien développés, au contraire des Mytilidae de profondeur et des Lucinidae, ce qui confère à l'espèce une très grande efficacité de sélection des particules [21]. Enfin, les Bivalves chez lesquels ont été décrites des bactéries symbiontes, présentent généralement des atrophies plus ou moins poussées du système digestif ([22], [23], [24]), phénomène non signalé chez les Mactridae. La localisation des poches bactériennes dans la partie postérieure du filament branchial est analogue à celle décrite chez les Bivalves côtiers, [11], [13] et [15]. Cependant, la présence de deux types bien distincts de bactéries, groupées parfois en véritables colonies dans des poches, est tout à fait originale. L'existence de granules à proximité des bactériocytes est à rapprocher de la signalisation des granules ferriques [13], des « sulfide-oxidizing bodies » [11] ou des granules bruns et jaunes [15] chez d'autres Bivalves côtiers. Une première approche cytochimique permet d'envisager


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la présence de radicaux soufrés dans les aminopolysaccharides des granules de Spisula subtruncata, qui pourraient servir de réservoir énergétique aux processus chémosynthétiques. Ceci n'exclut pas des potentialités hétérotrophes parmi les bactéries symbiontes présentes. Les mesures de potentialité chemosynthétique ne révèlent pas de synthèse organique significative dans les branchies, contrairement à ce qui est généralement observé, mais paradoxalement dans la masse viscérale. Cette observation permet d'envisager soit un passage rapide des molécules au niveau des branchies et une élaboration extrabranchiale de molécules organiques, soit l'élaboration de molécules organiques par les bactéries au niveau de la branchie et leur transfert rapide dans la masse viscérale.

Cette nouvelle signalisation de bactéries symbiontes chez une espèce caractéristique de fonds bien oxygénés, Spisula subtruncata semble montrer que ces associations pourraient être largement répandues. La présence simultanée de deux types de bactéries nettement différenciés et l'accumulation de molécules organiques au niveau de la masse viscérale et non au niveau branchial, laissent supposer des modes de relation bactéries-hôte différents. Reçue le 14 avril 1986.

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C. T.-Q. : Station zoologique, Université P.-et-M.-Curie,

U.A. n° 716, 06230 Villefranche-sur-Mer.


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ÉCOLOGIE GÉNÉRALE. — Dynamique de l'organisation écologique d'un paysage rural : Modalités de la désorganisation dans une zone péri-urbairié. Notede Michel Phipps, Jacques Baudry et Françoise Burel, présentée par Georges Millot

L'organisation topo-écologique d'un paysage rural péri-urbain d'Ottawa (Canada) été mesurée à trois périodes (1956, 1965, 1978); deux segments furent distingués en fonction de leur proximité aux noyaux d'urbanisation (UR 2 : proximal et UR 1 : distal). Dans le premier segment (UR2), On constate : (1) une forte diminution de l'organisation pré-existante, suivie de (2) l'émergence d'un nouveau mode d'organisation; ce dernier est caractérisé par le rôle accru des facteurs d'organisation topologique. Dans le second (UR 1), l'ordre topo-écologique s'est accru de manière régulière de 1956 à 1978, témoignant du maintien d'une activité agricole peu perturbée.

GENERAL ECOLOGY. — Dynamics of the ecological organisation of a rural landscape: disorganization modalities in a peri-urban zone.

The topo-ecological organization of a rural landscape in the Ottawa' s urban fringe (Canada), has been measured at three times (1956, 1965, 1978); two segments were considered on the basis of proximity to-urbanization cores (UR2: proximal and UR1: distal). In the first segment (UR2), évidence has been foundof (1) a drastic diminution of the extant organization, followed by (2) the emergence of a new organization; the latter is characterized by the major role of topological factors. In the second one (UR\), measurements show a regular increase in organization from 1956 to 1978, thus attesting that minor distrubances affected agricultural activity.

La conversion de l'utilisation de sols agricoles à d'autres fins que la production alimentaire dans les zones péri-urbaines, est un phénomène dont la gravité est attestée dans plusieurs pays ([1] à [5]). Elle est généralement étudiée sous l'angle de ses facteurs déterminants ([2], [3] et [6]), de la surface et du taux de conversion ([7], [8]) et de la distance maximale à laquelle l'impact se fait sentir ([3], [6]). A cet égard, une distance de l'ordre de la dizaine de kilomètres est souvent mentionnée ([3], [8]). On considère généralement que cette conversion détermine une désorganisation du paysage rural environnant, implicitement associée à l'ensemble de la zone péri-urbaine. Cependant, faute de rattacher l'idée d'organisation à un cadre formel et de recourir à sa mesure, cette dernière remarque risquerait de n'être qu'une métaphore [9].

Dans des travaux antérieurs ([10] à [12]) inspirés de la théorie des systèmes ([13], [14]), nous avons proposé une définition de l'organisation topo-écologique d'un paysage et une méthode pour sa mesure. Sur ces bases, nous étudions maintenant les modalités de la désorganisation d'un paysage rural en fonction de la distance aux noyaux d'urbanisation dans la zone péri-urbaine au Sud de la connurbation d'Ottawa-Nepean-Gloucester en Ontario (Canada).

Dans ce but, nous avons comparé l'évolution de l'organisation écologique de l'espace rural à trois périodes (1956, 1965 et 1978) et dans deux segments, proximal (UR2) et distal (UR 1) par rapport aux noyaux d'urbanisation. Si l'hypothèse d'une association entre conversion et désorganisation est exacte, les mesures devraient montrer une forte désorganisation dans le segment proximal et une désorganisation atténuée dans le segment distal. Cette question est l'objet de cette recherche.

AIRE D'ÉTUDE, DONNÉES EXPÉRIMENTALES ET TRAITEMENT DES DONNÉES. — L'aire d'étude, déjà décrite [12], couvre 27 000 ha au Sud de la ville d'Ottawa (Ontario, Canada). Les données ont été extraites de 3 cartes à l'aide d'une grille d'échantillonnage régulière. Le patron U des systèmes d'utilisation du sol a été relevé aux 3 époques d'après : la carte des Systèmes d'utilisation du sol [15] en 1978; les minutes des cartes de l'Inventaire des Terres du Canada en 1965 et des photographies aériennes en 1956. Une normalisation des systèmes d'utilisation du sol aux trois périodes (tableau), permet une analyse diachronique cohérente. Les descripteurs de l'environnement sont 13 variables pédologiques et physiographiques, extraites des cartes des Sols et Capacité des sols pour l'agriculture [16] et décrites précédemment [12]. Deux variables, calculées selon le modèle de

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gravité [17], permettent de cerner lés effets d'auto-corrélation spatiale dus à l'intensité de l'agriculture et à la pression urbaine.

Les 2 segments sont différenciés en fonction de la distance aux noyaux d'urbanisation de 1978. Dans le segment proximal UR2, tout site se trouve à moins de 1km d'au moins 1 site urbanisé en 1978. Dans le segment distal UR 1, tout site se trouve à plus de 1km de tout site urbanisé en 1978.

La mesure de l'ordre topo-épologique d'un paysage consiste à mesurer la corrélation entre un patron U de l'utilisation de l'espace et. un patron E de l'environnement ([10] à [12]). Cette corrélation définit un ordre topo-écologique et la redondance R(E, U) du canal d'information (E=>U) constitue une mesure de cet ordre. Pour suivre l'évolution de l'organisation du paysage, nous examinerons, pour chaque segment et à chaque époque, 4 mesures informationnelles se rapportant au canal d'information (E=> U) :

H.(U) : entropie a priori du patron U (mesure la diversité spatiale des systèmes d'utilisation du sol);

H.(U/E) : entropie a posteriori du patron U, sachant E (mesurel'ambiguité ou désordre du canal d'information E=U, valeur asymptotique);

R(E, U) : redondance du canal d'information E=>U (mesure l'ordre topo-écologique du paysage, valeur asymptotique);

H(E) : entropie de l'environnement relative à U (mesure la diversité des unités du patron E, définies par combinaison des descripteurs environnementaux déterminant le patron U).

En outre, les changements constatés peuvent être explicités en considérant la spécificité des niches paysagiques des systèmes d'utilisation du sol [12].

RÉSULTATS ET DISCUSSION. — Évolution de l'ordre topo-écologique. — La figure 1 ab oppose d'emblée une dynamique radicale et contradictoire dans le segment proximal UR2, à une dynamique modérée et régulière dans le segment distal UR 1.

Dans le segment proximal UR 2, on note une augmentation rapide de la diversité de l'utilisation du solH(U) de 1956 à 1965; elle traduit un ré-équilibrage des aires affectées aux différents systèmes, notamment la diminution de l'extensif(E) au profit de l'intensif (I). Durant le même temps, la redondance R(E, U) du canal diminue, tandis que l'ambiguité H(U/E) augmente fortement. On observe également un abaissement de H(E), qui révèle une utilisation de moins en moins différenciée de l'environnement. Ces mesures montrent donc clairement que les changements d'utilisation du sol (diversification) ne s'intègrent pas à la structure d'organisation et dégradent celle-ci : il y a donc diminution de l'ordre topo-écologique du paysage. De 1965 à 1978, cette dynamique s'inverse, soulevant un problème d'interprétation : s'agit-il d'un rattrapage du retard pris par le processus d'organisation sur la diversification au cours de la période précédente, ou bien d'une rupture entre deux modes d'organisation : destruction d'un type et émergence d'un autre?

Dans le segment distal UR 1, et pour les mêmes raisons que précédemment, la diversité de l'utilisation du sol H (U) augmente à un rythme régulier de 1956 à 1978. Mais ici, la diversification est parfaitement intégrée dans la structure d'organisation comme en témoigne le fait que la redondance R (E, U) s'accroît à un taux supérieur à celui de l'ambiguïté

EXPLICATIONS DE LA PLANCHE

Fig. 1. — Variation de 19.56 à 1965 et 1978 de quatre mesures 4e l'organisation topo-écologique du paysage rural: (la) segment UR 1 (plus de 1km d'un noyau urbanisé); (le) segment UR2 (moins de lkm d'un noyau urbanisé).

Fig. 1. — Changes from 1956 to 1965 and 1978 of four measures of the topo-ecological order of the rural landscape: (1 a) = segment URl (more than 1 km from any urbàn core); (1b)=segment UR2 (less than 1km from any urban core).

Fig. 2. — Évolution de la spécificité des niches paysagiques pour les 5 systèmes d'utilisation du sol, de 1956 à

1965. et 1978 : (2a) dans le segment UR 1; (2.6.) dans le segment UR 2. Fig. 2. — Changes of the specificity of the landscape niches of the 5 land use Systems, from 1956 to 1965 and

1978: (2a) in segment UR 1; (2b) in segment UR2.


PLANCHET/PLATE I

MICHEL PHIPPS

TABLEAU I

Liste et définition des systèmes d'utilisation du sol distingués,; List and definition of the land use Systems (SUS).

Systèmes Définitions

Intensif.. . . ..... L Système mixte avec proportion importante de

cultures:labourées, en particulier du Maïs Extensif.. ... V E. Système mixte céréales et une proportion importante

importante foin

Pâturage........G La quasi totalité des terres occupées par des

herbages permanents, utilisés directement par les

animaux

Abandon : . . . . . A Terres non boisées où toute activité a cessé

Boisés . . . . . ... . F Terres portant un boisé naturel ou introduit



C R. Acad. Se. Paris, t. 303, Série III, n° 7,1986

267

H(U/E). Dans le même sens, nous constatons un accroissement de H(E), indiquant une adaptation de l'utilisation du sol à des conditions environnementales de plus en plus diverses et subtiles.

La variation de ces 4 mesures démontre donc clairement qu'à l'inverse du segment précédent, il y a accroissement de l'ordre topo-écologique du paysage, contrairement à ce que l'association implicite entre conversion et désorganisation laissait présager.

Évolution de la spécificité des niches paysagiques. — La dynamique de l'organisation du paysage reflète à la fois l'évolution ; des surfaces affectées aux différents systèmes d'utilisation du sol et les modifications des relations entre les systèmes et les variables de l'environnement. Notamment, la spécificité des niches paysagiques des systèmes, une autre grandeur mesurable [12], s'accroît ou diminue, selon que ces relations deviennent plus ou moins strictes.

Dans le segment proximal UR2 ( fig. 2b), les niches de tous les systèmes perdent de leur spécificité entre 1956 et 1965, à l'exception de l'extensif (E); ce système très ubiquiste auparavant, se trouve de plus en plus étroitement confiné dans des situations particulières (ici à potentiel médiocre). De 1965 à 1978, la niche de l'intensif (I) se maintient à son niveau, tandis que celle de l'extensif (E) décroît légèrement; l'abandon (A) poursuit sa décroissance, montrant clairement que l'abandon de l'agriculture tend à apparaître dans un large éventail de situations de moins en moins signifiantes au plan écologique. Seuls les pâturages et les boisés rehaussent leur spécificité et peuvent donc expliquer la réorganisation constatée dans ce segment de 1965 à 1978. En raison des surfaces concernées, celle-ci est surtout due aux boisés (F) dont la niche se définit de plus en plus précisément par la variable d'auto-corrélation. Ceci résulte de ce que les boisés forment des ensembles spatiaux de plus en plus homogènes par reboisement d'espaces interstitiels autrefois cultivés; l'organisation devient plus topologique qu'écologique. On doit donc bien interpréter le graphe de la figure 1 b comme une dégradation de l'ancien type d'organisation et l'émergence d'un nouveau type, plus topologique, lié à des activités non agricoles.

Jusqu'en 1965, la spécificité des niches; évolue parallèlement dans les deux segments UR 2 et UR 1 (fig. 2a, b). A partir de 1965, elle diverge. Dans le segment distal (UR 1), les systèmes à faible capacité de production (extensif E, pâturage G) voient leur niche devenir de plus en plus spécifique, ces systèmes s'adaptant à des conditions étroitement définies et à potentiel marginal. De la même façon et à l'inverse du segment précédent, l'abandon des terres (A) se définit très bien du point de vue environnemental. Il s'agit de terres au potentiel le plus marginal (à textures très fines ou grossières). L'abandon comme le pâturage et Fextensif s'intègrent donc parfaitement à une stratégie agricole et le paysage accroît son organisation. Ces faits rendent donc bien compte de ce que montrait le graphe de la figure la,

CONCLUSION. — L'étude montre que la distance de 1km autour des noyaux d'urbanisation est cruciale pour la dynamique du paysage rural :

(1) En deçà de cette distance (UR 2), les changements d'utilisation du sol entraînent d'abord une dégradation de l'ancienne structure d'organisation puis l'émergence d'une nouvelle structure; cette dernière est clairement topologique et liée au milieu urbain. On peut supposer qu'elle reflète en partie les politiques de planification de la fin des années 1960 recommandant le zonage (agricole, forestier, urbain) et les politiques d'aide au reboisement [18].

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(2) Au-delà de cette distance (UR 1), les changements se font dans une remarquable stabilité de la structure d'organisation; diversité d'utilisation du sol et ordre topoécologique augmentent régulièrement.

Cette distance étant très inférieure à la portée de l'influence péri-urbaine ([3], [6]), on voit que l'association entre cette influence et la désorganisation du paysage rural n'est justifiée qu'à la périphérie immédiate des noyaux d'urbanisation, contrairement à ce qui est généralement admis. Au-delà, mais toujours au sein de la zone péri-urbaine, l'accroissement de l'organisation du paysage témoigne d'une agriculture relativement peu perturbée. Sur le plan pratique, la planification de ces zones devrait utiliser ce phénomène comme de support d'opérations de protection de l'activité agricole.

Sur le plan théorique, Atlan [13] a proposé une mesure de l'organisation dans laquelle il considère l'évolution de l'entropie globale d'un système H (E, U) dont l'augmentation correspond à une phase d'organisation et la diminution à une désorganisation. Dans le cas présent, l'un de nous [19] a montré que H(E, U) et R(E, U) évoluent parallèlement pour les deux segments du paysage. Nos résultats sont donc en accord avec ce point de la théorie des systèmes. On remarquera, cependant, que les entropies des sous-ensembles du système ne font pas nécessairement de même : H (U) augmente dans UR 2 quand R (E, U) diminue. Ici, la variation parallèle de R (E, U) et de H (E, U) est surtout due au fait que R(E, U) et H(E) varient dans le même sens. Ceci montre l'importance, comme critère d'organisation, de l'information environnementale utilisée dans la structure, mesurée par H (E). Reçue le 24 juin 1985, acceptée après révision le 26 mai 1986.

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C. R. Acad. Sc. Paris, t. 303, Série III, n°7, 1986

ÉCOLOGIE GÉNÉRALE. — Observations sur le devenir de l'azoté organique du sol et des résidus racinaires en présence d'une culture de maïs. Note de Jean-Luc Chotte, Jean-Marie Hetier, Gérard Guiraud et Francis Andreux, présentée par Jean Lavollay.

Un sol brun acide doublement marqué 14C15N lors d'une première culture de maïs a servi de support à une seconde culture de maïs. Au cours de celle-ci nous avons observé, d'une part, que les nouvelles racines contiennent davantage de 15N que les parties aériennes et, d'autre part, la présence à leur niveau de 14C.

Trois hypothèses explicatives, qu'il sera utile de vérifier à l'aide de dispositifs culturaux (axéniques ou gnotobiotiques) et de techniques analytiques (autoradiographie et microscopie électronique), sont confrontées : contamination par; contact, biodégradation des résidus et absorption de biomasse marquée (mycorrhizes), absorption sélective et accumulation de composés organiques non identifiés.

GENERAL ECOLOGY. — Organic nitrogen and residual roots transformation in the rhizosphere of maize.

A brown acid soil doubly labelled with I4C and 15N by a first culture of maize, was used as a medium for an other essay of maize. The roots of this plant contained more 15N than the aerial parts, and the presence of 14C was noticed in these roots. Three explahatory hypotheses are discussed: contamination through direct contact; biodegradation of labelled roots and residues, and absorption of microbial biomass (mycorrhizae) in living roots; specifie absorption and acumulation of unidentified organic compounds.

INTRODUCTION. — Les études portant sur la décomposition des racines enfouies et leur contribution à l'élaboration d'un nouveau végétal représentent, contrairement au cas des résidus de récolte ([5], [9], [3]) un domaine encore peu étudié.

Si de nombreux auteurs s'accordent sur le fait qu'en présence d'une culture, la décomposition des racines enfouies est moindre qu'en sol nu, les avis sur les mécanismes divergent.

Pour certains d'entre eux ([4], [10], [7]) la culture n'a qu'une action indirecte sur cette décomposition. Par contre, à l'aide de racines marquées au 14C, Billes et Bottner (1981) [1] ont montré que la présence d'une culture induit aussi, dans une première phase, correspondant à là Croissance des racines, une augmentation de l'incorporation du 14C à la matière organique des sols.

Par ailleurs, avec le même type de matériel, Sparling et coll. (1982) [11], ont mis en évidence la présence de 14C, dans les racines de la nouvelle culture. Cette accumulation de produits organiques serait responsable de la moitié de la baisse du volume de C02 dégagé.

Pour examiner ces mécanismes, nous avons entrepris des cultures de ray-grass et de maïs, en laissant dans le sol les racines doublement marquées au 14C et au 15N provenant d'une culture précédente.

MATÉRIEL ET MÉTHODES. — 1. Le sol et la culture initiaux. — Un sol brun acide, de texture limoneuse (pH 4,5; C/N 10; 10 meq 100 g; saturation en bases 20 %) a servi à une culture de maïs doublement marquée en chambre de végétation [6].

2. La seconde culture de maïs. — La culture de maïs a été conduite jusqu'à maturité. L'ensemble du sol a

été isolé afin de quantifier le 14C02 dégagé durant la culture et empêcher sa photosynthèse par la plante.

3. Analyses. — Le carbone total et le 14C ont été déterminés après combustion, par conductimétrie et

scintillation liquide après combustion sèche : on en déduit leur radio-activité spécifique (R.A.S.). L'azote total

a été déterminé par la méthode Kjeldahl et l'excès isotopique 15N (E %) a été mesuré par spectrométrie de

masse.

Les débris ont été séparés par tamisage sous eau à 200 um.

RÉSULTATS. — 1. Répartition du carbone et de l'azote avant culture (tableau). — A la fin de la première culture de maïs marqué, il ne reste plus d'azote minéral dans le sol et plus de la moitié de l'apport initial d'azote restant dans le sol se localise dans les racines et les débris. L'excès isotopique des racines est le plus élevé; il est d'environ deux fois supérieur à celui des débris.

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TABLEAU

Répartition du carbone et de l'azote avant et après la culture de maïs

(les résultats sont exprimés pour 1000 g de sol sec).

Distribution of carbon and nitrogen, before and after growth of Maize

(results are expressed in weight per 1,000 g of dry soil).

QC R.A.S. Q14C QN E Q15N

(g) (kBq.g-1.C) (kBq) (mg) (%) (mg.10- 3) C/N

Avant culture :

Sol total 16,000 42 672 1700 0,133 2261 9

Fractions :

Racines identifiables 0,327 1636 535 13 6,640 863 25

Débris 0,210 571 120 7 3,840 269 30

Hydrosoluble n.d. n.d. n.d. 75 0,420 315

Sol sans racines ni débris 15,50 1,2 18,6 1566 0,064 1002 10

QC R.A.S. Q14C QN E Q15N

(g) (kBq.g-1.C) (kBq) (mg) (%) (mg.10- 3) C/N

Après culture :

Sol total 15,000 37 555 1600 0,126 2016 9

Fractions :

Nouvelles racines :

- hors sol 0,030 41 1,2 1,1 0,400 4 27

- dans le sol 0,400 752 301 14 3,820 535 29

Débris 0,100 383 38 3 3,470 104 33

Hydrosoluble n.d. n.d. n.d. 6 0,57 34

Sol sans racines ni débris 13,400 2,9 39 1540 0,067 1032 9

C02 respiration 0,800 150 120

Parties aériennes 3,160 0,24 13 72 0,450 324 44

Au terme d'une longue période de conservation (58 mois à 4°C) une quantité importante d'azote nitrique, 75 ug.g- 1 de sol, est apparue dans,la fraction hydrosoluble. Cet azote nitrique possède un excès isotopique nettement supérieur à l'excès isotopique moyen de l'azote du sol débarrassé des racines et des débris (0,42 % au lieu de 0,06 %). De plus, au moment où va commencer la seconde culture de maïs, la majeure partie du carbone 14 (85 %) et près de la moitié de l'azote 15 se trouvent encore dans les racines identifiables comme telles, ou dans les débris figurés.

2. Répartition du carbone et de l'azote après culture de maïs (tableau). — (a) Le carbone. — Les racines et les débris identifiables ne représentent que 3 % du carbone total du sol, mais plus de 90 % de son carbone 14. Les racines développées dans le sol ont une R.A.S. de 752 kBq. g- 1 de C, alors que celles séparées avant culture avaient une R.A.S. de 1636 kBq. g- 1 de C. On a noté qu'une faible fraction des nouvelles racines a crû hors du sol, à l'abri de toute contamination; leur R.A.S. est de 41 kBq. g- 1 de C.

(b) L'azote. — Seulement 1 % de l'azote total, mais plus de 30 % de l'azote 15 du sol de départ sont incorporés dans les nouvelles racines de la seconde culture de maïs. L'excès isotppique de l'azote de ces racines (3,82 %) est voisin de celui de l'azote des débris isolés du sol avant et après la culture (respectivement 3,84 et 3,47 %).


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Par ailleurs, l'azote des racines développées hors du sol possède un excès isotopique proche de celui de l'azote exporté au niveau des parties aériennes (0,42%), cette valeur d'excès isotopique étant très inférieure à celle de l'azote racinaire.

DISCUSSION. CONCLUSION. — L'expérience de la culture d'une graminée sur un sol brun acide de texture moyenne, attire l'attention sur le rôle de la rhizosphère dans la transformation de débris figurés. En effet, les résultats obtenus à l'issue de cette culture, complétés par ceux d'une culture de ray-grass [2], montrent que la teneur en 14C et en 15N des nouvelles racines est supérieure à celle des parties aériennes.

Nous pouvons mettre à profit le fait que les racines qui ont crû hors du contact des anciennes racines et de leurs débris, présentent une valeur d'excès isotopique identique à celle des parties aériennes, pour supposer :

(1) soit la présence de très fins débris invisibles à l'oeil nu et fortement marqués entourant les racines;

(2) soit l'existence de micro-organismes au niveau des structures racinaires : la quantité de 34C présente permet d'estimer que cette microflore contiendrait de 15 à 30% de l'azote du nouvel ensemble racinaire et aurait un C/N compris entre 12 et 23. Il s'agirait de filaments d'endo-mycorrhizes, ayant précédemment consommé les anciennes racines, mélangés aux plus fins débris de cette litière;

(3) si la présence d'endo-mycorrhizes ne pouvait être prouvée par l'observation microscopique, il faudrait envisager une troisième hypothèse, celle de l'absorption importante par les nouvelles racines de molécules organiques azotées, qui ne seraient pas transportées vers les parties aériennes. En culture sur solutions nutritives, il a déjà été constaté ([8], [12]) que des molécules organiques, même complexes (cycles aromatiques) sont absorbées par les racines; une; forte proportion d'entre elles (40 %) entrent dans la constitution des cellules racinaires sans être transportées vers les parties aériennes.

Nos résultats, s'appuyant sur plusieurs séries de mesures, ne donnent aucune indication précise quant à l'origine et à la nature de tels composés. Les racines en cours de croissance paraissent avoir une capacité de fixation de certains composés organiques, produits de la dégradation des racines de la culture précédente par des micro-organismes de la rhizosphère (bactérienne ou fongique). Les racines vivantes exerceraient ainsi un rôle de filtre actif à l'égard de ces substances, qu'il conviendrait d'étudier dans leurs sites de fixation, et dans leurs structures, à l'aide de dispositifs permettant de réaliser des cultures stériles et gnotobioliques, et de techniques analytiques telles que l'autoradiographie et la microscopie électronique.

Bien qu'il s'agisse d'une petite fraction organique, apparemment très stable, son rôle n'est sans doute pas négligeable. Elle représente probablement une forme de passage vers les matières humifiées du sol, soit par la voie de l'héritage soit par la voie microbienne. Reçue le 9 juin 1986.

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C.N.R.S. et Université de Nancy-I, B. P. n° 5,

54501 Vandoeuvre Cedex;

G. G. : Centre d'Études nucléaires de Cadarache,

D.B./S.R.A., 13108 Saint-Paul-lez-Durance Cedex.


C.R. Acad. Sc. Paris, t. 303, Série III, n° 7, 1986 273

PHYSIOLOGIE ANIMALE. — Mise en évidence d'un attractif sexuel produit par les mâles de Nezara) viridula (L.) (Heteroptera: Pentatomidae). Note de Claude Pavis et Christian Malosse, présentée par Constantin Chararas.

Le Comportement locomoteur des adultes et des derniers stades larvaires de la punaise phytophage Nezara viridula a été étudié par olfactométrie. On a pu ainsi montrer que les mâles sexuellement mûrs de cette espèce produisaient au moins deux types de substances, dont le rôle est discuté. La réalisation d'extraits hexaniques et la chromatographie en phase gazeuse micropréparative ont permis d'en localiser les structures productrices et d'isoler les différentes fractions biologiquement actives. La spectrométrie de masse couplée à la chromatographie en phase gazeuse (GC/MS) a été utilisée pour déterminer la masse moléculaire et la famille chimique des phéromones mises en jeu,

ANIMAL PHYSIOLOGY. — A sex pheromone produced by mature males in the southern green stink bug, Nezara viridula (L.) (Heteroptera: Pentatomidae).

Olfactometry technics and micropreparative GC were used to study intraspecific communication in Nezara viridula. In this species, mature males produce at least two kinds of pheromones with their unicellular glands of the ventral abdominal epithelium. The role of these pheromonal compounds is discussed. Their structure has been partially elucidatedby GC/MS.

Nezara viridula est une punaise Pentatomidae, extrêmement cosmopolite et s'attaquant à de nombreuses cultures, notamment le soja aux Etats-Unis et le riz au Japon. Le comportement locomoteur des adultes et des derniers stades larvaires de cette espèce a été étudié au moyen d'un olfactomètre formé d'un tube de verre (20x3 cm) et balayé par un courant d'air odorisé. Ce tube est divisé en dix secteurs chacun partiellement séparé du voisin par une chicane dé verre. Ce dispositif permet d'éviter que les insectes ne remontent le courant d'air en l'absence de stimulation olfactive (fig. 1). Nous avons ainsi défini un indice d'attraction relative Dt [1] qui tient compte de la position initiale des insectes avant la stimulation et de leur position à la fin du test.

On à pu de cette façon montrer que les mâles sexuellement mûrs (environ 5 jours après la mue imaginale) étaient attractifs pour les femelles sexuellement mures mais ni pour les mâles ni pour les larves de dernier stade (fig. 3).

La réalisation d'extraits hexaniques de diverses parties du corps des insectes et l'utilisation de ces extraits totaux en olfactométrie (en employant pour chaque test une quantité d'extrait Correspondant à dix insectes) ont montré que les substances responsables de l'attractivité étaient émises au niveau du tégument abdominal ventral [2]. L'examen histologique de cette région [3] a montré que les mâles étaient richement pourvus de glandes tégumentaires unicellulaires, à l'inverse des femelles qui en possèdent très peu; on; peut donc penser que ces glandes produisent la sécrétion attractive.

La chromatographie en phase gazeuse micropréparative a ensuite été utilisée pour fractionner les extraits réalisés à partir du tégument abdominal ventral des mâles (fig. 2). Chaque fraction, à la dose de dix " insecte-équivalents », a été proposée à des femelles âgées d'environ une semaine. Les résultats sont résumés dans la figure 3. La fraction 4 s'est révélée être aussi attractive que l'extrait total; les fractions 1, 2, 3 et 5 n'ont eu aucun effet sur le comportement locomoteur des femelles. Les substances responsables de l'attraction sexuelle sont présentes en quantités relativement faibles par rapport aux autres composés présents dans les extraits, ce qui suppose une assez forte activité biologique.-

Si l'on compare les chromatogrammes obtenus à partir d'extraits de femelles, de mâles immatures et de mâles sexuellement mûrs (fig. 4), la fraction attractive n'est présente que

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chezees derniers. Ceci montre que des produits spécifiques au sexe mâle et n'apparaissant qu'à la maturité sont responsables des phénomènes mis en évidence par olfactométrie. On remarque, dans la fraction 2 des extraits de mâles mûrs, la présence de deux pics d'assez forte amplitude; cette fraction n'a pas d'effet attractif sur les femelles mais celles-ci manifestent des signes d'excitation se traduisant par des mouvements antennaires et parfois par une élévation de l'extrémité abdominale lorsqu'elle leur est proposée. C'est pourquoi on peut avancer l'hypothèse d'une action aphrodisiaque des substances présentes dans la fraction 2.

Le contenu des fractions 2 et 4 a été analysé en chromatographie en phase gazeuse couplée à la spectrométrie de masse (GC/MS). Les deux produits majoritaires de la fraction 4 ont des spectres de masse très voisins, ce qui laisse supposer qu'il s'agit de deux isomères; leur pic moléculaire indique une masse de 224. Les deux pics de la fraction 2 sont également deux isomères et leur masse est de 220. La comparaison de ces quatre spectres avec des spectres de référence laisse penser qu'on a affaire à des sesquiterpènes cycliques (pics de fragmentation ayant pour masse 43, 55, 67, 93, 109...).

Fig. 1. — Olfactomètre à chicanes. 1 : enceinte d'observation des insectes éprouvés; deux chicanes successives délimitent un secteur, le secteur numéro 0 étant celui le plus proche de la zone de lâcher des insectes et le numéro 9 le plus proche du robinet. 1': zone de lâcher des insectes éprouvés, 2: robinet à trois voies, 3: enceinte contenant la source d'odeur, 4: purificateur d'air (Porapak Q), 5: dessicateur (Silica-gel), 6: aspiration (pompe électrique).

Chaque test est effectué avec dix insectes simultanément et dure 10 mn. L'indice d'attraction en fonction du temps t est donné par la formule :

où n, est le nombre de punaises dans le secteur i au temps t.

Fig. 1. — Baffled Olfactometer. 1: observation chamber, l': release chamber, 2: three way cock, 3: source, 4:

air filter (Porapak Q), 5: air dryer (Silica-gel), 6: aspiration (electric pump). In each test, ten insects were used during 10 min. and the relative index of attractiveness was calculated as

follows:

where ni is the number of bugs in the sector i at the time t.


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Nous avons donc pu montrer que les mâles sexuellement mûrs de Nezara viridula émettent, au niveaude leur tégument abdominal ventral, une phéromone sexuelle attractive pour les femelles de l'espèce, de nature terpénique et qui reste à identifier. Ceci est en accord avec les observations de Mitchell et Mau [4]. Par contre, nous n'avons pas observé, dans nos conditions: expérimentales, de phénomènes d'agrégation de mâles, femelles et derniers stades larvaires provoqués par les mâles, comme l'avaient fait Harris et Todd [5].

Au sein de l'ordre des Hétéroptères, c'est le plus souvent le sexe mâle qui émet les phéromones, sauf ; dans la famille des Miridae. Les composés les plus fréquemment identifiés dans les sécrétions des punaises sont des aldéhydes aliphatiques ainsi que des

hydrocarbures satures (tridécane) [6]. Des terpènes sont parfois produits mais ils ont le plus souvent un rôle défensif vis-à-vis d'éventuels agresseurs; il s'agit donc d'allomones plutôt ique de phéromones. Cependant, chez Podisus maculiventris (Pentatomidae), un mélange de plusieurs substances dont un monoterpène, le linalol, est sécrété par la première glande abdominale dorsale, qui présente un fort dimofphisme sexuel de la taille

en faveur des mâles. Leurs sécrétions ont un effet attractif pour les femelles ainsi que pour les mâles [7].

Fig. 2

Fig. 3

Fig. 2. — Fractionnement par chromatographie en phase gazeuse micropréparative [colonne remplie inox de 2m, 3 % OVI sur CG 80-100. 180°C (15 mn), 180-> 280°C (32°C/mn)] d'extraits hexaniques de dix téguments abdominaux ventraux de mâles mûrs de Nezara viridula.

Fig. 2. — Micropréparative GC showing the different fractions obtained from hexanic extracts of the ventral abdominal tegument of ten mature males of Nezara viridula [inox packed column 2m, 3% OVl on CG 80-100, 180°C (15 mm.), 180 ->280°C (32°C/min)].

Fig. 3. — Réponses des femelles de Nezara viridula en olfactomètre en présence d'insectes vivants (histogrammes clairs) ou de différentes fractions réalisées à partir d'extraits hexaniques de téguments abdominaux ventraux de mâles matures (histogrammes foncés). T: Témoin, Pm: femelle mure, <?,: mâle immature, <$m: mâle mûr, Et : extrait total; FI, F 2, F 3, F4,F5: fractions 1, 2, 3, 4, 5. Chaque test a été conduit avec une source d'odeur équivalent à dix insectes, et dix femelles étaient éprouvées à la fois.

Fig. 3. — Responses of Nezara viridula females to living insects and to different fractions of natural extracts from ventral abdominal tegument of mature males. T: blank, $m: mature females, g,: immature males, cjm; mature males, Et: total extracis; F1, F 2, F 3, F4, F5: fractions 1, 2, 3, 4, 5. In each test, ten insect-equivalent were used as odour source and ten mature females were tested at the same time.


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Les phénomènes d'agrégation décrits chez N. viridula sont sans doute sous la dépendance de stimulations complexes combinant des modalités sensorielles diverses telles que l'audition, la vision et le toucher en plus des stimulus olfactifs; ceci expliquerait qu'on n'ait pas pu les mettre en évidence par un dispositif olfactométrique.

Les auteurs remercient J. Einhorn pour ses conseils en spectrométrie de masse. Reçue le 9 juin 1986.

RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES

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LN.R.A.-C.N.R.S., Laboratoire des Médiateurs chimiques, Magny-les-Hameaux, 78470 Saint-Rémy-lès-Chevreuse.

Fig. 4. — Analyse par chromatographie en phase gazeuse de trois extraits hexaniques de téguments abdominaux ventraux de 15 femelles mures, 15 mâles immatures et 15 mâles mûrs de Nezara viridula (colonne capillaire de 25 m, CP SIL 8CB, 0,23 mm i.d., 45 - > 130 > 240°C.

25°C/mn 2°C/mn

Fig. A. — GC analysis of three hexanic extracts from ventral abdominal tegument of 15 mature females, 15 immature males and 15 matures males of Nezara viridula (25 m capillary column, CP SIL 8CB, 0,23 mm i.d., 45 -► 130 > 240°C).

25°C/min. 2°C/min.


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PHYSIOLOGIE ANIMALE. — Étude comparative du transit intestinal chez les Carabidae et les Pterostichidae (Coleoptera, Caraboïdea). Note de Marie-France Jaspar-Versali, présentée par Maurice Fontaine.

Il existe des différences marquées entre les Carabidae et les Pterostichidae en ce qui concerne la durée totale du transit intestinal et la vitesse de progression du bol alimentaire dans les différentes régions du tube digestif. Ces différences sont en relation avec d'une part, le type de mécanisme de prisé de nourriture et d'autre part, la morphologie du tractus digestif et plus particulièrement l'organisation microstructurale du stomodeum.

ANIMAL PHYSIOLOGY: — Comparative study of food transit in Carabidae and Pterostichidae (Coleoptera, Caraboidea).

Some marked differences between Carabidae and Pterostichidae are described concerning the total duration of the transit and the progress rate in the different digestive segments. Those differences are related on one hand, with the food catching mechanism patterns and on the other hand, with the digestive tract morphology and more especially the microstructural organization of the foregut..

En fonction de leurs mécanismes alimentaires, les Carabes peuvent être répartis en deux groupes. Le premier comprend les Carabidae adultes, les Cicindelidae ainsi que les larves de l'ensemble des Carabiques, qui ont une alimentation semi-liquide. Par régurgitation extra-orale de liquide intestinal, ces insectes lubrifient et liquéfient leur proie avant de l'ingérer ([1] à [4]). A l'inverse; les insectes du second groupe, comprenant la majorité des Carabes adultes n'appartenant pas à la famille des Carabidae, et notamment les Pterostichidae, ne présentent pas ce phénomène de digestion extra-intestinale. Ils dilacèrent leur proie et en ingèrent des fragments de taille variable ([4], [5], [6]). Les travaux mentionnant des adaptations en relation avec ces différents mécanismes de prise de nourriture sont rares ([3], [5], [6]). Ils concernent la morphologie externe, principalement les pièces buccales, les sclérites céphaliques et la musculature associée. Cependant, nous avons pu observer des adaptations morphologiques internes du système digestif ([7], [8]), ainsi que des adaptations physiologiques telles que la durée du transit intestinal et la vitesse deprogression du bol alimentaire dans les différentes régions digestives. Ce dernier aspect est plus particulièrement développé ici.

MATÉRIEL ET MÉTHODES. — L'étude du transit intestinal reposé sur l'utilisation d'une technique radiographique. L'incorporation de sulfate de baryum à la nourriture des animaux permet d'apprécier, au cours du temps, l'évolution de l'opacité relative des différentes régions du tube digestif et de suivre ainsi la progression du bol alimentaire chez un même individu. Parallèlement, nous avons vérifié par des tests histochimiques (rhodizonate de sodium et dithizone) que le sulfate de baryum n'était pas résorbé par les différents épithélia digestifs. Les radiographies sont réalisées sur des plaques couramment utilisées en dentisterie (Dupont, Super Dozahn 3 x 4E), à l'aide d'un appareillage Yoshida Panoura (tension de 55 kV, 10mA, à des temps inférieurs à 0,1 s). Notre étude concerne trois espèces, à savoir Chrysocarabus splendens et Chrysocarabus rutilans pour les Carabidae, Abax ater pour les Pterostichidae. Afin d'apprécier l'influence du jeûne sur la vitesse de progression du bol alimentaire, nous avons réalisé pour chaque espèce envisagée, deux lots expérimentaux de sept individus chacun. Dans le premier lot, les insectes sont maintenus à jeun pendant 72 h avant l'ingestion de nourriture barytée. Les individus du second lot sont nourris normalement (une fois par jour), la dernière prise de nourriture étant additionnée de sulfate de baryum. On maintient les animaux durant une heure au contact des aliments marqués; le temps compris entre la première prise de nourriture (1 = 0) et la vidange intestinale est subdivisé en périodes de 2 à 3h pour les Carabidae, de 6h pour Abax ater. Une radiographie est effectuée à la fin de chaque période.

RÉSULTATS. — Il n'existe pas de différence significative de la vitesse de progression du bol alimentaire entre les insectes soumis préalablement au jeûne et ceux alimentés de façon continue. Par contre, cette vitesse varie considérablement si l'on considère les espèces appartenant aux deux familles envisagées.

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A. Chez les Carabidae, les radiographies réalisées pour les deux espèces étudiées donnent des résultats semblables tant pour la durée totale du transit que pour la durée du séjour des aliments dans les différentes régions intestinales.

Le transit intestinal se déroule de la manière suivante (fig. 1) : pendant les 2 premières heures, le bol alimentaire opacifié se situe principalement dans le gésier, avec cependant un marquage positif mais plus discret du mésentéron, de l'ileum et du rectum. La vidange du gésier est terminée après 3 h de transit et la totalité du bol alimentaire est parvenue à la fin de la vésicule chylifique. Le mésentéron postérieur et le proctodeum s'opacifient de plus en plus. Entre 6 et 12 h, l'opacité du mésentéron postérieur diminue d'importance tandis qu'elle augmente progressivement au niveau de l'ileum et du rectum. Après 12 h, le sulfate de baryum se localise principalement dans l'ampoule rectale et ne subsiste plus qu'à l'état de traces dans l'ileum. Dans tous les cas examinés, le transit est terminé 24 h après l'ingestion de nourriture.

B. Chez Abax ater (Pterostichidae), le transit intestinal se déroule de la manière suivante (fig. 2) : durant les premières 24 h, le bol alimentaire se localise exclusivement dans le stomodeum et plus particulièrement dans le gésier qui apparaît fortement distendu. Le volume de cet organe diminue ensuite progressivement et l'opacifiant apparaît dans le mésentéron. C'est seulement 36 h après l'ingestion que la vidange du gésier est terminée. Le bol alimentaire se situe alors principalement dans le mésentéron mais sa présence peut également être décelée dans l'ileum. Ce dernier s'opacifie nettement après 42 h de transit, le rectum après 48 h. Le transit est terminé 60 h environ après l'ingestion de nourriture.

DISCUSSION. — Comparativement à la situation observée chez Abax ater (Pterostichidae), le transit intestinal des Carabidae est de courte durée (24h seulement, au lieu de 60 h). Cette observation doit être mise en relation avec l'existence chez les Carabidae d'une digestion pré-orale qui réduit l'importance des processus d'hydrolyse enzymatique dans le tube digestif. A l'inverse, chez les Pterostichidae, les proies n'ayant subi aucune action hydrolytique préalable, la totalité des phénomènes de digestion se déroule donc dans le tractus digestif.

La vitesse de progression du bol alimentaire est en relation avec les caractères morphologiques particuliers du tractus digestif des deux familles étudiées. Chez les Carabidae, le gésier présente sur toute sa longueur' la structure d'un organe filtrant, cette dernière fonction étant attestée par la présence de soies plumeuses ([7], [8]). Lors de son passage dans le gésier, le bol alimentaire est ainsi filtré et c'est vraisemblablement la fraction liquide qui est décelée très tôt (dans les 2 premières heures de transit) au niveau du proctodeum. Seules les particules alimentaires sont susceptibles d'être retenues au niveau du filtre. Mais ce temps de rétention est d'autant plus court que le processus de digestion, précédemment amorcé, se poursuit dans le stomodeum ([7] à [10]). Le stomodeum des

EXPLICATIONS DES FIGURES

Fig. 1 et 2. — Transit intestinal respectivement chez Chrysocarabus splendens (Carabidae) (fig. 1) et chez Abax ater (Pterostichidae) (fig. 2) après ingestion de nourriture barytée; a, documents radiographiques; b, interprétation schématique des résultats; G, gésier; I, ileum; Mp, mésentéron postérieur; O, oesophage; R, rectum; Vc, vésicule chylifique (mésentéron antérieur).

Figs. 1 and 2. — Food transit respectively in Chrysocarabus splendens (Carabidae) (fig. 1) and Abax ater (Pterostichidae) (fig. 2) after ingestion of baryum treated food; a, radiographie plates; b, schematic interprétation of the results; G, proventriculus; I, ileum; Mp, posterior midgut; O, oesophagus; R, rectum; Vc, anterior midgut.


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Carabidae ne constitue donc pas un niveau de stase du bol alimentaire : il est en effet exempt de toute trace de nourriture 3 h seulement après l'ingestion. Par contre, la situation est très différente dans le proctodeum : la durée du transit à ce niveau représente plus de 50% de la durée totale. Le ralentissement important du bol alimentaire dans l'ileum et le rectum s'explique dans la mesure où ces deux organes sont impliqués dans les processus d'équilibre hydro-minéral. C'est à ce niveau en effet qu'a lieu la rétention d'eau, quasi totale chez les Carabes (faeces pratiquement anhydres).

Chez Abax ater (Pterostichidae), on assiste au contraire à un ralentissement du bol alimentaire dans le gésier : la durée du transit y représente environ 50% de la durée du transit total. Ce ralentissement s'explique si l'on tient compte de la nature grossière des aliments ingérés et de l'organisation microstructurale du gésier ([7], [8]). Cet organe présente en effet, chez les Pterostichidae, un système à deux compartiments : la région antérieure constitue une nasse où s'accumule la nourriture, tandis que la région postérieure est à proprement parler l'organe filtrant ([7], [8]). Les radiographies confirment cette hypothèse puisqu'elles révèlent une stase du bol alimentaire dans le gésier et plus particulièrement dans sa région antérieure. C'est à ce niveau également que s'opère une part importante de la digestion des aliments ingérés ([7], [8]). Le matériel ainsi digéré est ensuite filtré dans la région gésiale postérieure et peut ainsi accéder progressivement au mésentéron. Proportionnellement, la vitesse de progression dans le mésentéron est comparable à la situation observée chez les Carabidae. Le passage relativement rapide des aliments dans cet organe s'explique par le fait qu'ils ont déjà subi une fragmentation et l'action des hydrolases digestives.

La durée du transit proctodéal de Abax ater représente dans son ensemble environ 40 % de la durée totale, mais, à l'inverse des Carabidae, on ne peut parler dans ce cas de stase du bol alimentaire. Eh effet, la progression des aliments y est régulière et graduelle comme le démontre bien l'analyse des radiographies au cours des 24 dernières heures de transit. Elle est fonction de la lenteur de filtration au niveau du gésier. Reçue le 21 avril 1986.

RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES

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Laboratoire de Morphologie, Systématique et Écologie animales, 22, quai Van Beneden, 4020 Liège, Belgique.


C. R. Acad. Sc. Paris, t. 303, Série III, n°7, 1986 281

REPRODUCTION ANIMALE. - Nouvelles données sur le besoin hormonal de la

lapine gestante: grossesses partielles et anomalies foétales après traitement par un antagoniste hormonal à dose sub-aboriive. Note de Alfred Jost, présentée par Alfred Jost, Membre de l'Académie.

L'evolution de la gestation de la lapine nécessite la progestérone ovarienne. Il avait été observé, il y a longtemps, qu'une déficience en hormones ovariennes entraînait soit l'avortemènt, soit la «grossesse partielle », soit même des anomalies foetales. L'administration à la lapine gestante, à partir de 11 jour d'un antagoniste hormonal connu pour son activité anti-progestérone, le RU486, à dose sub-abortive. reproduit les effets d'une déficience en hormones ovariennes.

ANIMAL REPRODUCTION. — New data on the hormonal requirement of the pregnant rabbit: partial pregnancies and fatal anomalies resulting from treatment with a hormonal antogonist, given at a sur-abortive dosage.

Evolution of pregnaner in rabbits depends upon ovarian progesterone. A deficiency in ovarian hormones was

observed a long tinn ago to result either in abortion or in "partial pregnancy" or even in fetal

anomalies. Admmistration to pregnant rabbits, from day 11 on, of a hormonal antagonist known for its

anti-progesterone activity, RU486, at a sub-abortive dosage, reproduces the effects of ovarian hormone deficiencies.

In rabbits, pregnancy depends upon corpus luteum hormones ([l], [2]), Quantitative studies with synthetic progesterone showed that 5 mg pet day permits normal pregnancy in ovarieclomized does, while 0.5 mg is insufflaient ([3], [6]). Intermediate daily dosages resuit either in abortion or in survival of some fetuses while others die [partial pregnancies as defined by Courrier [3]]. In some cases insufficient ovarian hormone dosages resulted in severe fetal anomalies ([6], [7]). The hormonal antagonist RU486, which competes with progesterone (and with glucocorticosteroids), was used to explore the effects of a hormonal imbalance on pregnancy. Out of 40 pregnant rabbits injected with 250, 500, 750 ug or lmg per day of RU486 for 1, 2, 3 or 5 days starting on day 11 of pregnancy, 22 aborted. The incidence of abortion was lower in does receiving the lower dosage (250 ug/day) or in those given a higher dose (500 ug/day) foronly 1 or 2 days. In females treated for 3 or 5 days, abortion was frequent. Other females studied on day 28 of pregnancy had "partial pregnancies". In four pregnant animalms abnormal fetuses were observed. The anomalies included: 1. extremely small size (e.g. llg on day 28); 2. non-fused eyelids and large fontanelle; 3. opened cranial vault, exposing meninges or hemorrhagic or necrotic nervous tissue; 4. necrotic destruction of the upper part of the head and of the brain, and finally 5. absence of closure of the vertebral canal.

Since ovarian hormones are not required for the fetus itself but must permit uterine accommodation ([14], [15]), the hormonal imbalance produced by RU486 probably affects fetal development by an uterine disturbance.

Several differences in uterine physiology and in endocrinology of the feto-placental System between rabbits and humans are known. But insofar as observations made on rabbits are valid in humans, and insofar as RU486 is used to interrupt pregnancy in humans ([11], [12]), conditions insuring total elimination of the fetus should be assured [16].

0249-6313/86/03030281 $.2.00 © Académie des Sciences


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INTRODUCTION. — Chez la lapine, les corps jaunes gravidiques sont indispensables à l'évolution normale de la gestation [1]. Chez la femelle ovariectomisée, ils peuvent être suppléés par l'injection d'extraits liposolubles de corps jaunes [2] ou de progestérone pure synthétique ([3], [4], [5]). L'analyse quantitative du besoin en progestérone de la lapine gestante castrée, faite par Courrier et coll., montrait que si une dose quotidienne de 5 mg de progestérone permet l'évolution d'une gestation normale [6], la dose de 0,5 mg par jour est insuffisante et ne peut empêcher l'interruption de la gravidité [3]. Les doses quotidiennes intermédiaires conduisent à des résultats variables, soit maintien d'une grossesse complète, soit réalisation d'une « grossesse partielle » ([3], [4], [6]) au cours de laquelle certains foetus seulement survivent, alors que d'autres meurent. Or dans trois lapines castrées à 12 jours et ayant reçu soit 1 mg de progestérone par jour (1 cas), soit 0,5 mg de progestérone +0,6 ug d'oestradiol par jour (2 cas), on trouvait des foetus présentant des lésions tératologiques graves [6]; la photographie de deux de ces foetus a été publiée ultérieurement [7]. Les quantités d'hormones ovariennes en question sont évidemment insuffisantes pour maintenir une gestation normale; nous avons supposé qu'un déficit en hormones ovariennes pouvait être responsable de lésions graves du développement foetal ([6], [7]). Chez la ratte castrée, même si la quantité de progestérone ou de progestatif de synthèse administrée est très importante, le défaut d'oestradiol entraîne également des anomalies de la gestation et des lésions foetales ([7], [8]).

La découverte de compétiteurs de la progestérone semble devoir permettre de vérifier le rôle d'une insuffisance en progestérone dans les anomalies de la gestation et du développement foetal chez la lapine. Nous avons utilisé le RU486 (17p-hydroxy-ll p-(4 diméthylaminophényl)-17a-(prop-l-ynyl)-oestra-4.9-dien-3-one) que les laboratoires Roussel-Uclaf ont aimablement mis à notre disposition. Ce composé est à la fois un anti-corticostéroïde [9] et un puissant antagoniste de la progestérone [10] capable de provoquer l'avortement dans l'espèce humaine ([11], [12]), ce qui a été logiquement interprété comme une conséquence de son action anti-progestative.

TECHNIQUES. — L'expérimentation a porté sur des lapines Fauves de Bourgogne provenant toutes du même élevage (J. Ponceau, 37370 Epeigne-sur-Dème). Pour réaliser des conditions voisines de celles de 1939 [6], le produit (en solution dans l'huile d'olive) a été injecté par voie sous-cutanée, en deux injections quotidiennes, pendant des durées de 1, 2, 3 ou 5 jours en commençant le traitement à 11 jours (dans un petit nombre de cas la première demi-dose a été donnée à 10 jours). Les doses quotidiennes ont été de 250, 500, 750 ug ou de 1 mg. La gravidité des lapines est vérifiée par palpation à 11 jours. Les femelles ont été sacrifiées à 28 jours, sauf lorsque l'avortement survenait précocement et que la vacuité utérine était vérifiée ultérieurement par palpation (1).

Les foetus prélevés à 28 jours ont été pesés et ont fait l'objet d'un examen macroscopique externe. Les foetus anormaux ont été fixés soit dans du formol salé, soit dans du liquide de Bouin, pour examen histologique.

A titre de témoin on a utilisé les observations faites au laboratoire par Marc Gilbert au cours de recherches sur le métabolisme de la gestation [13] pendant la même période, sur des lapines provenant du même élevage (animaux répartis au hasard entre les deux types d'expérimentation). Les témoins comprennent 30 femelles à 24 jours de grossesse, et 47 à 30 jours. Les taux de résorptions étaient respectivement de 6,2 et 5,1%, sur des portées de 8,1 ±0,1 foetus. Aucune anomalie tératologique n'a été observée.

RÉSULTATS. — Sur les 40 lapines traitées par le RU486, aux dates et aux doses indiquées, 22 ont avorté, soit qu'on ait observé des pertes sanglantes, soit qu'on ait simplement constaté la vacuité de l'utérus à 28 jours. 11 lapines présentaient une « grossesse partielle » et 7 avaient un nombre de foetus en développement apparemment normal.

Dans l'ensemble les gestations les plus normales ont été obtenues chez les lapines ayant reçu une dose relativement faible (250 ug par jour) (3 lapines sur 4) ou celles à qui une


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dose plus élevée (500 ug par jour) n'a été donnée que pendant 1 ou 2 jours (3 lapines sur 4).

Sur les lapines ayant reçu 500 ug par jour pendant 3 ou 5 jours, 7 ont avorté, et 7 ont des « grossesses partielles ». 3 lapines ont des foetus présentant des anomalies de la tête ou de la région dorsale (voir plus loin).

La proportion des avortements est plus élevée chez les lapines ayant reçu 750 ug ou

I mg par jour, surtout si le traitement à été donné 2, 3 ou 5 jours (12 lapines sur 15). Deux lapines avaient une « grossesse partielle », le nombre des foetus morts dépassant largement le nombre des foetus vivants. Enfin une lapine portait 9 foetus dont 3 présentaient des anomalies (lmg par jour pendant 5 jours).

Les anomalies foetales rencontrées peuvent être classées de la manière suivante, par ordre de gravité croissante :

— réduction de taille très marquée, par exemple un poids foetal de 11 g environ à 28 jours (2 cas), alors que les foetus normaux atteignent 38 ou 40 g. Cette hypotrophie ne s'accompagne pas de lésion tératblogique décelable à l'examen externe. Les foetus les plus petits, ont en général des yeux volumineux et exorbités, dont la croissance paraît avoir été moins réduite que celle du reste du Corps;

— absence de fermeture des paupières et fontanelle particulièrement large, souvent chez des foetus de petite taille;

— absence de fermeture de la voûte crânienne avec nécrose sous-jacente, la lésion se présente comme un trou dans la voûte crânienne exposant soit les méninges, soit du tissu nerveux hémorragique ou nécrosé;

— destruction hémorragique de la partie supérieure de la tête et du cerveau;

— absence de canal rachidien.

Ces deux dernières lésions, ont été observées chez un foetus trouvé vivant à 28 jours, et pesant 5,95 g (mère ayant reçu 500 ug de RU486 pendant 5 jours). Chez ce foetus les yeux difformes étaient exorbités et plusieurs doigts des pattes postérieures et antérieures absents.

Le canal rachidien ne s'était pas formé non plus chez un foetus macéré mesurant environ 30 mm de longueur et qui présentait en outre une exomphalie (mère ayant reçu 500 ug de RU486 pendant 5 jours). Il est possible que certains dès foetus qui meurent à divers stades de la grossesse sans pouvoir être examinés, présentaient des lésions comparables.

DISCUSSION. — L'administration à la lapine gestante du composé RU486, à une dose sub-abortive et en commençant le traitement à 11 jours, permet de reproduire les effets notés autrefois ([6], [7]) comme résultant d'une dose insuffisante de progestérone ou de l'association progestérone-oestradiol. Il s'agit de « grossesses partielles » et d'anomalies tératologiques foetales.

La drogue utilisée est douée à la fois de propriétés anti-progestérone et anticorticostéroïdes. L'expérimentation réalisée ne permet pas de dire laquelle de ces deux activités est responsable des faits observés. On peut retenir d'une part, que les enfants présentant un syndrome adrénogénital par suite d'une déficience de la synthèse de corticostéroïdes ne présentent pas de lésions comparables à celles observées chez le lapin.

II est vrai qu'ils reçoivent des corticostéroïdes de leur mère, par la voie placentaire, en quantité cependant insuffisante pour freiner le fonctionnement de leur hypophyse. D'autre part, les observations faites ici sont si semblables à celles résultant d'une déficience


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lutéinique ([6], [7]) qu'on est naturellement enclin à incriminer l'activité anti-progestérone du RU486.

En ce qui concerne la nature des lésions foetales produites, on retiendra d'abord que les hormones ovariennes ne sont pas indispensables au développement du foetus lui-même, comme le montre le cas des foetus normalement développés au cours de la grossesse extra-utériene chez la lapine castrée ([14], [15]). Les hormones ovariennes sont indispensables à l'utérus pour lui permettre de s'accommoder à la gestation par une distension suffisante, et non au foetus lui-même. Le chondrocrâne du foetus de lapin ne se forme qu'après 14 à 15 jours et le canal rachidien qu'après 16 jours [16], on peut donc envisager qu'une rétraction utérine avant ou pendant cette période puisse léser gravement l'encéphale et les formations dorsales.

Enfin, dans la mesure où les observations réalisées chez la lapine pourraient être transposées dans l'espèce humaine, ce qui n'est pas sûr étant donné les différences dans la physiologie utérine et dans l'endocrinologie de l'ensemble foeto-placentaire dans les deux espèces, et où le RU486 serait employé pour interrompre le cours de la gestation humaine, des conditions assurant l'élimination du foetus à coup sûr, devraient être mises en oeuvre. L'association d'une protaglandine au RU486 a été proposée [17].

Ce travail est dédié à la mémoire de notre Maître Robert Courrier à qui l'endocrinologie de la gestation doit tant.

( 1) Ces expériences ont bénéficié de l'excellente collaboration technique de Mme Simone Perlman, du C.N.R.S., et de M. Robert Urbe.

Reçue le 9 juin 1986.

RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES

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[12] E. E. BAULIEU et A. ULMANN, Bull. Acad. Nale Med., 169, 1985, p. 1191-1199.

[13] Voir par exemple, M. BOUISSET, M. C. PÈRE et M. GILBERT, Amer. J. Physiol, 250E, 1986, p. 677-682.

[14] R, COURRIER, C.R. Soc. Biol, 135, 1941, p. 820.

[15] R. COURRIER, In Endocrinologie de la gestation, Masson et Cie, Paris, 1945.

[16] A. KÖLLIKER, In Entwicklungsgeschichte des Menschen und der höheren Thiere, 2. Auflage, Engelmann, Leipzig, 1879.

[17] M. L. SWAHN, S. CEKAN, G. WANG, V. LUNDERSTROM et M. BYGDEMAN, In The antiprogestin steroid RU486 and human fertility control, E. E. BAULIEU et S. J. SEGAL éd., Plenum Press, New York, London, 1985, p, 249-258.

Laboratoire de Physiologie du Développement, Collège de France, 11, place Marcelin-Berthelot, 75231 Paris Cedex 05.


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PATHOLOGIE ANIMALE. — Étude de l'action de la 8-endotoxine de Bacillus thuringiertsis israëlensis sur des relations biochimiques fonctionnelles chez le Diptère Aedes aegypti. Note de Michel Bounias, Bonaventure Nizeyimana et Constantin Vago, présentée par Constantin Vago, Membre de l'Académie.

L'étude de l'action des oligodoses de la S-endotoxine de Bacillus thuringiensis israëlensis sur les larves du Diptère Aedes aegypti a permis de mettre en évidence certaines propriétés singulières au niveau des relations doses/effets basées; sur les variations des pentes de régression des relations fonctionnelles observées sur les couples cystéine/sérine et acides gras/histidine, par opposition au coupele acide gras/glucose qui donne lieu à une relation de forme classique. Il s'agit là de manifestations "crypto-toxicologiques" non létales par elles-mêmes, et n'entraînant pas de symptômes pathologiques, mais susceptibles, de constituer l'amorce de processus d'« enchaînements pathogènes » conduisant, à terme, à l'apparition d'un syndrome secondaire létal.

ANIMAL PATHOLOGY. - A survey of the action &-endotoxin of Bacillus thrungiensis israëlensis on biochemical functional relationships in Aedes aegypti (Diptera).

A study of the action of very low doses of the ft-endotoxin of Bacillus thuringiensis israëlensis on the larvae of Aedes aegypti (Diptera) gave evidence forpeculiar properties of the dose/ effect relations based on the variations of the regression slopes of functional relationships between the pairs cysteine/serine ans fattu acids/ histidine, by contrast with the pair fatty acids/glucose. which exhibited a classical shaped relation. This indicates "cryptotoxicological" processes, not letal by themselves and without pathological symptoms, but able to initiate "pathogenchaining'' mechanisms leading, at the énd, to a létal secondary syndrom.

INTRODUCTION. — Depuis quelques armées, une attention croissante est accordée, dans l'évaluation des effets pathogènes de germes toxigènes ou de substances toxiques, à l'action des oligo-infections ou des intoxications très faibles, surtout depuis que des mécanismes d'« enchaînements » de processus pathogènes, faisant suite à de-telles étapes toxiques, ont été mis en évidence, et leur importance établie chez divers invertébrés

([1], [2]).

Cependant, pour la compréhension de tels mécanismes, se déroulant en grande partie sans aucun symptôme chez l'individu atteint, les approches habituelles par établissement de la DL50 ([3], [4], [5]), l'histologie ou l'analyse des teneurs en certaines substances, se sont montrées peu révélatrices de troubles physiopathologiques.

En approfondissant ce problème sur je modèle que constitue l'action des oligodoses d'une endotoxine de Bacillus thuringiensis israëlensis sur le Diptère Aedes aegypti, nous avons mis en évidence certaines modifications dans les inter-relations métaboliques entre les glucides et les aminoacides de l'hémolymphe ainsi que les lipides abdominaux de l'Insecte. Les Variations des concentrations de ces composants ont été analysées sous l'action de doses croissantes de toxine, sur des larves ne présentant aucun signe extérieur d'intoxication. Certaines relations fonctionnelles entre représentants des trois classes biochimiques étudiées ont été mises en évidence chez les individus sains, et leurs modifications par l'action de la toxine ont pu être caractérisées en fonction des doses administrées [7].

Les résultats ont.attiré notre attention sur certaines difficultés à définir des « doses efficaces» par simple extrapolation, et nous nous proposons, donc, dans la présente communication de montrer l'importance particulièrede certains effets sublétaux à la lumière de quelques exemples illustrant des cas extrêmes.

MATÉRIEL ET MÉTHODES. — Le germe dont l'action toxique a été. étudiée, est la variété israëlensis,

sérotype 14 [6], de la bactérie sporulée et cristallophore Bacillus thuringiensis Berliner, particulièrement active

sur les Diptères. La matière toxique utilisée est sa §-endotoxine sous forme de corps d'inclusion cristallins

purifiés. Les larves d'Aedes aegypti, élevées comme précédemment décrit [7], ont été maintenues, à partir du

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début du quatrième stade, par lots de 25 individus en récipients de 200 ml, soit dans l'eau (témoins), soit dans des solutions contenant : 0,01/0,02/0,1/ et 1,0 mg/l de toxine titrant 12000 unités internationales (u.i.) par milligramme, ce qui représente: 120/240/1200/ et 12000 u.i. par litre, respectivement. Les concentrations indiquées correspondent dans les conditions expérimentales décrites, à DLglO, DL<=50, DL100 et 10xDL100 au-delà de 24 h. Les glucides et les acides aminés sont directement dosés à partir de l'hémolymphe brute, ponctionnée à l'aide de micro-seringues de 1 ul de capacité totale, puis les lipides sont extraits des abdomens isolés par le mélange chloroforme-méthanol (8-2 v/v). Les analyses quantitatives ont été effectuées par nanochromatographie en couche mince [8] et les chromatogrammes ont été enregistrés au moyen d'un spectrodensitomètre « CS920 ». Les analyses ont été effectuées avant traitements, puis au bout de 30 mn, 1 h, 1 h 30, 2, 4, 6, 8, 12, 24 et 36 h sur des larves ne présentant aucun symptôme extérieurement visible d'intoxication. Avec les deux doses supérieures, les prélèvements ont été limités respectivement à 8 et 2 h du fait de la mortalité plus élevée. Chaque mesure provient de l'analyse des extraits groupés de 20 larves. Les relations fonctionnelles retenues comme exemples concernent les couples suivants : acide gras/glucose; cystéine/sérine; acides gras/histidine.

Les probabilités (P) de signification des coefficients de corrélation (p) ont été déterminées à partir de l'équation de distribution de « t » de student. Les pentes de régression (nombres sans dimensions, ici) ont été désignées par b et leurs variances a2 ont été calculées au moyen de l'expression : cr2=[(b/p) 2 — b2]/(N — 2) où N est le nombre de couples de mesures. Les intervalles de confiance ont été estimés au seuil P=0,05 par i=±ta/ /N. Les relations doses/effets n'étant pas linéaires, les variations des pentes des relations ont été analysées en fonction du logarithme naturel (Ln) des doses (d) de toxine.

RÉSULTATS. — L'évolution, en fonction des doses, des pentes des relations fonctionnelles entre les acides gras et le glucose est illustrée par la figure 1. Avec les quatre doses de toxine, la corrélation est élevée : p= +0,936 (P=0,06) et l'équation de régression linéaire : p = 0,054 Ln(d)— 0,58 permet de calculer une dose théorique ayant les mêmes effets

Fig. 1 Fig. 2

Fig. 1. — Évolution de la pente (p) de la relation fonctionnelle entre les acides gras et le glucose d'Aedes

aegypti en fonction des doses (d) de toxine exprimées en u. i. : (A) = 120 u. i.; (V) = 240 u. i.; (<) = 1200 u. i.;

(□) = 12000 u.i. Les valeurs observées chez les témoins sont désignées (T). Le nombre de mesures ayant

conduit au calcul des pentes figure en regard de chaque point. Les pentes sont exprimées en nombres sans

dimension (mM par mM). Fig. 1. — Variations of the slope (p) of the functional relationship between Aedes aegypti fatty acids and glucose

according to toxin doses (d) expressed in i. u. Control values are designated by (T). The number of data

used for the determination of slopes is indicated in front of each point.

Fig. 2. — Évolution de la pente (p) de la relation entre la cystéine et la serine de l'hémolymphe d'Aedes

aegypti en fonction des doses (d) de toxine (u.i.). Mêmes symboles que sur la figure 1. Une représentation

en coordonnées non transformées est indiquée en encart. Fig. 2. — Variations ofthe slope (p) ofthe relationship between cystein and serin in Aedes aegypti haemolymph

according to toxin doses (d) (i.ù.). Same symbols as on Figuré 1. The inset graph is given in natural

coordinates.


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apparents que les témoins : pour une pente initiale P0= —0,53, cette dose s'établit à : do = 2,36u.i./l ou 0,2 ug/1.

La figure 2 illustre les variations de la pente de régression correspondant aux relations entre la cystéine et la serine. La courbe est, ici. de type biphasique, avec une augmentation de la valeur des pentes sous l'action de la plus faible dose de toxine suivie d'un retour à la valeur initiale puis d'une diminution progressive avec les doses croissantes. L'ensemble des quatre doses permet encore d'établir une corrélation élevée : p=— 0,959 (P=0,04) dont l'équation de régression linéaire est: p= —0,52Ln(d) + 1,89. A la pente initiale Po= —1,35 mesurée chez les témoins, il correspond une dose théorique do = 492 u. i./l soit 0,04 mg/1, qui se situe, donc, à l'intérieur des limites des doses réelles utilisées. Une relation de même nature a été également observée entre la cystéine et la serine.

En ce qui concerne le couple acide gras/histidine (fig. 3), les pentes, négatives chez les témoins, tendent à augmenter en fonction croissante des trois plus fortes doses de toxine, selon une équation de la forme: p=0,2Ln(d)— 2,33 (p = 0,978; P=0,13). La pente mesurée chez les témoins: Po=— 2,78 équivaudrait à celle produite par une dose do=0,ll u. i./l soit 9 ng/1, donc excessivement faible. Par contre, la dose 120 u. i. perturbe la relation entre acides gras et histidine dont la pente atteint même une valeur positive, P=0,65 (N = 13) quoique de faible signification ( + 0,78), dont le report sur la droite représentative de la relation doses/effets atteindrait une valeur correspondant à une dose théorique voisine de 3.106 u. i./l soit environ 0,25 g/l.

DISCUSSION ET CONCLUSIONS. — Dans les larves saines d'Aedes aegypti, au cours du quatrième stade, il apparaît une corrélation négative entre les acides gras et le glucose, dont l'équivalent a déjà été observé chez d'autres insectes ([9], [10]). Ce phénomène, qui témoigne de la complémentarité énergétique glucido-lipidique, est affecté de manière continue par des doses croissantes de toxine qui tendent à annuler la relation. Devant la linéarité du phénomène, il serait tentant de considérer la dose théorique do correspondant à la pente Po observée chez les témoins, comme une « dose sans effet » (D.S.E.). Toutefois, la seconde relation étudiée, reliant la cystéine et la serine, fait apparaître un phénomène différent : alors que les doses élevées de toxine accentuent la pente négative qui traduit

Fig. 3- — Évolution de la pente (p) de la relation entre les acides gras et l'histidine chez Aedes aegypti en fonction des doses (d) de toxine (u.i.)..Mêmes notations que sur la figure 2. Fig. 3. - Variation of the slope (P) of the relation between Aedes aegypti fatty acids and histidin according to tixin dose (d) (i. u.). Same notations as on Figure 2.


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l'inter-convertibilité des deux composés (via l'ortho-acétylsérine et l'incorporation de Fanion soufre), la plus faible dose inverse le phénomène en augmentant la pente. Cela traduit la mise en oeuvre, par les faibles doses, de mécanismes opposés à ceux qui se manifestent aux doses élevées : or, de tels processus « biphasiques » peuvent intervenir lors de la régulation d'enzymes allostériques par leurs effecteurs naturels ([11], [12]). C'est donc certainement au niveau des enzymes impliquées qu'il conviendrait de rechercher, ici l'origine du phénomène.

D'autre part, l'existence d'effets biochimiques spécifiques des plus faibles doses (inférieures à la DSE théorique) invalide la notion-même de DSE : l'absence d'effet apparaît alors, ici, comme une simple transition entré des symptômes opposés.

Enfin, l'exemple de la relation entre les acides gras et l'histidine suggère que de faibles doses de toxine pourraient également simuler l'action prévisible de très fortes doses, par le biais d'une certaine désorganisation des relations fonctionnelles.

Il convient d'observer, ici, que les concentrations de nombreux amino-acides sont fortement perturbées (le plus souvent dans le sens d'une accumulation) par la plus faible dose de toxine, la même observation s'appliquant aux acides gras et aux triglycérides [7]. Les effets provoqués par de faibles doses de toxines ne se limitent donc pas au seul cas des relations fonctionnelles présentées dans ce mémoire.

De tels phénomènes «crypto-toxicologiques» sont de nature à passer inaperçus en l'absence de recherches spécialement destinées à les mettre en évidence. Cette terminologie recouvre donc, ici, deux démarches associées : d'une part, la recherche, à l'aide de techniques biochimiques très sensibles, de symptômes non visibles par les méthodes courantes: d'observation, et d'autre part, la recherche de ces mêmes symptômes dans des conditions d'action de faibles doses habituellement considérées comme dépourvues d'effets perceptibles. L'incidence propre de ces phénomènes, en l'absence d'autres facteurs, est vraisemblablement limitée et réversible. Toutefois, selon le contexte pathologique dans lequel ils se manifestent, leur importance peut revêtir une toute autre dimension. Nous avons pu constater, en effet, qu'un certain nombre de spécimens appartenant aux lots analysés, ont présenté des mortalités septicémiques tardives. Or, il a été montré, qu'une oligo infection par le Bacillus thuringiensis alesti quoique bénigne par elle-même, est néanmoins capable de préparer le terrain à la prolifération d'autres pathogènes, jusqu'à l'apparition d'un second syndrome aboutissant à la mort de l'hôte alors même que toutes traces du premier agent infectieux ont disparu [1]. Les résultats obtenus avec la toxine du Bacillus thuringiensis israëlensis conduisent donc à penser que certaines des manifestations biochimiques non létales apparues sous l'action de doses extrêmement faibles pourraient être à l'origine de processus d'« enchaînements pathologiques » tels qu'ils avaient été décrits dès 1956 [2] : selon les conditions environnementales, l'état pathologique dès animaux pourrait alors évoluer au bout de délais variables dans une direction très différente de celle du syndrome primaire.

Il est intéressant d'observer que de telles conclusions convergent avec de récentes remises en question de la notion de « dose maximale tolérée », qu'il s'agisse du cas de l'action de toxines chimiques [13] ou de celle d'agents physiques [14].

L'intérêt des recherches sur de tels mécanismes d'enchaînements pathogènes et sur les manifestations crypto-toxicologiques qui apparaissent comme étroitement liées à ceux-ci, sera appelé à croître au fur et à mesure que se resserreront les frontières entre deux nécessités difficiles à concilier : contrôler la prolifération des parasites ou des vecteurs de


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maladies, tout en sauvegardant les autres espèces, en particulier les auxiliaires de l'équilibre des populations, et ceci aussi bien en milieux naturels qu'en agrocoenoses. Reçue le 2 juin 1986.

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PHYSIOLOGIE VÉGÉTALE. — Intervention de la glycine bétaïne dans le contrôle in situ de l'activité ribonucléasique des feuilles excisées du Suaeda maritima (L.) Dum. var. macrocarpa Moq.. Note de Jean-Pierre Billard, Marie-France Rouxel et Jean Boucaud, présentée par Jean-Louis Bonnemain.

Les feuilles excisées du Suaeda maritima var. macrocarpa, placées en condition de choc salin, présentent en 16 h une capacité ribonucléasique fortement réduite par un apport exogène de bétaïne. Le seuil d'action du composé azoté est très bas puisque situé entre 0,1 et 0,5 mM. Une fonction métabolique est proposée pour cette molécule «anti stress» considérée jusqu'à présent comme osmorégulatrice.

PLANT PHYSIOLOGY. — Implication of glycine betaine in the control in situ of ribonuclease activity in excised leaves of Suaeda maritima (L.) Dum. var. macrocarpa Moq.

Excised leaves of Suaeda maritima var. macrocarpa placed in conditions of saline shock show, 16 hrs. after addition of exogenous betaine, a highly reduced ribonuclease capacity. The action threshold of the nitrogenous compound is very low since situated between 0.1 and 0.5 mM. A metabolic function is suggested for this "anti-stress" molecule considered until now involved in osmoregulation.

INTRODUCTION. — L'étude du contrôle du niveau de l'activité ribonucléase (RNase) constitue un domaine d'investigation particulièrement intéressant pour déterminer un rôle métabolique éventuel de la bétaïne. Très sensible aux conditions de stress, l'activité RNase est augmentée en cas d'excision de feuilles, de déficit hydrique, de sénescence [1]. Une Chénopodiacée halophile comme le Suaeda offre un support expérimental original par la rapidité de réponse de l'activité RNasique dès que la salinité du milieu est modifiée [2]. L'effet du Na+ in vivo n'est pas connu au niveau moléculaire, il pourrait s'exercer en faisant intervenir un médiateur tel que la glycine bétaïne mise en évidence chez le Suaeda ([3]-[5]).

L'objet de ce travail est de développer cette hypothèse en analysant les répercussions d'un choc salin et d'un apport de bétaïne sur le niveau de l'activité RNasique de feuilles excisées de Suaeda maritima (L.) Dum. var. macrocarpa Moq.

MATÉRIEL ET MÉTHODES. — Suaeda maritima var. macrocarpa est cultivé au laboratoire à partir de semences dans les conditions précédemment décrites [6]. Le milieu de culture est celui de la Purdue University non additionnée de NaCI.

Après 37 jours de culture, les deux premières feuilles sont prélevées sur la tige principale au moment où les limbes atteignent leur allongement maximal. Les feuilles (F) sont sectionnées à 1 mm de chaque extrémités puis réparties en lots homogènes d'environ 0,5 g de matière fraîche (18 feuilles). Les lots témoins sont analysés immédiatement après leur prélèvement. Les lots expérimentaux sont mis à flotter sous un éclairement de

TABLEAU I

Effets de l'excision et de la nature du milieu de flottation sur la teneur en eau (en % MS) et en sodium

(en mM) des feuilles du Suaeda en fonction de la durée (en heures) de l'expérience (Fo; Fo-bét.; F130; F130-bét.

voir Matériel et Méthodes). Moyenne ± écart-type, n=3. Effect of excision and composition of the floating médium on water (% DW) and sodium (mM) contents of

leaves of Suaeda as a function of time-hours of experimentation (Fo; Fo-bet.; F130; F130-bet. see Material and

Methods). Average ± SD, n = 3.

Durée en heures' Fo Fo-bét. F130 F130-bét.

flottation Na+ Eau Na+ Eau Na+ Eau Na+ Eau

Oh 15 900

(±D (±42)

16 h 15 1368 17 1121 120 1060 138 931

(±1) (±64) (±1) (±55) (±8) (±51) (±9) (±44)

40 h 16 1170 16 980 174 1125 163 941

(±1) (±55) (±1) (±47) (±11) (±53) (±10) (±46) .

0249-6313/86/03030291 $ 2.00 © Académie des Sciences


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14 W. m2 pendant 16 et 40 h sur la solution de la Purdue University dans quatre conditions différentes :

— solution nutritive sans NaCl (SN0) : lots F0;

— solution SN0 additionnée de 10 mM de bétaïne : lots Fo-bét;

— solution additionnée de 130mM de NaCl (SN130): lots F130;

— solution SN130 additionnée de 10 mM de bétaïne: lots F13o-bét. Les cultures et chaque analyse ont été reproduites au moins trois fois.

Le protocole de détermination de l'activité RNase, issu avec quelques modifications de celui de Naito et coll. [7], a été décrit précédemment [2]. Dans ces conditions, le coefficient de variation portant sur 4 mesures effectuées à partir d'un même extrait est toujours inférieur à 1 %. L'unité d'activité enzymatique (ÛA) est définie comme étant la quantité d'enzyme qui, en 30 mn, catalyse une formation de nucléotides acido-solubles entraînant une variation d'absorption à 260 nm de 1,0. La capacité enzymatique est rapportée au milligramme de protéine (p) extraite (UA h-1.mg-1.p). La teneur des extraits en protéines est déterminée par la méthode de Lowry et coll. [8]. La teneur en eau est exprimée en pour cent de la matière sèche déterminée après 48 h de dessiccation à 105°C. Le sodium, extrait à partir de la matière sèche par traitement à l'acide çbiorhydrique 0,6 N, est dosé par photométrie de flamme. Les résultats rapportés à l'eau cellulaire sont exprimés en mMRÉSULTATS.

mMRÉSULTATS. 1. Effets in vitro du NaCl et de la bétaïne sur l'activité RNasique. — Le NaCl ou la bétaïne sont ajoutés dans le milieu d'incubation ajusté à pH 6,5, La figure 1 montre que la RNase est faiblement stimulée ou demeure constante dans une gamme de concentrations de NaCl allant de 50 à 600 mM. Dans les mêmes conditions d'analyse, l'activité de l'enzyme déterminée en présence de bétaïne est insensible jusqu'à 300 mM et n'est inhibée que de 10 % par 600 mM. Ces résultats montrent que la bétaïne, même en forte concentration, n'a pas d'effet inhibiteur sur l'activité RNase.

2. Effets d'un choc salin et de la bétaïne sur la teneur des tissus foliaires en eau et en sodium. — La flottation de feuilles excisées sur un milieu dépourvu de sel (F0) entraîne après 16 h, une forte augmentation de la teneur en eau des tissus (tableau 1), celle-ci étant réduite lorsque la solution est enrichie de 10 mM de bétaïne (Fo-bét). La présence de 130 mM de NaCl (F130) dans le milieu de flottation limité également l'entrée d'eau. En conditions salines, l'apport de bétaïne (F130-bét.) maintient la teneur en eau des feuilles excisées à leur niveau initial. Ces résultats montrent que les tissus foliaires du Suaeda présentent un potentiel hydrique très bas puisque leur teneur en eau s'accroît rapidement

Fig. 1

Fig. 2

Fig. 1. — Effet in vitro de la concentration en NaCl (O) et en bétaïne (®) du milieu d'incubation sur l'activité

RNasique du Suaeda cultivé en absence de NaCl pendant 37 jours. Résultats exprimés en pourcentages de

l'activité déterminée sans apport de sel et de bétaïne dans le milieu d'incubation. Fig. 1. — Effect in vitro of NaCl (O) and betaine (©) concentrations in the incubation médium on RNase

activity of Suaeda grown in the absence of NaCl for 37 days. Results expressed in percent of activity

determined without addition of sait or betaine in the incubation medium.

Fig. 2. — Effet de la concentration exogène de bétaïne sur la capacité RNasique (©) des feuilles excisées du Suaeda après 16 h de flottation eh absence de NaCl (*, capacité RNasique du témoin; O, activité relative).

Fig. 2. — Effect of exogenous betaine concentration on ribonuclease capacity (o) in excised leaves of Suaeda floated 16 hrs., in the absence of NaCl (*, RNase capacity ofcontrol; O, relative activity).


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293.

TABLEAU II

Effets de l'excision et de la nature du milieu de flottation sur l'évolution de là capacité RNasique des feuilles excissés su Suaeda, en fonction de la durée (en heures) de flottation (mêmes légendes que celles du tableau I). Moyenne ± écart-typé, n=3.

Effect of excision and composition of the floating medium on evolution of RNase capacity in excises leaves of Saueda, as a funcion of time-hours of experimentation (same cation as for TableI). Average +-SD, n=3.

Durée en heures Capacité RNase

flottation Fo Fo-bét. F130 F130-bét

0 h ................110+3- - - -

16 h..............................124+-4 86+-3 96+-5 58+-3

40 h ... 275+12 . 205±11 , 212+10. 172+8

lorsqu'ils sont placés sur une solution saline (130 mM de NaCl). L'effet stabilisant de l'apport de bétaïne ne se manifeste totalement que pour les feuilles en flottation sur une solution enrichie de sel.

Le tableau I montre que la pénétration de Na+ dans les feuilles est massive lorsque le milieu est additionné de 130mM de NaCl. Le passage de 0 à 130 mM entraîne en effet, en 16 heures, une rapide augmentation puis une stabilisation de la teneur en Na+ à un niveau 10 fois supérieur à la teneur initiale. L'addition de 10 mM de bétaïne ne modifie pas la perméabilité cellulaire au Na+ des feuilles.

3. Effets, in vivo, d'un choc salin et de la bétaïne sur l'évolution de la capacité RNasique des tissus foliaires. — L'excision des feuilles mises à flotter en absence de NaCl (F0, tableau II) provoque, après 16 heures d'incubation, une induction rapide et importante de la capacité RNasique qui se prolonge au moins jusqu'à la 40e heure d'expérience. La présence de NaCl ou de bétaïne dans le milieu de flottation limite en 16 h de 20 à 30 % l'amplitude de l'effet inducteur dû à l'excision. L'action conjuguée du NaCl et de la bétaïne dans le milieu accentue encore ce résultat. En effet, l'augmentation de la capacité RNasique est non seulement réduite de 40 à 50 % par rapport au témoin F0 entre la 16e et la 40e heure d'incubation, mais elle est également diminuée dès les premières heures suivant l'excision (50 % après 16 h).

Ces résultats montrent clairement l'effet synergique du NaCl et de la bétaïne présents dans le milieu de flottation sur la limitation de l'effet inducteur du stress provoqué par l'excision sur le niveau de l'activité RNasique.

4. Effets in vivo de la concentration en bétaïne exogène sur la régulation de la capacité RNasique. — L'action de la teneur en bétaïne exogène a été évaluée sur des feuilles mises à flotter pendant 16 h sur des milieux sans NaCl (lot F0) additionnés de 0 à 100 mM de bétaïne. Dans ces conditions expérimentales, la figure 2 montre que l'effet maximal de la bétaïne sur la diminution du niveau de l'activité RNasique se manifeste pour de très faibles concentrations, comprises entre 0,1 et 0,5 mM. Une expérience témoin réalisée en présence de 10.mM de mannitol n'entraîne pas de modification de la capacité de l'enzyme, excluant l'intervention d'un éventuel effet osmotique.

CONCLUSIONS. — L'étude de l'activité RNasique d'extraits issus de feuilles de la Chénopodiacée halophile Suaeda maritima var. macrocarpa révèle une remarquable insensibilité de la RNase in vitro au NaCl et à la bétaïne. Ce résultat, obtenu avec une enzyme cytosolique [2] est physiologiquement compatible avec les concentrations intracellulaires de ces deux molécules chez le Suaeda ([3]-[5], [9]) et avec le rôle d'osmoticum attribué à la bétaïne [10].


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Afin de détecter un rôle métabolique éventuel de la bétaïne, une méthodologie basée sur l'étude des variations du potentiel RNasique en réponse au choc salin a été mise au point. Celui-ci est réalisé par flottation, en présence de 130 mM de NaCl, de feuilles excisées prélevées sur des plantes cultivées en absence de sel. Dans de telles conditions, la bétaïne apportée à une concentration de 10 mM ne provoque pas de modification significative de la perméabilité cellulaire au Na+, alors qu'elle limite l'entrée d'eau dans les feuilles. La flottation de feuilles excisées en absence de NaCl, entraîne une importante augmentation de la capacité RNasique, ce qui peut être expliqué par une accélération de la sénescence ou par les lésions cellulaires liées à l'excision [11].

Un apport massif de Na+ dans les tissus foliaires annule, en 16 h, les conséquences de l'excision sur la capacité de la RNase. Un même effet est obtenu lorsque les feuilles sont mises à flotter en présence de 10 mM de bétaïne. Ainsi le sel et la bétaïne interviennent dans le contrôle du niveau de l'activité RNasique. Récemment, Goas et coll. [12] ont montré, chez Aster tripolium, que le choc salin obtenu par la transplantation de plantes entières en milieu salé provoque une augmentation significative de la concentration intracellulaire de glycine bétaïne. La pénétration de Na+ dans les feuilles excisées de Suaeda pourrait déterminer une augmentation de la teneur de bétaïne. Le sodium n'aurait alors qu'un rôle de médiateur dans le contrôle du niveau de l'activité RNase. Cette hypothèse est renforcée par la mise en évidence d'une action synergique du Na+ et de la bétaïne. Enfin le seuil d'action de la bétaïne exogène est très bas puisqu'il se situe entre 0,1 et 0,5 mM. De plus, l'effet de ce composé azoté n'est pas spécifique car il se manifeste également dans le cas de disques foliaires de Phaseolus vulgarïs(résultats non publiés).

La bétaïne peut être qualifiée de molécule «anti stress» par l'action qu'elle exerce au niveau moléculaire. Son effet à faible dose sur la régulation du niveau de l'activité RNase, en condition de choc salin, est très comparable par son intensité d'action, à celui bien connu des polyaminès et de certaines hormones de croissance [13].

Ces résultats, obtenus avec la RNase étudiée en tant que protéine cible, nous permettent de rapporter pour la première fois, une preuve expérimentale d'Une fonction métabolique de la bétaïne. Les modalités d'action de ce composé azoté au niveau moléculaire sont actuellement recherchées. Reçue le 12 mai 1986, acceptée après révision le 16 juin 1986.

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C. R. Acad. Sc. Paris, t. 303, Série III, n° 8, 1986 295

IMMUNOLOGIE. — Induction de rémissions du diabète insulino-dépendant par la cyclosporine. Note de Gilles Feutren, Laure Papoz, Roger Assan, Bernard Vialettes, Martine Pehuet, Patrick Vexiau, Hubert Durostu, Michel Rodier, Jean Sirmai, Anne Lallemand et Jean-François Bach, présentée par Jean-François Bach, Membre de l'Académie.

L'effet de la cyclosporine a été évalué dans un essai en double insu contre un placebo chez 122 diabétiques ; insulino-dépendants au début de leur maladie. Un pourcentage significativement plus élevé de rémissions complètes fut observé chez les malades traités par la cyclosporine que chez les patients recevant du placebo (respectivement 24 et 5,8 % de rémission complètes au 9e mois). L'effet fut encore plus net chez les malades ayant présenté les taux les plus élevés de cyclosporinémie (37 %). Ces résultats qui ont été obtenus sans toxicité majeure démontrent: que la cyclosporine peut induire dès rémissions du diabète insulino-dépendant et incitent à mettre en oeuvre de nouveaux essais thérapeutiques contrôlés, destinés à évaluer la durée de l'effet obtenu et les risques potentiels du traitement.

IMMUNOLOGY.— Induction of remissions of insulin-dependent diabetes by cyclosporine.

The effect of cyclosporine was evaluated in a double blind placebo controlled trial in 122 recent onset insulin-dependent diabetics. A significantly higlier incidence of complete remissions was observed in patients treated with cyclosporine than in those receiving placebo (respectively 24 and 5.8%). The effect was still more clear-cut in patients having presented the highest cyclosporine Mood level (37%). These results which have been obtained with modest toxicity demonstrate that cyclosporine induces remission of insulin-dependent diabètes and prompt to set up new controlled trials to evaluate the duration of the effect obtained and the potential risks of the treatment.

Il apparaît désormais établi que le diabète insulino-dépendant (type 1), encore appelé diabète juvénile pour marquer sa survenue habituelle chez l'enfant et le jeune adulte, est d'origine auto-immune ([1], [2]). Plusieurs données suggèrent que la maladie fait particulièrement intervenir les cellules T. Ainsi, le diabète des rats BB et des souris NOD, très proche du diabète humain, peut être prévenu par la thymectomie néonatale et transféré à des animaux non diabétiques par des cellules T [3]. Il était dès lors logique de tenter d'arrêter ou de freiner l'évolution autrement inéluctable de la maladie par un traitement immunosuppresseur agissant de préférence sur les cellules T.

Connue pour son action sélective sur les cellules T, la cyclosporine a été utilisée avec succès chez le rat BB [4] et la souris NOD [5] pour prévenir la survenue du diabète. Parallèlement, deux essais cliniques ouverts ont montré que plus du tiers des malades traités par la cyclosporine présentaient une rémission de leur maladie ([6], [7]). La réalité de l'effet de la cyclosporine restait cependant à démontrer formellement car les rémissions spontanées ne sont pas rares au début de l'évolution du diabète insulino-dépendant. Nous apportons ici cette démonstration par la mise en évidence de l'induction de rémissions par la cyclosporine dans un essai en double insu contre placebo portant sur 122 malades.

MATÉRIEL ET MÉTHODES. — Patients. — Cent vingt-deux diabétiques âgés de 15 à 40 ans furent introduits dans l'essai après avoir été informés des bénéfices espérés et des risques encourus et après avoir signé une lettre de consentement. Seuls des malades ayant commencé le traitement par l'insuline depuis moins de 2 mois furent considérés.

Traitement. — Tous les malades recevaient de l'insuline au début de l'essai et l'insulinpthérapie fut continuée tant que les valeurs de la glycémie le justifièrent. La cyclosporine fut administrée oralement à la dose initiale de 7,5. mg/kg/jour. La posologie fut diminuée en cas de néphrotoxicité ou au contraire augmentée en l'absence d'effet clinique jusqu'à un maximum de 10 mg/kg/jour. A la fin du 6e mois, le traitement lut arrêté en cas d'échec. Chez lés autres patients, la posologie fut progressivement réduite jusqu'à la dose de 5 mg/kg/jour.

Randoniisation. - Les malades furent randomisés en 2 groupes recevant l'un la cyclosporine, l'autre une préparation placebo en tous points identiques à la préparation active hormis la présence du médicament.

0249-6313/86/03030295 $ 2.00 © Académie des Sciences C. R., 1986, 2e Semestre (T. 303) Série III - 25


296 C. R. Acad. Se. Paris, t. 303, Série III, n° 8,1986

Précaution fut prise de ne pas communiquer les résultats des dosages de créatininémie et de cyclosporinémie aux médecins suivant les malades afin de ne pas lever l'insu. De même, les rémissions furent jugées sous code collectivement par les médecins participant à l'essai.

Rémissions. — Les rémissions complètes furent définies sur le double critère de la cessation de l'insulinothérapie et d'un bon équilibre métabolique [taux satisfaisant des glycémies et de l'hémoglobine glycosylée (<7,5 %)]- Les malades ayant réduit leur dose quotidienne d'insuline au-dessous de 0,25 U/kg tout en conservant un bon équilibre métabolique furent considérés en rémission partielle. Par contre, les malades ayant réduit leur dose d'insuline ou même arrêté l'insulinothérapie, mais ne présentant pas un bon équilibre métabolique, furent classés parmi les échecs. De même, les patients ayant arrêté leur traitement (cyclosporine ou placebo) avant le 6e mois furent également considérés comme des échecs.

RÉSULTATS. — L'incidence des rémissions fut analysée 6 et 9 mois après le début du traitement par la cyclosporine ou le placebo. A 6 mois, une rémission complète fut observée chez 25,4 % des malades traités par la cyclosporine et chez 18,6 % des patients recevant le placebo (N.S.). A 9 mois, une rémission complète fut obtenue chez 24 % des malades du groupe traité par la cyclosporine contre seulement 5,8 % des malades du groupe placebo (p<0,0l). Le taux de rémissions complètes se révèla plus élevé, (respectivement 37,5 % à 6 mois et 37,0 % à 9 mois) chez les malades ayant présenté pendant les 3 premiers mois des taux sanguins de cyclosporine supérieurs à 300 ng/ml (dosage radioimmunologique sur sang total 24 h après la prise orale quotidienne). Les rémissions partielles furent également plus souvent observées dans le groupe traité par la cyclosporine que dans le groupe recevant du placebo. A 9 mois, l'incidence globale des rémissions complètes et partielles s'élevait à 37 % pour l'ensemble des patients traités par la cyclosporine et à 55,6 % pour ceux ayant présenté des taux de cyclosporinémie supérieurs à 300 ng/ml (contre 13,5 % dans le groupe placebo). Une élévation significative mais modeste et réversible du taux de créatinémie plasmatique témoignant d'une néphrôtoxicité fut observé chez 48 % des malades traités par la cyclosporine. Les autres effets secondaires consistèrent essentiellement en une hypertrichose, une hypertension modérée et une anémie mais aucune infection sévère ni de syndrome lymphoprolifératif ne fut noté.

DISCUSSION. — Ces résultats apportent la première démonstration de l'effet d'un immunosupresseur sur l'évolution du diabète insulino-dépendant. Vingt-sept pour cent des malades traités par la cyclosporine présentèrent une rémission complète à 9 mois (contre 5 % dans, le groupe placebo). Ce pourcentage s'élève à 40 % si on considère les malades ayant reçu des doses efficaces de cyclosporine (attestées par des taux de cyclosporinémie supérieurs à 300 ng/ml). Les pourcentages de rémission sont encore plus élevés si on considère les rémissions partielles qui pourraient se révéler bénéfiques dans la mesure où le contrôle métabolique s'est montré meilleur chez les malades présentant de telles rémissions que chez les patients n'ayant pas répondu à la cyclosporine.

Ces résultats apportent l'espoir à terme d'une prévention du diabète insulinodépendant, qui serait d'autant plus efficace que le traitement immunosuppresseur est commencé plus tôt dans l'histoire de la maladie, en même temps ou mieux avant l'insulinothérapie. Il convient néanmoins de réaliser les limites actuelles et les contraintes du traitement immunosuppresseur par la cyclosporine : caractère récent du diabète, nécessité d'une surveillance régulière de la fonction rénale et des taux de cyclosporinémie, étude des paramètres immunologiques. En outre, d'importantes incertitudes persistent sur la durée de l'effet obtenu et la toxicité à long terme du produit, notamment sur les reins. Pour toutes ces raisons, il convient encore de limiter l'utilisation de la cyclosporine dans le diabète à des essais contrôlés réalisés dans des centres spécialisés.

Reçue le 7 juillet 1986.


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C. R., 1986, 2e Semestre (T. 303) Série III - 26



C. R. Acad. Sc. Paris, t. 303, Série III, n° 8, 1986

IMMUNOLOGIE. — Le diabète insulino-dépendant, maladie autoimmune. Noté de Jean Hamburger, présentée par Jean Hamburger, Membre de l'Académie,

Les preuves s'accumulent en faveur d'un processus d'autoimmunité dans le diabète insulino-dépendant (diabète type 1), affection liée à une destruction sélective des cellules bêta du pancréas sécrétrices d'insuline. Des autoanticorps antipancréatiques circulants ont été découverts dès 1974 et nous avons démontré, en 1982, l'existence d'une immunité cellulaire dépendant des lymphocytes T contre les cellules bêta. Cette immunité cellulaire paraît plus spécifique que l'immunité humorale observée chez ces malades. Les anomalies immunologiques précèdent le développement du diabète. Elles ont sans doute une responsabilité décisive dans les altérations des cellules bêta du pancréas. De nombreux points demeurent toutefois obscurs et réclament de nouvelles recherches.

IMMUNOLOGY. — Type I diabetes mellitus, an autoimmune disease.

In type I (insulin-dependent) diabetes evidence for an autoimmune process is now fully established. This is also true for a similar disease observed in the NOD mouse and the BB rat. In addition to circulatirig antipancreatic antibodies, we demonstrated T-lymphocyte mediated cellular immunity in both these diabetic animals and in the human. Immunological abnormalities precede the development of diabetes and may be responsible for beta cell alteration. Evidence for this interprétation appears stronger for cell-mediated than for humoral immunity. However, full demonstration and understahding of the relationship between anti-beta cell immunity and bel a cell alteration still raisemany unresolved problems.

Le concept de maladie autoimmune, expression d'une agressivité anormale dé notre système immunologique contre nos propres tissus, a bouleversé la médecine. Nombre d'états pathologiques, d'origine jusque-là mystérieuse, ont vu leur mécanisme intime s'éclairer. Dans ces dernières années, le laboratoire de Necker a été mêlé à la découverte d'une responsabilité inattendue des processus autoimmuns dans une importante variété de diabète sucré.

Cette variété est d'ordinaire connue sous le nom de diabète de type 1 ou diabète insulino-dépendant. Elle frappe le plus souvent des sujets jeunes, enfants d'âge scolaire ou adultes jeunes. Elle est due à une destruction sélective des cellules du pancréas qui sécrètent l'insuline, ou cellules bêta. La carence en insuline provoque non seulement l'élévation du sucre sanguin et sa fuite dans l'urine, mais aussi des phénomènes d'acidocétose qui, faute d'un traitement par l'insuline poursuivi toute une vie durant, provoque immanquablement la mort. Même traité par l'insuline, ce diabète de type 1 est à long terme une maladie grave.

Fort heureusement pour l'étude de cette maladie, on en connaît des équivalents chez l'animal. Des races consanguines d'élevage, la souris NOD (Non Obese Diabetic mouse) du Japon et le rat BB (Bio Breeding rat) du Canada souffrent spontanément d'un diabète très analogue à la forme humaine. Comme chez l'homme, ce n'est pas à la naissance, mais après un temps de latence, que le diabète apparaît, frappant 80% des souris NOD femelles (20 % chez les mâles) et 60 % des rats BB.

Chez ces animaux comme chez l'homme, l'attention a été attirée dès 1974 sur la présence dans le sang circulant d'anticorps dirigés contre les îlots de Langerhans du pancréas, où se trouvent notamment les cellules bêta ([1], [2]). Cette constatation fut confirmée par de nombreux groupes de recherche [3]. Elle suggérait l'existence de phénomènes autoimmuns dans le diabète de type 1, mais elle n'éclairait pas pleinement le mécanisme d'apparition de celui-ci. Il existe même de sérieuses raisons dépenser que ces anticorps ne sont pas la cause principale de la destruction des cellules bêta : (a) ces anticorps antipancréatiques ne sont, pas spécifiques des cellules bêta; (b) on peut les trouver dans certains diabètes d'un autre type; (c) aucun essai pour transférer le diabète

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à un autre animal en lui injectant ces anticorps n'a jamais réussi. Il est possible que ces anticorps ne soient qu'un témoin de la maladie pancréatique, et non sa cause.

C'est pourquoi nous décidâmes de reprendre le problème avec mes collaborateurs, notamment Monique. Debray-Sachs, en tentant d'utiliser les méthodes d'étude de la réaction de rejet des greffes, qui nous étaient familières : l'analogie est, en effet, frappante entre le rejet d'une greffe étrangère et le rejet autoimmun d'un de nos tissus, faussement pris pour étranger par notre système immunologique de défense.

Dans les greffes allogéniques, comme j'ai déjà eu l'honneur de l'exposer à F Académie [4], la responsabilité majeure du rejet ne réside pas en général dans la présence d'anticorps, mais dans une armée de cellules spécialisées et diverses, dont la plus importante est le lymphocyte thymo-dépendant ou lymphocyte T et qui vont sur place détruire le greffon. Aussi était-il naturel de chercher si les lymphocytes des malades atteints de diabète du type 1, des souris NOD et des rats BB n'étaient pas capables d'altérer les fonctions des cellules du pancréas. La preuve qu'il en était bien ainsi fut présentée dans une Note à l'Académie datant du 7 juin 1982 et confirmée ensuite par de nombreux auteurs étrangers ([5], [6]). La méthode que nous avions employée était inédite : elle consistait à mettre les lymphocytes de sujets atteints de diabètes de type 1 en présence des cellules isolées d'îlots de Langerhans de pancréas de souris : il apparut que ces lymphocytes inhibaient spécifiquement la sécrétion d'insuline par les cellules bêta, tandis que la sécrétion de glucagon, qui dépend des cellules alpha, n'était nullement modifiée. Et l'emploi d'anticorps monoclonaux spécifiques de divers types de lymphocytes nous permettait de montrer que les cellules agressives étaient des lymphocytes thymo-dépendants du type dit cytotoxique.

Mais la présence de lymphocytes capables d'attaquer les cellules pancréatiques sécrétrices d'insuline prouve-t-elle que cette agressivité est bien le facteur premier responsable du diabète? Il arrive qu'une telle autoimmunisation ne soit pas la cause, mais la conséquence de l'altération d'un tissu malade. Les lésions du pancréas pourraient modifier celui-ci de telle façon qu'une réaction immunologique secondaire se produirait contre le tissu devenu anormal. On a noté que le déclenchement du diabète du type 1 paraissait parfois favorisé par une infection virale, telle que l'infection par le virus de la rubéole [7], si bien qu'on peut imaginer que les perturbations immunologiques n'apparaîtraient qu'après altération du pancréas par le virus.

Toutefois, de nombreux arguments donnent à penser que l'anomalie immunologique peut précéder l'anomalie pancréatique et jouer, par conséquent, dans celle-ci un rôle déterminant.

1° Les diabétiques de type 1 ont des anomalies congénitales et héréditaires du système immunologique. 90% d'entre eux possèdent à la naissance les marqueurs DR 3 ou DR 4 du système HLA, ou les deux, et l'on sait que ces marqueurs favorisent les maladies autoimmunes, notamment DR 3 pour des affections aussi diverses que le lupus érythémateux disséminé, la thyroïdite d'Hashimoto et la myasthénie dont l'origine autoimmune ne fait plus aucun doute aujourd'hui [8].

2° Les anomalies immunologiques précèdent l'apparition du diabète. Des enquêtes multiples portant sur la souris NOD, le rat BB et l'homme atteint de diabète de type 1 ont permis de décrire une phase de la maladie où l'on trouve déjà des anomalies immunitaires alors que la sécrétion d'insuline est encore normale et le diabète absent [8]. Certaines observations exceptionnelles font même état d'un décalage pouvant atteindre 9 ans [9],

3° Dans la famille des diabétiques de type 1, on trouve des sujets ayant au moins une ébauche d'anomalies immunologiques semblables, alors qu'aucun diabète n'est détectable.


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Cette constatation a été observée maintenant par de très nombreux auteurs et nous-mêmes l'avons maintes fois vérifiée.

4° La transplantation du pancréas d'un jumeau identique à un diabétique de type 1 a été suivie d'une agression immunologique du pancréas normal greffé [10].

5° Le diabète de type 1 est assez souvent associé à d'autres maladies autoimmunes. Dans une de nos séries, cette coïncidence était au moins probable dans 40 % des cas [5]. Certes, aucun de ces arguments n'est rigoureusement décisif. D'autres recherches sont encore nécessaires, pour isoler le ou les antigènes pancréatiques qui servent de cible à l'agression immunologique; pour déterminer la nature exacte des gènes (presque sûrement multiples) responsables de l'anomalie immunologique; pour connaître l'importance exacte de facteurs déclenchants (capables d'expliquer qu'à patrimoine génétique apparemment identique, deux jumeaux vrais puissent être l'un atteint et l'autre indemne). Mais, dès maintenant, la présomption de la nature autoimmune du diabète de type 1 est très forte et autorise à la recherche d'un traitement par des médications immunomodulatrices avant que le pancréas de ces sujets soit irrémédiablement détruit. Reçue le 7 juillet 1986.

RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES

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38, rue Mazarine, 75006 Paris.



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VIROLOGIE. — Infection de cellules d'insectes en culture par le virus HIV, agent du SIDA, et mise en évidence d'insectes d'origine africaine contaminés par ce virus. Note de Jean-Louis Becker, Uriel Hazan, Marie-Thérèse Nugeyre, Françoise Rey, Brano Spire, Françoise Barré-Sinoussi, Alain Georges, Louis Teulières et Jean-Claude Chermann, présentée par Raymond Latarjet.

Le virus HIV, agent étiologique du SIDA, peut se fixer sur diverses cellules d'insectes en culturre (Drosophiles, Moustiques, Cératites), pénétrer et s'intégrer au génome cellulaire sous forme d'ADN proviral sans s'y exprimer. Ces cellules ne présentent à leur surface aucun marqueur lymphocytaire.

L'ADN proviral HIV a été retrouvé dans des insectes en provenance du Zaïre et de Centre Afrique, mais pas chez ceux de la région parisienne. Ces insectes peuvent être des réservoirs ou des vecteurs pour le virus

HIV.

VIROLOGY. - Infection of insect cell lines by HIV, agent of AIDS, and evidence for HIV proviral DNA

in insects from Central Africa.

The etiological agent of AIDS known as HIV has been shown to bind un different insect cell lines including Drosophila, Mosquito, Ceratitis; and his DNA to be integrated in the cellular genome, but no expression of the viral genome was detected in those cells. None of the human lymphocytes markers is expressed at the surface of the insect cells.

HIV proviral DNA has been also found in various insects from Central Africa (Zaïre and Central Africa Republic) but not similar insects from the Paris area. These data suggest that insects could be a reservoir or a vector for the AIDS virus.

INTRODUCTION.- Le virus de l'immunodéficience humaine (HIV) [1] préalablement désigné LAV [2], HTLV III [3] ou ARV [4] est l'agent étiologique du syndrome d'immunodéficience acquise (SIDA). Ce virus a un tropisme préférentiel pour une sous-population de lymphocytes CD4 [5]. Il peut infecter également les macrophages et les lympocytes B transformés par le virus d'Epstein Barr. Le récepteur cellulaire pour le virus a souvent été associé à la molécule CD4.

Le virus HIV marqué à la fluoresceine mis en contact avec des cellules de diverses origines permet de mettre en évidence celles qui possèdent le récepteur pour le virus [6]. Cet essai a permis de montrer que des cellules d'insectes fixent le virus à leur surface bien qu'elles ne présentent pas l'antigène CD4. Suite à ces résultats, nous avons recherché et mis en évidence la présence d'ADN viral dans des insectes en provenance d'Afrique (Zaïre et République centrafricaine).

MATÉRIEL ET MÉTHODES.— 1. Recherche du récepteur du virus HIV à la surface des Cellules d'insectes. — Quatre lignées de cellules d'insectes ont été utilisées; (tableau). Ces cellules sont cultivées dans un milieu spécifique à 25°C ([7], [8], [9]).

5.105 cellules sont mises en contact pendant 30 mn à 4°C avec du virus (5 ug) préalablement couplé à la fluorescéine par de l'isothiocyanate de fluorescéine (HIV-FITC) [6]. Après deux lavages en: tampon PBS, le Culot cellulaire est resuspendu dans un milieu PBS-Glyeérol (2 V/l V), puis le pourcentage des. cellules fixant le virus marqué est déterminé par comptage d'au moins 300 cellules au microscope à épifluorescence.

2. Infection de la lignée cellulaire Kco par le virus HIV. — 107 cellules Kco de drosophile ont été infectées en présence de polybrène (2 ug/ml) par un surnageant de Culture, clarifié, contenant du virus HIV à la dose de 3.105 cpm d'activité transcriptase inverse. [2].

3. Recherche d'ADN proviral dans la lignée Kco infectée et dans des broyats de diverses espèces d'insectes. — 5 jours après l'infection des cellules Kco, l'ADN génomique est extrait. Des insectes de diverses espèces et d'origines différentes (région parisienne, Zaïre, République centrafricaine) ont été broyés à froid afin de purifier l'ADN génomique. 10 ug d'ADN sont déposés sur une feuille de nitrocellulose puis hybrides dans des conditions de forte stringence [5xSSC(3 M NaCl, 0,3 M sodium citrate) 50% formamide à 42°C] avec des sondes entières et subgénomiques marquées par du phosphore 32.

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TABLEAU

Les cellules des lignées présentées ont été marquées par le HIV-FITC. Les résultats sont exprimés en pourcentage de cellules fluorescentes après comptage d'au moins 300 cellules. L'absence de marqueurs lymphocytaires a été vérifiée sur les cellules d'insectes avec les anticorps monoclonaux correspondants. Les lymphocytes T ont été utilisés comme témoins positifs.

The cells described in this Table were labelled with HlV-FITC. The results are expressed in percentage of fluorescent cells. No T cell markers were detected on the insect cells using indirect immunofluorescence with monoclonal antibodies. T lymphocytes were used as positive controls.

Pourcentage de cellules marquées par le virus

HIV Marqueurs

Lignées cellulaires Origine fluorescent lymphocytaires

Drosophila melanogaster Kco [7] Embryon 54 Absents

Drosophila melanogaster S2 [8] Embryon 27 Absents

Aedes aegypti [9] Premier stade 59 Absents

larvaire

Culex pipiens [9] Premier stade 30 Absents

larvaire

Témoin : lymphocytes T [6] Sang 9,6 CD4, CD3, CD2,

périphérique CD8, CD25

RÉSULTAT ET DISCUSSION. — 1. Présence du récepteur pour le virus HIV à la surface de cellules d'insectes. — Certaines lignées cellulaires de drosophiles et de moustiques fixent le virus fluorescent comme l'indique le tableau. En effet, en présence du HIV-FITC, une forte proportion d'entre elles fluorescent; ce qui prouve l'adsorption du virus à la surface des cellules et donc l'existence du récepteur du HIV (fig.l).

Nous avons vérifié que les cellules d'insectes ne possèdent pas à leur surface les antigènes lymphocytaires classiques tels : CD2; CD3; CD4 (pourtant souvent associé au récepteur du HIV [5]); CD8; CD25; CD20; HLA classe I et II et p2 microglobuline.

2. Infection de lignées cellulaires d'insectes par le virus HIV. — La lignée cellulaire de drosophile Kco est infectable. par le virus HIV comme le montre la figure 2 A. Aucun signal n'est détectable en sondant l'ADN des cellules témoins non infectées par le virus.

La présence du provirus HIV dans le génome de la lignée de drosophile Kco est confirmée par l'hybridation des « dots-blots » avec des sondes subgénomiques clonées dans le pliage m 13. Les régions LTR, gag, pol, env et F sont présentes dans le génome de la cellule de drosophile, 6 jours après l'infection par HIV, et absentes dans des cellules non infectées. Lorsque FADN des cellules Kco est extrait entre 10 jours et 2 mois après l'infection, aucune séquence virale ne peut y être détectée. Cette présence transitoire du virus ne semble pas être due à un effet cytopathogène; en effet, on ne peut observer dans les cultures ni léthalité évidente, ni la formation de cellules géantes multinucléées, ni modification de la croissance cellulaire. Il est cependant possible que les cellules infectées aient une croissance retardée et qu'elles soient ainsi éliminées.

Dans le cas de la drosophile, nous avons vérifié qu'il n'existait pas d'homologies de séquences significatives entre le virus HIV et les nombreux éléments transposables (rétroposons) contenus dans le génome de cet insecte. Les analyses de séquences ont été réalisées au Centre de Calcul de l'Institut Pasteur en utilisant l'ordinateur Data General MV 8000.


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3. Absence d'expression du virus HIV dans les lignées cellulaires d'insectes. — Il n'y a pas de production virale : aucune activité transcriptase inverse n'a pu être mise en évidence dans le surnageant des cultures concentré par ultracentrifugation [2]; des tentatives de démasquage du virus par une pyrimidine halogénée (IUDR) seule ou combinée à des hormones telles que l'hydroxycortisone et ecdystérone (l'hormone de mue des insectes) sont restées sans effet.

Il n'a pas été possible de mettre en évidence les antigènes viraux dans les cellules de drosophile infectées en utilisant des techniques d'immunofluorescence et de radioimmunoprécipitation d'extraits cellulaires marqués par la 35 S-cystéine et des sérums de malades présentant un SIDA. De même aucun ARN viral n'est détectable dans les cellules infectées de drosophile. Tous ces résultats montrent que la réplication du virus HIV est bloquée par un mécanisme intracellulaire indéterminé propre aux cellules d'insectes.

4. Présence de séquences d'ADN homologues à celles du virus HIV dans le génome d'insectes capturés en Afrique. — Les résultats précédemment décrits, nous ont conduits à nous interroger sur la possibilité de trouver dans les zones endémiques, des insectes porteurs de séquences génomiques homologues à celles du virus HIV et témoins de sa présence.

Des insectes de diverses espèces ont été capturés dans la région parisienne.

Aucun signal positif d'hybridation avec les sondes utilisées n'a été observé en prenant comme cible l'ADN d'insectes provenant de la région parisienne.

Parmi les insectes en provenance du Zaïre : moustiques, fourmis, mouches, mouches tsé-tsé, punaises, abeilles, blattes et fourmilions; seuls les ADN des mouches tsé-tsé, des

Fig. 1 Fig. 2

Fig. 1. — Immunofluorescence de cellules de drosophile marquées par le virus HIV conjugué à la fluorescéine. Fig. 1. — Immunofluorescence of drosophila cells labelled with HIV-FITC.

Fig. 2. — Hydridation d'ADN de cellules de drosophile infectées par le virus HIV et d'ADN extrait de blattes africaines ou parisiennes avec une sonde moléculaire spécifique du virus HIV. 10 ug d'ADN de haut poids moléculaire extrait de cellules Kco infectées ou non (fig. 2A) ou de blattes Periplaneta americana provenant du Zaïre ou de la région parisienne ( fig. 2 B) ont été déposés sur une feuille de nitrocellulose puis hybrides avec une sonde moléculaire du HIV dans les conditions précédemment décrites.

Fig. 2. — Hybridization of DNA from drosophila cells infected or not with HIV; and from african or parisian cockroaches. 10 ug of DNA from Kco cells (Fig. 2 A) or Periplaneta americana (Fig. 2B) were doted on to nitrocellulose membrane and hybridized with 32P labelled HIV probe under stringent conditions.


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blattes et des fourmilions possèdent des séquences homologues à FADN du virus HIV. La figure 2B montre, par exemple, le signal obtenu après hybridation avec FADN d'une blatte du Zaïre; et l'absence de signal avec l'ADN d'une blatte européenne.

A partir de l'ADN extrait de tiques, de punaises et de moustiques capturés à Bangui, nous n'avons obtenu de signal d'hybridation qu'avec l'ADN de tiques récoltées sur des dépouilles de bovidés aux abattoires de Bangui. L'ADN des insectes présentant un signal d'hybridation avec la méthode des « dots-blots » a été digéré par diverses enzymes de restriction et analysé par « Southern-blots ». Les profils d'hybridation obtenus lors de résultats préliminaires non présentés ici sont différents de ceux précédemment observés à partir des différents isolats du virus HIV déjà étudiés.

CONCLUSION. — La démonstration que des cellules d'insectes, dépourvues de tout marqueur de surface de type lymphocytaire puissent fixer le virus HIV, permet d'affirmer que la molécule CD4 n'est pas la seule capable d'adsorber ce virus. De plus, le fait que des cellules d'insectes, ayant intégré le provirus HIV dans leur génome n'expriment aucune activité virale suggère la présence de facteur(s) intracellulaire(s) capable(s) de réguler la réplication du virus.

Enfin la présence de séquences homologues au virus HIV dans le génome d'insectes capturés au Zaïre ou en République centrafricaine, zone endémique du virus, renforce l'idée d'une possibilité de transmission du SIDA par cette voie et de la constitution d'un réservoir naturel pour le virus ([10], [11]), bien que les données épidémiologiques ne confirment pas cette thèse.

Nous remercions pour leur discussion critique les Dr Best Belpomme, R. Bassin, du National Cancer Institute à Bethesda, P. Luciw et M. Gardner de l'Université de Californie, Davis, P. Sonigo et L. Montagnier, Institut Pasteur.

Nous avons bénéficié de l'expérience de J. M. Claverie pour les recherches de séquences sur ordinateur et de B. Pajot, École normale supérieure de Fontenay pour l'identification des Insectes capturés et M. Bourrois, Laboratoire de Génétique moléculaire à Strasbourg et J. F. Charles, Institut Pasteur pour les lignées cellulaires et leur milieu et S. Wain-Hobson pour les clones moléculaires du HIV.

Des soutiens financiers de la Ligne nationale française contre le Cancer, de l'Institut Pasteur et des diverses associations contre le SIDA nous ont permis de mener à bien ces travaux.

Reçue le 21 août 1986.

RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES

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Institut Pasteur, 28, rue du Docteur-Roux, 75724 Paris Cedex 15;

J.-L. B. : Laboratoire de Zoologie, E.R.A. n° 615, Université Paris-VI,

11, quai Saint-Bernard, 75230 Paris Cedex 05;

A. G. : Institut Pasteur, Bangui, République centrafricaine;

L. T. : Institut national de Recherche biomédicale, Kinshasa, Zaïre.


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ZOOLOGIE. —Description d'un Crabe cavernicole aveugle de Nouvelle-Bretagne (Papouasie Nouvelle-Guinée), Trogloplax joliveti gen. nov. sp. nov., et établissement d'une sous-famille nouvelle, Trogloplacinae subfam. nov. Note de Danièie Guinot, présentée par Théodore Monod.

La découverte en 1985, dans une grotte karstique continentale de Nouvelle-Bretagne, au bord d'un cours d'eau souterrain, de trois individus d'un Crabe montrant des adaptations très poussées à la vie souterraine (régression des structures oculaires, dépigmentation du corps, gracilité et allongement des appendices thoraciques) suscite la description de Trogloplax joliveti gen. nov. sp. nov. Le fait le plus marquant est que ce Crabe n'appartient à aucun des deux groupes de Brachyoures ayant des représentants cavernicoles : les Crabes d'eau douce d'une part (Polamoidea sensu lato) et les Crabes marins Grapsidae Sesarminae d'autre part. L'établissement d'une sous-famille Trogloplacinae subfam. nov. est nécessaire, au sein des Goneplacidae sensu lato. Ce vrai Crabe troglobie aveugle semble dériver non pas d'un ancêtre terrestre ou d'eau douce mais être issu d'un stock typiquement marin.

ZOOLOGY. — Description of a troglobitic blind Crab from New Britain (Papua New Guinea), Trogloplax joliveti gen. nov. sp. nov., and definition of a new subfamily, Trogloplacinae subfam. nov.

During 1985 the discovery in a continental karst cave of New Britain, near a subterranean river, of three specimens of a Crab exhibiting obvious adaptations to the troglobitic existence (reduced eyes, reduction in pigmentation, slenderness and length of the walking legs) raises up the description of Trogloplax joliveti gen. nov. sp. nov. The interesting fact is that this Crab does not belong to the typical Brachyura with cavernicolous members, namely on the one hand the classic freshwater Crabs (Potamoidea sensu lato) and on the other hand the marine Grapsidae Sesarminae. The creation of a subfamily Trogloplacinae subfam. nov. is necessary, inside the Goneplacidae sensu lato. This true troglobitic blind Crab seems to be not derivated from a terrestrial or freshwater ancestor but issued from a typical marine stock.

Lors de l'expédition nationale « Antipodes 1985 » de la Fédération française de Spéléologie en Papouasie Nouvelle-Guinée, plus précisément en Nouvelle-Bretagne [1], l'équipe « Niugini 85 » a exploré sur cette île le karst de la chaîne Whiteman au nord-est de Kandrian. Dans une grotte appartenant au système souterrain d'Arrakis, située à 70 km environ à l'intérieur des terres et dont l'entrée se trouve à une altitude de 650 m, M. Philippe Jolivet a trouvé, au bord d'un cours d'eau, sur un banc de sable, à 300 m de l'entrée la plus proche, trois spécimens d'un Crabe nouveau. A l'endroit du prélèvement appelé affluent des Arkonnens, l'eau était à une température de 20,8°C; après analyse, elle s'est révélée être douce, plate : cette eau (débit : 20 l/s) n'est donc guère différente de celle qui circule dans les rivières épigées du territoire karstique avoisinant.

Trogloplax joliveti gen. nov. sp. nov. représente une novation par rapport à ce que l'on connaît chez les Crustacés Décapodes Brachyoures, aussi bien parmi les formes marines, saumâtres et d'eau douce que parmi les rares formes cavernicoles déjà répertoriées. Par ses remarquables adaptations morphologiques à la vie souterraine et par son appartenance probable à un stock d'origine marine, le genre Trogloplax pose chez les Brachyoures un problème à la fois taxonomique et biologique.

Sous-famille Trogloplacinae subfam. nov. Diagnose. — Corps peu épais, avec la région latéro-ventrale renflée. Carapace plus large que longue. Test mince. Front sans encoche médiane ni angles latéro-externes. Pas d'encoche sur le bord orbitaire. Septum interantennulaire présent. Antennules repliées transversalement dans les fossettes. Pédoncules oculaires courts et réduits, insérés profondément dans l'orbite. Epistomc triangulaire. Pas d'orifice efférent visible. Cadre buccal quadratique, non élargi antérieurement. Pas de crêtes endostomiennes. Mxp3 courts et trapus, fermant presque complètement le cadre buccal. Carpe de mxp3 inséré à l'angle antéro-externe du mérus; palpe développé. Exopodite avec flagelle. Plastron sternal très

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élargi, avec les sutures 4/5 à 7/8 interrompues. Partie de sternité 8 visible, intercalée entre l'abdomen et la coxa de P5, avec suture supplémentaire. Pénis long, logé dans une gouttière, laissé à découvert proximalement puis recouvert par le sternité 8 et débouchant en position sternale. Cavité sterno-abdominale très profonde. Abdomen avec les segments 3-5 soudés. Appareil bouton-pression de type classique. Orifice génital femelle supposé (en l'absence de femelles) sternal, sous forme de vulve, Chélipèdes puissants mais assez courts. Hétérochélie pour les deux chélipèdes, qui ont une forme analogue; hétérodontie faible. Doigts cultriformes. Pattes ambulatoires grêles et allongées. Pli $ développé, subdroit, à apex non ornementé. P12 $ long, avec le flagelle plus long que le pédoncule.

Genre Trogloplax gen. nov. Étymologie du nom générique : du grec xpày^ri, trou, et du grec iîku.%, plaque, carapace, par allusion à la carapace et autres caractères qui apparentent ce Crabe aux Brachyoures Goneplacidae ayant la désinence plax dans leur nom.

Espèce type. — Trogloplax joliveti sp. nov. Genre du nom générique. — Féminin.

Diagnose. — Carapace aux contours arrondis, rétrécie antérieurement, sans angles marqués. Tégument très mince et transparent, dépigmenté. Bord antéro-latéral long, passant sans angle ni dent au bord postéro-latéral, lequel est effacé. Face dorsale déclive dans la région antérieure, lisse, glabre, sans aréolation ni ornementation : sillon branchio-cardiaque seul bien marqué. Front large, défléchi. Orbites extrêmement profondes; bords supra et infra-orbitaires sans encoches. Pédoncules oculaires courts et épais, remplissant entièrement l'orbite et très enfoncés, donc peu mobiles. Cornée sans facettes ni pigment distincts. Plastron sternal élargi. Disposition tout à fait particulière (pl, II, fig. D) au niveau du sternite 8 (disposition sternitrème). Abdomen très large, de sept segments, les 3-4-5 étant soudés. Premier, pléopode sexuel mâle assez fort, avec une large ouverture et peu ornementé. P12 <? plus développé que le PU $, avec le flagelle plus long que le pédoncule. Chélipèdes très courbés, se dressant verticalement le long des parois latérales de la carapace. Carpe des deux chélipèdes avec l'angle interne prolongé par une épine large, aplatie et allongée. Doigts incurvés, minces, en lame de ciseaux (hétérodontie faible). Pattes ambulatoires cylindriques, grêles, démesurément allongées.

Trogloplax joliveti sp. nov. (pl I, II) Étymologie de l'espèce : dédiée à M. Philippe Jolivet, son collecteur spéléologue.

EXPLICATIONS DES PLANCHES

Planche I

Fig. A-E. — Trogloplax joliveti gen. nov. sp. nov., Nouvelle-Bretagne, massif des Whiteman Range, dans la grotte « Système d'Arrakis », sur un banc de sable au bord d'un cours d'eau. A, reconstitution de l'holotype à carapace molle, S 16x21 mm, tous les appendices, sauf PI et P2 gauches et P3 droit, étant détachés (MP-B12793); B, carapace, plus dure du paratype, #20x27 mm, détachée du corps (MP-B12794); C, pinces du paratype, vue dorsale (à gauche, grand chélipède; à droite, petit chélipède); D, face interne du grand chélipède : à gauche, du paratype; à droite, de l'holotype; E, id., en haut, de l'holotype; en bas, du paratype.

Fig. A-E. — Trogloplax joliveti gen. nov. sp. nov., New Britain,Whiteman Range, cave "System of Arrakis", on a sand-bank near a river. A, reconstitution of the holotype with a soft tegument, <J 16x21 mm, all the appendages (except left PI and P2 and right P3) being disjoined from the carapace (MP-B12793); B, carapace, less soft, of the paratype, J 20x27[mm, separated from thebody (MP-B12794); C, chela of the paratype, dorsal view (at left, the large cheliped; at right, the small cheliped); D, internai face of the large cheliped: at left, of the paratype; at right, of the holotype; E, internai face of the large cheliped: above, of the holotype, below,of the paratype.



PLANCHE II/PLATE II


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Planche II

Liste des abréviations : b.p, bouton de l'appareil bouton-pression; c,s, crête entourant le telson; cx4, cx5, coxa de P4, de P5; l.m, ligne médiane; p, pénis; p.s, partie non recouverte du pénis; s.s, suture supplémentaire sur le sternité 8; 4-8, sternites thoraciques 4 à 8; 4/5-7/8, sutures sternales thoraciques4/5 à 7/8.

List of the abbreviations: b.p, button of the locking mechanism of the abdomen; c.s, sternal ctest surrounding the telson; cxA, cx5, coxa of PA, coxa of P5; l.m, median line; p, pénis; p.s, discovered part of the pénis; s.l, additional suture on the sterilite 8; 4-8, thoracic sternites A to 8; 4/5-7/8, sternal thoracic sutures 4/5 to 7/8.

Fig. A-G. — Trogloplax joliveti gen. nov. sp. nov., Nouvelle-Bretagne, Whiteman Range, « Système d'Arrakis ». A, C, F, F1, G : paratype, (J20x27 mm (MP-B12794); B, D, E: holotype, "<J 16 x 21 mm (MP-B12793). A, profil (Gx2,7); B, moitié antérieure, vue ventrale (Gx5,5); C, plastron sternal (Gx3,8); D, région coxo-sternale au niveau du pénis (Gx 6,5); E, Pl1 et P12 3 in situ, le P12 ayant été trouvé inséré à l'intérieur du premier (G x 14); F, Pl1 en entier (Gx 14); F1, id., apex (G x 27); G, P12 (G x 14):

Fig. A-B. — Trogloplax joliveti gen. nov. sp. nov., New Britain, Whiteman Range, cave « System of Arrakis ». A,

C, F, Fl, G, paratype, <S 20 x 27 mm (MP-B1279A);. B, D,E, holotype, S 16x21 mm(MP-B12793). A, profile of the carapace (M x 2.7); B, half anterior part, ventral view (M x5.5); C, sternal plate (M x 3.8);

D, coxo-sternal region near the penis (Mx 6.5); E, Pll and P12 $ in situ, the Pl2 being inserted inside the Pll (Mx 14); F, Pl\, entire (Mx 14); Fl,id., apex(Mx27); G, P12 (Mxl4).

Matériel. — Papouasie Nouvelle-Guinée; province : Nouyelle-Bretagne, massif des Whiteman Range, zone de Kandrian; Cavité : système d'Arrakis; altitude de l'entrée: environ 650 m. Capture à l'endroit appelé « Affluent des Arkonnens » (distance de l'entrée la plus proche : 300 m), sur un banc de sable au bord d'un cours d'eau : holotype, ^16x21 mm, carapace molle et pattes détachées (sauf P1 et P2 gauches et P3 droit) (MP-B12793), paratype, $ 20 x 27 mm (carapace détachée du corps et pattes séparées) et petit paratype représenté par sa carapace 5x8,5 mm et ses appendices détachés (MP-B12794).

Description. — Carapace (pl. I, fig. A, B) ovalaire transversalement. 1 Face dorsale nue, non aréolée, au tégument mince et décoloré. Bord antéro-latéral (pl. Il, fig. A) surmonté par une carène constituée d'un bourrelet plus coloré, interrompu; ce même bourrelet le long du bord orbitaire et du front, et présent également sur le plastron sternal tout autour de la partie de la cavité recevant le telson. Yeux à pédoncule réduit, sans facettes cornéennes distinctes et sans trace visible de pigment. Mxp3 courts et larges; mérus saillant à l'angle antéro-extêrne (pi. IL fig. B). Chélipèdes (pl. I, fig. A, C-E) glabres, disymétriques par la taille mais semblables par la forme. Sur les deux chélipèdes, coaptation du carpe avec la main sous forme d'une dent carpienne qui parcourt toute la longueur de la main jusqu'à la dent distale du propode en ne laissant qu'un léger intervalle quand la pince se replie, ce qui aboutit à la formation d'une sorte de deuxième pince. Bord inférieur du propode garni proximalement d'une dent crochue et de forme irrégulière, un peu ondulé, comme coapté avec les dents du mérus. Main profondément excavée. Doigts cultriformes, similaires sur les deux chélipèdes, sauf les dents molaires du bord préhensile plus accentuées sur le grand chélipède. Pattes ambulatoires (pl. I, fig. A) glabres, inermes, très longues, surtout P3 et P4, avec tous les articles considérablement allongés; dactyles incurvés. Pl1 -S (pi. Il, fig- F, Fl), P12 ô* (pl. II, fig. G). Chez le spécimen holotype, P12 inséré à l'intérieur du Pli $ (pl. II, fig. E).

Les Brachyoures ne comptent qu'un petit nombre de vrais représentants troglobies ([2], [3]). Un premier type de cavernicoles appartient tout naturellement aux Potamoidea sensu lato [4], les seuls Crabes dits d'eau douce, complètement indépendants du milieu marin puisqu'ils ont éliminé la phase planctonique de leur vie larvaire. De rares espèces, pas plus de six-sept décrites, parfois complètement modifiées (décoloration du tégument, absence de cornée, réduction ou disparition du pigment oculaire, gracilité des appendices locomoteurs) ont été trouvées dans des grottes à Bornéo : Cerberusa caeca et C. tipula


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Holthuis [5], et en Nouvelle-Guinée : Holthuisana alba Holthuis [6], ainsi que dans des grottes du Nouveau Monde au Mexique et au Guatemala : notamment trois espèces du genre Typhlopseudothelphusa Rioja ([7], [8]). Ces Potamoidea hypogés aveugles ont un développement direct. En ce qui concerne le deuxième groupe de Crabes connus pour leur vie dans un environnement souterrain et leurs adaptations plus ou moins précises à ce biotope, il s'agit de genres marins typiquement épigés, dont la plupart des espèces habitent la mer et aussi les eaux saumâtres, et dont certains représentants ont pénétré plus ou moins profondément dans les grottes et, parfois, se sont inféodées au système souterrain, jusqu'à modifier leurs phases larvaires, qui croissent en eau douce. C'est dans la famille des Grapsidae, sous-famille des Sesarminae et plus précisément dans le genre Sesarma Say que se rencontrent, en région tropicale, des formes troglophiles et même quelques rares espèces ayant colonisé les grottes. En Indonésie et surtout à la Jamaïque ([9], [10]), quelques Sesarma, plus ou moins confinées dans l'habitat souterrain, exhibent les modifications morphologiques communes à tous les peuplements cavernicoles et ont aussi une vie larvaire abrégée. A la Jamaïque [11] il semble que l'évolution des Sesarma cavernicoles se soit faite plutôt à partir de formes installées dans les rivières qu'à partir de formes déjà devenues terrestres. À noter que les Gecarcinoidea terrestres et les Hymenosomatoidea complètement acclimatés dans les lacs ou dans les montagnes n'ont donné aucun représentant (connu) dans le monde souterrain.

Le genre Trogloplax gen. nov. n'est ni un Crabe d'eau douce (Potamoidea sensu lato), ni un Grapsidé Sesarminé. Son faciès en fait un vrai troglobie. Ses caractères morphologiques (plastron sternal élargi, sutures 4/5 à 7/8 interrompues, portion de sternité 8 intercalée entre les coxae et avec une suture supplémentaire) le situeraient parmi les Goneplacidae sensu lato [12], Crabes essentiellement marins, auprès de quelques genres à yeux défectueux classiquement attribués aux Rhizopinae Stimpson, 1858. Néanmoins, le genre Trogloplax ne présente aucune affinité avec le genre Rhizopa et les quelques genres qui, seuls, constituent les Rhizopinae s. s. [13]. Les liens phylogénétiques des Trogloplacinae subfam. nov. sont peut-être à chercher dans le groupement hétérogène des Chasmocarcininae Serène, 1964 : une révision de ces Crabes mal connus est en cours. Reçue le 9 juin 1986.

RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES

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Laboratoire de Zoologie (Arthropodes) du Muséum national d'Histoire naturelle,

61, rue Buffon, 75231 Paris Cedex 05.


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PHYSIOLOGIE ANIMALE. — Effet de la ryanodine sur T activité électrique et mécanique des fibres atriales de Grenouille. Note de Christine Pater et Martin-Pierre Sauviat, présentée par Pierre Buser.

L'effet de la ryanodinè sur le potentiel d'action, le courant entrant lent et l'activité mécanique des fibres atriales de Grenouille a été étudié à l'aide de la technique de la double partition de saccharose. Il a été montré que la ryanodine réduit l'ainplitude du courant entrant lent, entraîne une accumulation de Ca dans les cellules, altère notablement la composante tonique de la tension.

ANIMAL PHYSIOLOGY. — Effect of ryanodine on electrical and mechanical activity of frog atrial fibres.

The effect of ryanodine on the action potential, slow inward curreht and mechanical activities of frog atrial fibres was studied by means of the double suer ose gap technique. Ryanodine was sliown to reduce the amplitude of the slow inward current, to cause an intracellular Ca accumulation and to decrease the tonic component of the tension.

INTRODUCTION. — La ryanodine est un alcaloïde naturel qui exerce une action inotrope négative sur le muscle cardiaque de Mammifère ([4], [11]). Cette substance inhibe la libération de Ca par le réticuhim sareoplasmique (RS) ([1], [2], [3], [9]); ralentit la phase d'inactivation du courant entrant lent des myocytes de Rat [5]; réduit le plateau et là tension des fibres de Purkinje de Chat et du muscle papillaire de Furet [11]; se fixe sur un site de haute affinité situé dans la fraction lourde du RS des préparations du muscle cardiaque de Mammifère [7]. La ryanodine étant considérée comme un inhibiteur spécifique de la libération du Ca par le RS, la présente Note a pour but d'en étudier les effets sur le potentiel d'action (PA), le courant entrant lent et l'activité mécanique des fibres atriales de Grenouille dont le développement de la composante tonique de la tension est attribué à un relâchage du Ca par les structures du RS sous l'effet de la dépolarisation [ 10].

MATÉRIEL ET MÉTHODE. — Les expériences sont effectuées à 8-10°C sur des,trabécules isolées de la région sino-auriculaire du coeur de Grenouille (75 à 150 um de diamètre, 2 à 4 mm de longueur) étudiées en courant et enpotentiel imposé à l'aide de la technique de la double partition de saccharose [8]. L'activité mécanique est mesurée sur la portion de préparation placée dans le compartiment test de la cuve expérimentale à l'aide d'un système de jauge de contrainte (Pixie 8101) appliqué sur la fibre par l'intermédiaire d'un fin levier dé verre. La composition du milieu de Ringer (mM) est la suivante : NaCl : 110,5; KCl : 2,5; CaC12 : 2; tampon Hepes : 5; pH 7,3. La tétrodotoxine (TTX; inhibiteur de la conductance sodium) et le chlorure de cadmium (inhibiteur de la conductance Ca lente) sont respectivement utilisés aux concentrations de 0,57 uM et 1 mM. Les courants transmerhbranaires considérés dans le présent travail correspondent à des courants nets mesurés au maximum de courant entrant pu au minimum de courant sortant à partir du zero de courant. Dans les relations Courant-potentiel de membrane, les courants sortants sont positifs; les dépolarisations correspondent à des; potentiels positifs comptés à partir d'un potentiel maintenu (HP). Les constantes de temps de là phase d'inactivation du courant lent et celles de la phase de relaxation de la contraction sont obtenues en reportant le logarithme de l'amplitude du signal considéré en fonction de sa durée. Les valeurs moyennes sont données ±SEM; n correspond au nombre d'expériences réalisées.

RÉSULTATS. — La figure (A) montre que la ryanodine (1 uM) diminue l'amplitude du plateau du PA sans altérer le potentiel de repos et la phase de dépolarisatiqn initiale. En potentiel imposé, là ryanodine (1 uM) inhibe partiellement (36,9+8 % à 0 mV, n = 6) le courant entrant lent (lient) transporté par les ions Ca enregistré dans la solution de Ringer TTX [fig. (B)]| sans modifier la cinétique de la phase d'inactivation du courant dont la constante de temps est 104 ms en absence et 102 ms en présence de ryanodine. Les relations courant-potentiel de membrane représentées dans la figure (C) indiquent que la ryanodine inhibe le courant entrant lent quelle que soit la valeur du potentiel de

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membrane éprouvé et déplace la région de pente positive de la relation courant-potentiel de membrane vers les potentiels plus négatifs. L'addition de Cd (1 mM) au milieu contenant l'alcaloïde bloque totalement lient et permet de déterminer le potentiel d'inversion apparent du courant lent comme étant le point d'intersection des courbes tracées en absence et en présence de Cd. La ryanodine déplace le potentiel d'inversion de 20 + 7 mV, n = 6 vers les potentiels plus négatifs. La figure (B) montre également que la ryanodine réduit l'amplitude du pic de tension (19 %) sans altérer la phase de relaxation dont la constante de temps demeure inchangée [340 ms dans la figure (B)]. Les relations tension-potentiel de membrane de la figure (D) indiquent que la réduction de tension observée en présence de ryanodine est modérée dans la région de la courbe comprise entre — 20 et + 30 mV correspondant au développement de la composante phasique de la tension (20,9 + 7,5 % à 0 mV, n = 6). Pour les dépolarisations supérieures à +30 mV correspondant au développement de la composante tonique de la tension, la réduction de l'amplitude de la tension est plus marquée (28,2+6,6 % à +70 mV, n=6).

DISCUSSION. — Les présents résultats montrent que la ryanodine exerce une action inhibitrice sur le courant entrant lent transporté par les ions Ca et l'activité mécanique

Effet de la ryanodine (1 uM; ©) sur l'activité électrique et mécanique des fibres atriales de Grenouille; (O) milieu de Ringer. (A) potentiel d'action. (B) courant entrant lent (tracé supérieur) et activité mécanique (tracé inférieur) déclenchés par une impulsion dépolarisante de 40 mV d'amplitude appliquée à partir d'un potentiel maintenu de — 40 mV enregistré, dans le milieu de Ringer TTX, (a) en absence, (b) en présence de ryanodine. (C) relations courant-potentiel de membrane tracées pour le courant entrant lent (lient) dans le milieu de Ringer TTX avant (O); (©) après application de la ryanodine (5 mn) et (A) après addition de Cd (1 mM) au milieu contenant l'alcaloïde (HP= — 40 mV). (D) relations tension-potentiel de membrane établies, dans le milieu, de Ringer TTX, avant (O) et après (©) 5 mn de traitement à la ryanodinè (HP = — 80 mV). La durée des impulsions était de 400 ms.

Effect of ryanodine (1 uM; @) on the electrical and mechanical aclivities of frog atrial fibres; (O) Ringer solution. (A) action potential. (B) slow inward carrent (upper trace) and mechanical activity (lower trace) which developped under a 40 mV depolarizing step applied from HP= — 40 mV in the absence (a) and in the présence (b) of ryanodine (1 uM) in the TTX-containing Ringer solution. (C) current-voltage relationships plotled for the slow inward current (I lent) recorded in the TTX-containing Ringer solution (O) before; (©) after 5 min. of ryanodine application and (A) 1 min. of Cd (1 mM) addition to the ryanodine containing solution (HP = — 40 mV). (D) Tension-potential relationships plotted, in the TTX-containing Ringer solution, before (O) and after (@) 5 min. of ryanodine treatment (HP = — 80 mV). The duration of the puise was 400 ms.


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des fibres atriales de Grenouille. Ils ne mettent pas en évidence de ralentissement de la cinétique de la phase d'inactivation du courant entrant lent sous l'effet de l'alcaloïde ainsi qu'il a été précédemment montré sur les myocytes de Rat [5]. Le déplacement du potentiel d'inversion du Courant lent vers les potentiels plus négatifs indique que l'alcaloïde entraîne une réduction notable du gradient electrochimique pour les ions Ca et suggère que des ions Ca s'accumulent à l'intérieur des cellules. Cette accumulation de Ca intracellulaire peut ainsi rendre compte de la réduction de courant lent observée dans nos expériences. La ryanodine réduit aussi l'amplitude du pic de tension sans modifier la phase de relaxation. Ces résultats indiquent que la ryanodine réduit la quantité de Ca disponible au niveau des myofilaments et n'affecte pas l'échange Nâ/Ca. L'observation selon laquelle la ryanodine entraîne une accumulation d'ions Ca à l'intérieur des cellules et réduit l'amplitude de la tension suggère que l'alcaloïde bloque le transport du Ca au niveau de structures intermédiaires ainsi qu'il a été récemment proposé pour les fibres de Purkinje de Chat et de Furet [11]. L'analyse des relations tension-potentiel de membrane indique que la ryanodine inhibe plus particulièrement la composante tonique de la tension. ■Cette composante dépend du potentiel de membrane et est attribuée à une libération du Ca à partir de réservoirs internes par la dépolarisation [10]. Le fait que la ryanodine soit considérée comme un inhibiteur spécifique des mouvements de Ca au niveau du RS suggère que les structures du RS sont directement impliquées dans le développement de la composante tonique de la tension. Les travaux de Page et Niedergerke [6] ont montré que le RS des fibres cardiaques de Grenouille consiste en un reseau de fins tabules dont les branches s'étendent aux régions périphériques de la cellule et se terminent en apposition proche de la surface interne de la membrane. Une telle structure peut rendre compte du phénomène d'accumulation de Ca intracellulaire responsable de la réduction de courant entrant lent observée dans nos expériences en présence de l'alcaloïde et supporte l'hypothèse que, chez la Grenouille comme chez le Mammifère, le site d'action dé la ryanodinè est localisé au niveau du R S.

Travail en partie réalisé à l'aide d'un contrat I.N.S.E.R.M. (CRE 835015).

Reçue le 17 mars 1986, acceptée après révision le 9 juin 1986.

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Laboratoire de Physiologie comparée et de Biomembrane et des Ensembles neuronnaux

associé au C.N.R.S., U.A. n° 1121, Université de Paris-XI,

Centre d'Orsay, 91A05 Orsay Cedex.



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NEUROBIOLOGIE. — Localisation des neurones cholinergiques dans le tronc cérébral inférieur chez le chat. Note de Kazuya Sakai, Pierre-Hervé Luppi, Denise Salvert, Hiroshi Kimura, Toshihiro Maeda et Michel Jouvet, présentée par Michel Jouvet, Membre de l'Académie.

En utilisant un anticorps monoclonal anti-choline acétyltransférase (ChAT), nous avons mis en évidence, dans le tronc cérébral inférieur du chat, quatre groupes principaux de neurones cholinergiques : (1) neurones des noyaux moteurs somatiques et viscéromoteurs spéciaux; (2) neurones viscéromoteurs. parasympathiques prégahglionnaires; (3) neurones du tegmentum ponto-mésencéphalique localisés dans l'area X (ou le noyau tegmental pédonculopontique), dans le noyau laterodorsalis tegmenti (Ldt) et dans le noyau du péri-locus coeruleus a (péri-a); et (4) neurones de la formation réticulée bulbaire, en particulier, des noyaux réticulés rhagnocellulaire (Me) et gigantocellulaire (Gc) adjacent.

NEUROBIOLOGY. — Localization of cholinergic neurons in the cat lower brain stem.

The localization of cholinergic neurons in the cat lower brain stem was determined immunocytochemically with a monoclonal antibody against choline acetyltransferase (ChAT), the acetyleholine synthesizing enzyme. ChAT-positive neurons were observed in four major cell groups: (1) cranial nerve motor and special visceromotor neurons; (2) parasympathetic preganglionic visceromotor neurons; (3) neurons locqted in the pontomeSehcéphalic tegmentum including area X (or pedunçulopontine tegmental nucleus), nucleus laterodorsalis tegmenti (Ldt) of Castàldi, and peri-locus coeruleus a (peri-a); and (A) neurons located in nucleus reticularis magnocellularis (Me) and adjacent nucleus reticularis gigantocellularis (Gc) of the medulla.

INTRODUCTION. — Malgré l'importance de l'acétyleholine (Ach) comme neurotransmetter central, la localisation des neurones cholinergiques est restée imprécise jusqu'à ces dernières années, faute d'une technique appropriée, à là fois sensible et spécifique. En effet, pour l'immunohistochimie de la choline acétyltransférase (ChAT), l'enzyme de synthèse de l'Ach, on a tout d'abord utilisé des anticorps polyclonaux. Or, il est très difficile d'obtenir une ChAT assez purifiée pour induire un anticorps très spécifique : plusieurs résultats contradictoires ont été rapportés au niveau du système nerveux central et on a mis en cause la pureté de l'antigène et la spécificité de la technique utilisée [1]. Dans un deuxième temps, certains groupes de chercheurs ont fait appel aux anticorps monoclonaux et ils ont ainsi réussi à localiser des neurones cholinergiques centraux chez le rat ([2]-[5]). Cependant chez le chat, l'animal expérimental utilisé dans la plupart des recherches sur le sommeil, il n'existe qu'une seule étude immunohistochimique, réalisée avec un anticorps polyclonal [6]. On connaît le rôle primordial des mécanismes cholinergiques du tronc cérébral inférieur dans la régulation du niveau de vigilance. Nous avons donc décidé de localiser les neurones cholinergiques de cette structure chez le chat.

MATÉRIEL ET MÉTHODES. — Des chats adultes ont été utilisés. Les animaux ont été sacrifiés par l'injection du sodium pentobarbital (Nembutal) et perfusés par voie intracardiaque avec 1 litre de Ringer-lactate héparine et ensuite avec 2,5 1 de fixateur contenant 4% de paraformaldéhyde, 0-0,5% de glutaraldéhyde et 0,2% d'acide picrique dans le tampon phosphate (0,1 M, pH7,4). Leur cerveau a été prélevé et surfixé 24-48 h dans un fixateur contenant 0,2% de paraformaldéhyde et 0,2% d'acide picrique. Après rinçage dans 30% de saccharose pendant 2-4 jours, des coupes sériées de 20-50 um ont été réalisées grâce à un cryostat ou à un vibratome. Les Coupes ont été classées dans une boîte en plastique subdivisée en casiers remplis de tampon phosphate contenant 0,9%NaCl, 0,1% Triton X-100 (PBS-T) et 0,1% de NaN3. La préparation et les caractéristiques de l'anticorps monoclonal anti-choline acétyltransférase (ChAT) que nous avons utilisé (Type I, Boehringer, Mannheim, GmbH, FRG) ont été décrits précédemment par Eckenstein et Thonen [2]. Pour mettre en évidence la ChAT, nous avons utilisé soit la technique indirecte de peroxydase-antiperoxydase (PAP) de Steriroerger et coll. [7], soit la technique indirecte de complexe avidine-biotine-peroxydase (ABC) de Hsu et coll.. [8]. Les coupes flottantes ont été incubées au moins une semaine dans le PBS-T pour augmenter la pénétration des agents immunocytochimiques. Les coupes ont ensuite été incubées pendant 5-7 jours à 4°C avec une agitation permanente dans l'anticorps anti-ChAT provenant d'un hybridome rat-souris (0,2-0,5 ug/ml PBS-T contenant

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0,1 % NaN3). Après avoir été rincées au moins trois fois pendant 1 h dans le PBS-T, les coupes ont été incubées soit dans l'immunoglobuline (IgG) de lapin anti-souris (DAKO; dilué au 1/1000), soit dans l'IgG de cheval anti-souris conjuguée à la biotine (Vector lab; dilué au 1/1000), 90-120 mn à la température ambiante ou une nuit à 4°C. Après rinçage, elles ont été incubées soit dans le complexe peroXydase-antiperoxydase de souris (Nordic Immunology; dilué au 1/1000), soit dans le complexe avidine-biotine-peroxydase (Vector lab; dilué au 1/250) 60-90 mn à la température ambiante ou une nuit à 4°C. Après rinçage, la réaction finale a été effectuée pendant 10-15 mn en présence de 0,02% 3,3-diaminobenzidine-4HCl, 0,6% nickel ammonium sulfate et 0,006% H202. Une fois rincées dans le tampon phosphate, les coupes ont été montées sur des lames gélatinées, séchées, puis déshydratées et, à la fin, couvertes de lamelles à l'aide de DePex. Certaines coupes ont été contrecolorées par le rouge neutre. Quelques animaux ont reçu de la colchicine (200 ug/20 ul) dans le ventricule latéral et dans le quatrième ventricule 24 h avant le sacrifice.

EXPLICATIONS DE LA PLANCHE

Fig. 1 a et b. — Localisation des neurones immunoréactifs à la Choline acétyltransférase (ChAT) dans le tronc cérébral inférieur (cercles noirs). La taille de ces neurones (très grande, grande, et moyenne) est représentée par trois tailles différentes de cercles.

Abréviations : 3, noyau oculomoteur, 4, noyau trochléaire; 5 M, noyau moteur du trijumeau; 5P, noyau sensoriel du trijumeau; 5ST, fiasceau trigéminal spinal; 6, noyau abducens; 6N, nerf abducteur; 7, noyau facial; 7 G, genou du nerf facial; 7N, nerf facial; 12, noyau hypoglosse; 12 N, nerf hypoglosse; A, noyau ambigu; a, locus coeruleus a; AP, area postrema; BC, brachium conjunctivum; Cun, noyau cunéiforme; CS, noyau du raphé central supérieur; DMV, noyau dorsal du vague; Gc, noyau réticulé gigantocellulaire; GR; noyau de Goll; 10, noyau olivaire inférieur; IP, noyau interpédonculaire; K-P, noyau de Kölliker-Fuse; LC, noyau du locus coeruleus; Ldt, noyau laterodorsalis tegmenti de Castaldi; Lld, Llv, noyaux dorsal et ventral du lemniscus latéral, respectivement; LR, noyau du cordon latéral; LSC, noyau du locus subcoeruleus; lvs, faisceau vestibulpspinal latéral; Me, noyau réticulé magnocellulaire; P, faisceau pyramidal; PBG, noyau parabigéminal; PbL, noyau parabrachialis lateralis; Pc, noyau réticulé parvocellulaire; péri-ot; péri-locus coeruleus a; PH, noyau praepositus hypoglossi; Poc, Poo, noyaux reticularis pontis caudalis et oralis, respectivement; PR, noyau réticulé paramédian; R, noyau rouge; RD, noyau dorsal du raphé; RFN, noyau rétrofacial; RM, Rob, Rpa, noyaux du raphé magnus, obscurus et pallidus, respectivement; rs, faisceau rubrospinal; RT, noyau du rétrotrijumeau; Rtp, noyau reticularis tegmenti pontis; SOL, SOM, noyaux latéral et médian de l'olive supérieur, respectivement; s, faisceau solitaire; T, noyau du corps trapézoïde; TB, corps trapézoïde; TD, TV, noyaux dorsal et ventral de Gudden, respectivement; VIN, VL, VM, noyaux vestibulaires inférieur, latéral et médian, respectivement; X, area X.

Fig. 1 a and b. — Localization of choline acetyltransferase (ChAT)-immunoreactive cell bodies (circles) in the cat lower brain stem. Large, medium, and small circles indicate very large, large, and medium sized ChAT-positive neurons, respectively.

Abbreviations: 3, oculomotor nucleus; 4, trochlear nucleus; 5 M, motor trigeminal nucleus; 5.P, sensory trigeminal nucleus; 5ST, spinal trigeminal tract; 6, abducens nucleus; 6N, abducens nerve; 7, facial nucleus; 7 G, genu of the facial nerve; 7 N, facial nerve; 12, hypoglossal nucleus; 12 N, hypoglossal nerve; A, nucleus ambiguus; a, nucleus locus coeruleus a; AP, area postrema; BC, brachium conjunctivum; Cun, cuneiform nucleus; CS, nucleus raphe centralis superior; DMV, dorsal motor nucleus of the vagus; Gc, nucleus reticularis gigantocellularis; GR, gracile nucleus; 10, inferior olive; IP, interpeduncular nucleus; K-F, Kölliker-Fuse nucleus; LC, nucleus locus coeruleus; Ldt, nucleus laterodorsalis tegmenti; Lld, Llv, dorsal and ventral nucleus ofthe latéral lemniscus, respectively; LR, lateral reticular nucleus; LSC, nucleus locus subcoeruleus; lvs, direct latéral vestibulospinal tract; Mc, nucleus reticularis magnocellularis; P, pyramidal tract; PBG, parabigeminal nucleus; PbL, nucleus parabrachialis lateralis; Pc, nucleus reticularis parvocellularis; peri-a; peri-locus coeruleus a; PH, nucleus praepositus hypoglossi; Poc, Poo, nucleus reticularis pontis caudalis and oralis, respectively; PR, paramedian reticular nucleus; R, red nucleus; RD, nucleus raphe dorsalis; RFN, retrofacial nucleus; RM, Rob, Rpa, nucleus raphe magnus, obscurus and pallidus, respectively; rs, rubrospinal tract; RT, retrotrigeminal nucleus; Rtp, nucleus reticularis tegmenti pontis; SOL, SOM, lateral and medial nucleus of the superior olive, respectively; s, solitary tract; T, nucleus of the trapezoid body; TB, trapezoid body; TD, TV, dorsal and ventral nucleus of Gudden, respectively. VIN, VL, VM, inferior, lateral and medial vestibular nucleus, respectively; X, area X.




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RÉSULTATS. — 1. Neurones cholinergiques des noyaux moteurs somatiques et viscéromoteurs spéciaux. — Nous avons mis en évidence des neurones immunoréactifs à la ChAT dans tous les noyaux moteurs des nerfs crâniens (III-VII et XII) et dans les parties somatique et viscérale du noyau ambigu. Ces neurones somatiques sont multiformes et de grande taille (30-70 um). Ils ne se localisent pas chez le chat dans des noyaux bien définis mais aussi dans les structures correspondant aux noyaux accessoires ([9], [10]) :

(a) noyau accessoire du trijumeau, situé juste ventralement au noyau moteur du trijumeau;

(b) noyau accessoire abducens, situé médialement au nerf facial et dorsalement au noyau olivaire supérieur; et (c) noyau accessoire facial, situé, rostralement, juste dorsalement au noyau accessoire abducens, et, caudalement, juste dorsalement au noyau facial. La

Fig. 2. — Mise en évidence des neurones immunoréactifs à la choline acétyltransférase dans la région parabrachiale du tegmentum mésencéphalique (A, a; area X ou noyau tegmental pédonculopontique) et dans le noyau réticulé magnocellulaire (Me) du bulbe (B, b). Coupes de 50 um au vibratome. Echelles : A, B, 100 um; a, b, 50 um.

Fig. 2. — Photomicrographs showing choline acétyltransférase (ChAT)-immunoreactive neurons in the parabrachial région of the mesencephalic tegmentum (area X or pedunculopontine tegmental nucleus) (A, a) and in the nucleus reticularis magnocellularis (Me) of the medulla (B, b). 50 um vibratome sections. Bars: A, B, 100 um; a, b, 50 um.


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localisation des neurones « cholinergiques » des noyaux accessoires facial et abducens semble correspondre en partie au noyau rétro trijumeau (RT) défini par Berman (11) (fig. 1 a-b).

2. Neurones viscéromoteurs parasympathiques préganglionnaires. — Des neurones immunoréactifs à la ChAT, ronds, ovales ou fusiformes, de taille moyenne (12-18 x 22-30 µm) sont observés dans les noyaux parasympathiques préganglionnaires tels que le noyau d'Edinger-Westphal et le noyau dorsal du vague. Le même type de neurones marqués se rencontre dans la formation réticulée bulbaire dorsolatérale (n. réticulé parvocellulaire, Pc) située ventralement au noyau vestibulaire médian (VM) et médialement au noyau du trijumeau inférieur (5ST) (fig. 1b; P7-P11). La partie rostrale de cette population de neurones cholinergiques pourraient correspondre au noyau salivaire supérieur et la partie caudale au noyau salivaire inférieur ([12], [13], [14]). On trouve des neurones présentant les mêmes caractéristiques morphologiques que les neurones viscéromoteurs parasympathiques décrits ci-dessus dans certaines régions ponto-bulbaires, à savoir : (a) une région située ventromédialement au noyau ventral du lemniscus latéral (P3); (b) une région située autour du noyau olivaire supérieur (P4-P6); (c) une région située autour du corps trapézoïde (P4-P5); (d) une région située ventromédialement au noyau du praepositus hyglossi (P9-P10); et (e) une région située le long des nerfs de l'hypoglosse (P11-P15).

3. Neurones cholinergiques du tegmentum ponto-mésencéphalique. — Au niveau des plans A2-P1, des neurones multipolaires de grande taille, immunoréactifs à la ChAT, sont localisés dans « l'area X », zone péribrachiale, que nous avons définie précédemment chez le chat [15] (fig. 2 A, a). Des neurones marqués sont également observés dans le noyau laterodorsalis tegmenti (Ldt) de Castaldi ainsi que dans la partie rostrale et médiane du locus coeruleus a (LCa) et dans le péri-LCa adjacent (fig. 1 a). Au niveau de P3-P4, nous avons trouvé une population de neurones ronds ou ovales, de taille relativement petite (15-20 µm), dans les noyaux parabrachialis lateralis (PbL) et medialis (PbM), le noyau du locus subcoeruleus (LSC). et le noyau de Kölliker-Fuse.

4. Neurones cholinergiques de la formation réticulée bulbaire ventromédiane. — Alors qu'on ne trouve de neurones immunoréactifs à la ChAT, ni dans les noyaux réticulés pontiques (n. reticularis pontis oralis et caudalis), ni dans la partie rostrale des noyaux réticulés gigantocellulaire (Gc) et magnocellulaire (Me), une population de neurones de grande taille est observée dans la partie moyenne et caudale du Me ainsi que dans le Gc adjacent (P8-P11). La morphologie de ces neurones est similaire à celle des neurones cholinergiques du tegmentum pontique, en particulier de l'area X (fig. 2). Il faut noter également la présence d'un petit groupe de neurones dans la partie rostrale du noyau réticulé latéral de Meessen et Olszewski (P8).

DISCUSSION. — Aucune immunoréactivité n'a été observée en l'absence de l'anticorps anti-ChAT. De plus, nous avons pu mettre en évidence des neurones immunoréactifs à la ChAT dans tous les noyaux d'origine des nerfs moteurs crâniens ainsi que dans les noyaux parasympathiques préganglionnaires, que l'on sait « cholinergiques ». En accord avec des résultats précédents obtenus chez le rat ([3], [4], [16], [17]) et chez le chat [6], nous avons également trouvé des neurones immunoréactifs à la ChAT dans les structures tegmentales ponto-mésencéphaliques (l'area X, le Ldt et le péri-LCa). L'ensemble de ces résultats montre la validité de la technique immunohistochimique que nous avons employée.


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Sur le plan technique, il faut noter qu'une longue préincubation (quelques semaines) des coupes dans le PBS-T est souvent nécessaire pour la visualisation complète des neurones cholinergiques du tronc cérébral inférieur du chat normal, alors qu'une telle incubation n'est nullement nécessaire pour celle des neurones cholinergiques télencéphaliques (e. g., des neurones du noyau basai de Méynert). Ceci suggère que certains neurones cholinergiques du tronc cérébral inférieur contiennent comparativement peu d'enzyme de synthèse de l'Ach et que, de ce fait, le processus de pénétration des agents immunohistochimiques joue un rôle critique dans leur mise en évidence. L'utilisation de la colchicine peut résoudre ce problème de sensibilité/Nous avons également trouvé que la technique du complexe avidine-biotine-peroxydase (ABC) est plus sensible que celle, devenue classique, de peroxydase-anti-peroxydasè (PAP).

Nous avons découvert dans le tronc cérébral inférieur plusieurs groupes de neurones cholinergiques jamais décrits jusqu'à présent : (1) des neurones situés juste ventralement au noyau moteur du trijumeau correspondant probablement au noyau accessoire du trijumeau; et (2) des neurones de type viscéromoteur situés : (a) ventromédialement au noyau ventral du lemniscus latéral; (b) autour du noyau olivaire supérieur; (c) autour du corps trapézoïde; (d) situés ventromédialement au noyau praepositus hypoglossi; et (e) le long des nerfs hypoglosses.

Nous avons mis en évidence des neurones immunoréactifs à la ChAT dans la formation réticulée bulbaire, en particulier le noyau réticulé magnocellulaire (Mc) et le noyau réticulé gigantocellulaire (Gc) adjacent. Ce résultat est en accord avec une étude réalisée chez le chat par Kimura et coll. [6]. Par contre, chez le rat, de tels neurones n'ont pas été mis en évidence avec des anticorps monoclonaux anti-ChAT ([3], [4], [16]). Au niveau du tegmentum pontique dorsal, nous avons trouvé de nombreux neurones immunoréactifs à la ChAT dans les noyaux parabrachialis lateralis (PbL) et medialis (PbM), le noyau du locus subcoeruleus (LSC) et le noyau de Kölliker-Fuse (K-F). La plupart de ces neurones sont ovales ou ronds et de petite taille. Ces caractéristiques morphologiques les différencient nettement des neurones cholinergiques situés plus rostralemerit (l'area X, le Ldt et le péri-LCa). La présence de tels neurones n'a pas été décrite chez le rat, mais elle a été démontrée chez le chat par Kimura et coll. [6],

Nous avons pu mettre en évidence dès neurones contenant l'enzyme de synthèse de l'acétyleholine, non seulement dans des structurés nerveuses motrices ou autonomes, mais aussi dans des structures dont la signification fonctionnelle est encore mal connue. Nos études neuroanatomiques et neurophysiologiques antérieures nous ont permis de suggérer pour celles-ci un rôle essentiel dans l'apparition du sommeil paradoxal [18]. Là recherche des efférences de ces neurones cholinergiques particuliers permettra de mieux comprendre cet aspect fonctionnel du système cholinergique du tronc cérébral inférieur.

Reçue le 30 juin 1986.

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K. S., P. H. L., D. S. et M. J. : Département de Médecine expérimentale,

I.N.S.E.R.M.-U 52, C.N.R.S.-L.A. n" 1195,

Université Claude-Bernard, 8, avenue Rockefeller, 69373 Lyon Cedex 2;

H. K. et T. M. : Department of Anatomy, Shiga University of Medical Science,

Ohtsu, Shiga, Japon.


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PHYSIOLOGIE VÉGÉTALE.— Étude anatomique de lépidemie de la feuille d'Hevea brasiliensis Künth. (Müll.-Arg.). Note de Christine Sanier et Jean d'Auzac, présentée par Roger Buvat.

L'épiderme inférieur des feuilles d'Hevea, présente, avant même la complète maturité des feuilles, une architecture rugueuse très tourmentée lui conférant un aspect fortement réticulé. La majorité des stomates se trouve profondément encryptée dans ce réticulum épidermique alors qu'au contraire un nombre plus limité de structures de type stomatique, situées sur les nervures, sont nettement extériorisées. L'épiderme supérieur, dépourvu de stomates, présente au stade jeune une architecture très fine lui conférant un aspect strié évoluant au stade adulte pour former un réseau verrniculé finement enchevêtré.

PLANT PHYSIOLOGY. — Anatomical study of Hevea brasiliensis leaf epidermis.

The lower epidermis of leaves from Hevea, already before complete maturity, presents a rough architecture and a very rugged structure which confers it a strongly reticulated aspect. Most of the stomata found in the lower epidermis are deeply seated in that reticulatestructure while other stomatà-like, structures;less; in number, and situated on the veins are completely exposed. The upper epidermis, devoid of stomata, presents at early stages a very fine architecture conferring it à striated aspect, the whole developing into a finely entangled vermicular network at the adult age..

Chez les ligneux à feuilles caduques, les feuilles jeunes sont très généralement plus sensibles aux attaques fongiques que les feuilles âgées. C'est notamment le cas pour l'Hevea en ce qui concerne un champignon pathogène, le Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) qui provoque des dégâts notables dans les conditions éco-climatiques de certaines plantations du Cameroun.

L'objet de Cette étude est de connaître l'ontogenèse du développement foliaire de l'Hevea au plan épidermique, afin, par la suite, de tenter de relier l'évolution anatomique à la sensibilité aux champignons pathogènes et de rechercher d'éventuelles liaisons entre les aspects anatomiques et la sensibilité clonale reconnue par ailleurs, au moins pour le C. gloeosporioides (Y. Senechal et À. Beltoise, communication privée).

Diverses techniques ont été utilisées pour mettre en évidence l'épiderme inférieur et ses stomates:

— la première consiste à réaliser des coupes à main levée de lambeaux d'épiderme, les plus fines possible, avec coloration ou non au Lugol et montage dans l'eau entre lame et lamelle;

- la seconde fait intervenir une solution de KOH à 3% dans l'eau bouillante, dans laquelle on plonge des fragments de feuille. Après quelques minutes les échantillons sont rinces plusieurs fois à l'eau du robinet et l'on peut alors facilement, sur les feuilles âgées, détacher l'épiderme supérieur ou inférieur que l'on observe comme précédemment.

Ces techniques ont permis d'observer des coupes longitudinales paradermales en microscopie photonique. Enfin, pour confirmer les premières observations, de petits fragments de feuilles ont été fixés au F.A,A. puis déshydratés à l'alcool par bains Successifs, traités ensuite par la méthode du point critique et métallisés à l'or-palladium avant d'être observés grâce à un microscope électronique à balayage " JEOL JSM 35". Le matériel végétal provient d'une serre tropicalisée de l'I.R.CA.-C.I.R.A.D. à Montpellier. Bien que des différences de densité stomatique aient été signalées [2], une étude superficielle des feuilles adultes de quelques clones disponibles sur place n'a pas révélé, en toute première approximation, de différence clonale qualitative évidente, ce qui a conduit à utiliser dans ce travail essentiellement le clone GT1. .

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Les feuilles dites " âgées " ont été prélevées au stade D [5] (feuille verte, port érigé) longueur supérieure à 10cm, les «jeunes » feuilles aux stades B2 (petites feuilles rouges pendantes) et C (feuilles vert clair pendantes) de longueur inférieure à 5 cm.

EXPLICATIONS DES PLANCHES I ET II

Abréviation sur les figures : st, cellule stomatique; ce, cellule épidermique; cc, crête cuticulaire; cs, cellule subsidiaire; cg, cellule de garde; c, cuticule; os, ostiole; sn, « stomate de nervure »; pl, plis.

Explanation of Figures: st, stomalal cell; ce, epidermal cell; ce, cuticular crest; es, subsidiary cell; cg, guard cell; c, cuticle; os, stomatal pore; sn, "vein stomatal"; pl, fold.

Fig. 1 à 2. — Coupes longitudinales paradermales obtenues après trempage dans KOH de l'épiderme supérieur

d'une feuille jeune (1) ou âgée (2) (Gx470). Absence de stomates. Figs. 1 to 2. — Paradermal longitudinal sections obtained by KOH treatment of upper epidermis from young (1)

or aged leaf (2) (M x470). Lack of stomata.

Fig. 3 à 4. — Coupe longitudinale paradermale à main levée d'épidermes inférieurs de feuilles âgées. Mise au

point sur les crêtes cuticulaires (3) ou sur les stomates (4) (Gx 520). Figs. 3 to A. — Handing-cut paradermal longitudinal sections of lower epidermis from aged leaves focused on

cuticular crests (3) or on stomata (A) (Mx520).

Fig. 5 à 6. — Coupe longitudinale paradermale obtenue après trempage dans KOH de l'épiderme inférieur d'une feuille âgée. Mise au point sur les crêtes cuticulaires (5) ou sur les stomates (6) (G x 330).

Figs. 5 to 6. — Paradermal longitudinal section of lower epidermis obtained by KOH treatment, focused on cuticular crests (5) or on stomata (6) (Mx330).

Fig. 7. — Vue d'ensemble de l'épiderme inférieur d'une jeune feuille en fin de stade B2. On distingue un

« stomate de nervure » non encrypté (G x 300), Fig. 7. — General view of lower epidermis of a young leaf at the end of B2 state. An exposed "vein stomata"

can be seen (M x 300).

Fig. 8. — Vue générale d'un épiderme supérieur de feuille âgée de PB 235 (G x 300). Fig. 8. — General view of an upper epidermis of aged leaf from PB 235 (Mx300).

Fig. 9 à 10. — Cuticule réticulée et stomates encryptés sur une jeune feuille verte au stade C(9) et au stade D

(10) (G x 600). Figs. 9 to 10. — Reticulated cuticle and deeply seated stomata on a young green leaf at C state (9) and D state

(10) (M x 600).

Fig. 11, 12 à 13. — Vue d'ensemble de jeunes feuilles à différents stades de croissance en microscopie à balayage. Début de stade B2 (11); on ne distingue pas les cellules épidermiques des cellules stomatiques, à l'exception d'un « stomate de nervure ». Stade B2(12) : les crêtes cuticulaires ne sont pas encore visibles. Fin de stade B2 (13) : formation des crêtes cuticulaires (G x400).

Figs. 11, 12 to 13. — General view of young leaves at different states of growth (scanning électron micograph) beginning of B2 state (11); epidermal and stomatal cells are undistinguishable. B2 state (12); cuticular crests are not visible. End of B2 state (13); formation of cuticular crests (M x400).

Fig. 14 à 15. — Détail de stomates encryptés sur une jeune feuille au stade B (14) (les cellules subsidiaires sont recouvertes de cuticules réticulées) (G x 3 000) et sur feuille âgée (15) (G x 3 000).

Figs. 14 to 15. — Detail of deaply seated stomata on a young leaf at B state (14) (subsidiary cells are covered with reticulated cuticle) (M x 3,670) and on aged leaves (15) (M x 3,000).

Fig. 16. — Détail d'un stomate caché sous les crêtes formées par la cuticule d'une feuille âgée (G x 2000). Fig. 16. — Detail of a stomate hiden under the crests produced by the cuticle of an aged leaf (M x 2,000).

Fig. 17. — Détail d'un « stomate de nervure » sur feuille âgée. Les crêtes cuticulaires sont repoussées autour

de l'ostiole(Gx3000). Fig. 17. - Detail of a "vein stomata" on an old leaf. The cuticular crests are pushed back around of the

stomatal pore (M x 3,000).

Fig. 18, 19 à 20. — Vue d'ensemble de l'épiderme supérieur de jeunes feuilles. Début de stade B2 (18) : les contours des cellules épidermiques sont à peine visibles (G x 400). Stade B2 (19) : les contours des cellules épidermiques sont visibles, leur surface est plissée (G x 660). Stade C ou D (20) : les plis de la cuticule sont très enchevêtrés (G x 660).

Figs. 18, 19 to 20. — General view of the upper epidermis of young leaves. Beginning of B2 state (18); the contours of epidermal cells are scarcely visible (M x 400). B2 state (19): the contours of epidermal cells are visible, their surface is folded (M x 660). C or D state (20): the folds of the cuticle are very entangled (M x 660).


PLANCHE I/PLATE I

CHRISTINE SANIER


PLANCHE II/PLATE II


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L'épiderme des feuilles d'Hevea brasiliensis a fait l'objet d'un nombre limité d'études anatomiques ([1] à [4]) utilisant la seule microscopie photonique. Les premières observations de Rao [1] qui avaient mis en évidence une cuticule de type réticulée à la surface de l'épiderme inférieur de la feuille, le seul à posséder des stomates, ont été confirmées ici (fig.;1,2, 3, 4).

L'examen au microscope optique d'épidermes inférieurs a perrnis de mettre en évidence que cette cuticule réticulée, très marquée à la surface des feuilles adultes, indécelables chez les jeunes feuilles, se présente Sous forme de crêtes plus ou moins ramifiées (fig. 3, 5). Chaque crête semble surmonter une cellule épidermique et être orientée parallèlement à la plus grande longueur de cette cellule. Si l'on fait varier la mise au point du microscope et lorsque l'on pénètre les couches cellulaires, les crêtes disparaissent et Tes cellules épidermiques aux contours sinueux et réfringeants sont nettement visibles, ainsi que les stomates situés dans le même plan (fig. 4, 6). Ces derniers sont bordés par deux cellules subsidiaires et sont donc de type paraçytique ([1], [6]). L'examen des échantillons en microscopie électronique à balayage confirme l'existence de différences au niveau de la cuticule entre feuilles jeunes et feuilles âgées (fig. 7, 8). Le relief des images montre bien en effet les crêtes de cuticule, qui protègent les stomates de feuille âgée en les encryptant (fig. 9, 10). Au stade B2 jeune (fig. 11) les cellules épidermiques et stomâtiques sont indiscernables; elles, le deviennent partiellement par la suite, stade B 2 âgé (fig. 12) et parfaitement en fin de stade B 2 (fig. 13).

Sur une feuille un peu moins jeune, fin stade B2, mais encore anthocyanique, on aperçoit toujours le contour des cellules épidermiques, mais déjà la cuticule commence à être réticulée (fig. 7, 13). Les stomates sont bien visibles à ce stade (fig. 14).

Au stade C, une jeune feuille verte (fig. 9) présente la même cuticule qu'une feuille âgée (fig. 10). Il est à noter que des structures comparables à des stomates et situées sur les nervures, d'apparition plus précoce, ne sont pas du tout protégées par des crêtes épidermiques. Au stade B2 jeune (.fig. 11) les cellules épidermiques qui entourent ces stomates semblent repousséés; les deux cellules subsidiares sont indiscernables (fig. 1). Les « stomates de nervure » Se retrouvent également sur feuilles âgées avec des crêtes cuticulaires dégageant le stomate au lieu de l'encrypter (fig; 17). En première approximation elles représenteraient moins de 3 % de l'ensemble des stomates. Aux stades C ou D, bien que les Stomates soient très encryptés et donc abrités sous les crêtes cuticulaires (fig. 16), on peut parfois apercevoir les pores des stomates dans la lumière des cavités (fig 15). Il est alors possible de distinguer un rebord en saillie sur le stomate, formant un premier rempart protecteur et enfin un deuxième rempart constitué par la cuticule des cellules de garde (fig.: 15, 16).

Une rapide étude en microscopie à balayage a également été effectuée sur l'épiderme supérieur des feuilles d'Hevea. Celle-ci révèle la présence d'une Cuticule plissée dont on a pu suivre l'évolution. Sur une très jeune feuille, début stade B2 (fig. 18) on distingue à peine le contour des cellules épidermiques et un très léger plissement à leur surface. Au stade B2 (fig, 19) les contours sont nettement visibles, les cellules sont bombées; de nombreux plis ornementant leur surface. Ces derniers semblent plus ou moins orientés dans le même sens et parallèles pour une même cellule. Chez la feuille adulte (fig. 20) on arrive encore à suivre les contours des cellules épidermiques mais le plissement de la cuticule à leur surface, est beaucoup plus désordonné. Les piïs semblent enchevêtrés. Des coupes transversales (figures non présentées) montrent que l'épaisseur de la cuticule sur l'épiderme inférieur varie approximativement du simple au double de là feuille jeune à

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celle âgée (de 5 à 10 um), par suite de la formation des crêtes étudiées précédemment. Sur l'épiderme supérieur, on ne remarque pas de variation sensible de l'épaisseur de la cuticule; les modifications suivant la maturation de la feuille semblent réduites à une exacerbation du plissement de la cuticule au niveau de la surface et non pas de l'épaisseur (de 2 à 3um aussi bien pour une feuille jeune que pour une feuille âgée). Enfin, l'observation du bord d'une feuille, montre pour l'épiderme inférieur des crêtes cuticulaires assez hautes, peu serrées les unes contre les autres; au contraire la cuticule de l'épiderme supérieur est formée par un réseau de plis, dense et compact mais peu épais.

CONCLUSION. — Cette étude préliminaire confirme que l'épiderme inférieur de la feuille d'Hevea brasïliensis est le seul à posséder des stomates. Au stade adulte cet épiderme possède un système de crêtes épaisses, réticulées pouvant constituer un obstacle mécanique important à la pénétration des champignons pathogènes. Ce système est inexistant au stade juvénile et ne devient très marqué qu'au stade C. L'encryptage profond des stomates, présents sur la seule face inférieure de la feuille, pourrait constituer éventuellement un obstacle à la pénétration des pathogènes. Toutefois, l'existence de « stomates de nervures » dont l'accès est beaucoup plus aisé, pourrait être par contre une voie d'accès préférentielle.

La cuticule de l'épiderme supérieur présente au stade jeune un aspect fortement strié laissant clairement séparées les cellules épidermiques. Au stade adulte elle apparaît sous forme d'un réseau vermiculé finement enchevêtré ne permettant plus de discerner le contour des cellules épidermiques.

Il paraît important maintenant de rechercher si les différences de sensibilité clonale au C. Gloeosporioides peuvent être reliées à des différences de structure anatomique. Dans le cas contraire, des facteurs chimiques clonaux tels des variations dans la teneur en composés phénoliques des feuilles par exemple, pourraient être prises en compte. Reçue le 5 mai 1986, acceptée après révision le 16 juin 1986.

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Université des Sciences et Techniques du Languedoc, Laboratoire de Physiologie végétale appliquée, place Eugène-Bataillon, 34060 Montpellier Cedex.


C. R. Acad. Sc. Paris, t. 303, Série III, n° 8, 1986 331

PHYSIOLOGIE VÉGÉTALE. — Étude comparative de l'effet de la kinétine et de deux pyridyl-phënyl-urée sur la croissance et la chlorophyllogenèse de cellules de Tabac cultivées en milieu liquide agité. Note de Severin Ake et Claude Lambert, présentée par Henri M. Duranton.

L'étude comparative des effets de pyridyl-phényl-urée et de ceux de la kinétine sur la croissance et la synthèse de chlorophylle de cellules de Tabac cultivées en milieu liquide agité, indique que les uréides sont des cytokinines potentielles. Les différences qualitatives Observées entre le 4 PU et le 4 PU-30 pourraient être tin bon modèle pour l'étude du mode d'action des cytokinines.

PLANT PHYSIOLOGY. — Growth and chlorophyllogenesis of tobacco cells in shaked liquid mediun: comparative study of kinetin and pyridyl-phenyl-ureas effects.

Pyridyl-phenyl-ureas are tested on growth and chlorophyllogenesis of tobacco cells culture in comparison with kinetin effect.. Similarity ofresponses indicates that the ureides are cytokinin-like substances.

INTRODUCTION. — Les travaux de Steward et Schahtz [1] ont démontré l'activité stimulante de la N,N'-diphényl-urée sur la division cellulaire dans des cultures de carottes. Depuis, de nombreux dérivés de l'urée ont été synthétisés et éprouvés dans des systèmes biologiques dont le plus utilisé est la culture de cals de tabac. Bruce et Zwar [2] en ont expérimenté près de 400. Il en ressort que la composante R-NH-CO-NH-R (R étant un noyau phényl ou un autre cycle, O pouvant être remplacé par S) est importante pour l'activité biologique. La diphényl-urée (DPU) est environ 1000 fois moins active que l'isopèntényl adénine (i 6 ade) mais assure la croissance cytokinine (CK) dépendante des cals de tabac. De nombreux dérivés de la DPU ont fait l'objet de travaux pour expliquer leur mode d'action ([3]-[6]) Isoga et coll. ([7], [8]) ont synthétisé une série de composés dont le 4PU (4PU : N-phényl-N'(4 pyridyl)-urée) et le 4PU-30 (4PU-30 : N-phényl-N'(2 Cl, 4 pyridyl)-urée) qui présentent une forte activité stimulante de la croissance des cals de tabac.

Nous présentons ici une étude comparative des activités d'une cytokinine (Kinétine) du 4 PU et du 4 PU-30 sur la multiplication cellulaire et la chlorophyllogenèse de cellules de tabac cultivées en milieu liquide agité.

MATÉRIEL ET MÉTHODES. — 1. Conditions de culture. — Les suspensions cellulaire de tabac sont de la lignée cellulaire clonale n° 19 entretenue sur un milieu, de culture et dans des conditions décrites précédemment ([91 [10]).. Les cultures sont réalisées dans des Erlerimeyers de 500 ml contenant 200 ml de milieu de base (avec le 2,4.D comme seul facteur de croissance) complémenté selon les cas par de la kinétine, du 4PU ou du 4PU-30. Les Cultures sont agitées sur un « Plan: Shister » dont la fréquence d'agitation est de 96 rpm, placées dans une salle à 26 + 1°C. Un éclairement de 20001x est assuré par des tubes Philips « blanc supper ». La mise en culture des cellules est réalisée dans deux conditions différentes qui permettent de dissocier l'effet des substances de croissance sur la division cellulaire et sur la chlorophyllogenèse.

—Les cellules d'une suspension mère en phase stationnaire de croissance sont collectées sur toile de nylon et rincées avec du milieu minéral [11]. Les Cellules sont ensuite transférées à faible densité, soit 1g de cellules dans 200 ml de milieu. Dans ces conditions, la croissance est cytokinine dépendante.

.—.Les cellules sont transférées sans rinçage préalable et à forte densité (2 à 5g pour 200 ml de milieu neuf). Dans ces conditions, on observe une croissance Indépendamment de la présence de CK, mais la différenciation plastidiale est très faible. Celle-ci n'apparaît qu'en présence de CK.

2. Détermination. — Les masses de matière fraîche (MF) et sèche (MS) sont déterminées selon les méthodes habituelles après rinçage des cellules par une solution minérale, et essorage par trompe à vide sur entonnoir filtrant. La teneur en chlorophylle est déterminée selon la méthode de Vernûn [12]. Les points expérimentaux représentés sur les figures correspondent chaque fois à une seule expérience, mais ces expériences ont été répétées plusieurs fois et les positions relatives des courbes restent identiques.

0249-6313/86/03030331 $2.00 © Académie des Sciences


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RÉSULTATS. — 1. Effets sur la croissance. — La concentration optimale de kinétine pour la croissance des cellules de la lignée 19 est de 0,3 uM (fig. 2, A). A cette concentration une étude cinétique de la croissance (fig. 1) montre, quel que soit le critère de détermination, une' phase exponentielle de cette croissance jusqu'à 10jours. Jouanneau [13] a montré que durant cette phase il y a corrélation entre l'augmentation de niasse cellulaire et la consommation de saccharose du milieu. La phase stationnaire est due à une carence de saccharose et non de la kinétine du milieu.

La courbe réponse-dose pour le 4 PU et le 4PU-30 sur la croissance (fig. 2, C et B respectivement) ainsi que les cinétiques de croissance réalisées aux concentrations optimales pour les trois substances éprouvées (fig. 3) indiquent une réponse des cellules assez semblable face à la présence de kinétine ou des uréïdes. La différence la plus notable

Fig. 1

Fig. 2

Fig. 1. — Cinétique de croissance et chlorophyllogenèse des suspensions de cellules de tabac en présence de

kinétine 0,3 uM. Temps en jours. A : MF, matière fraîche (g/1). B : MS, matière sèche (g/1). C : N, nombre

de cellules (milliers/ml). D : chlorophylles (ug/ml). E : chlorophylles (ug/g MF). Fig. 1. — Growth and chlorophylls synthesis of tobacco cell suspensions, in presence of kinetin (0.3 uM). Age

of cell suspensions (days). Curve A: MF, fresh cells weight (g/l- B: MS, dry cells weight (g/l). C: N, cells

number (tousands/ml). D: chlorophylls (ug/mf). E: chl (ug/g- MF).

Fig. 2. — Effet réponses-doses de la kinétine (A) du 4PU-30 (B) et du 4 PU (C) sur la croissance de suspensions

cellulaires de cultures de 10 jours. Ordonnées : matière fraîche (g/1). Abscisses : concentrations des 3 facteurs

de croissance (uM). Fig. 2. — Effects, according to degree of kinetin (A) or APU-30 (curve B) or APU (C) concentrations (uM), on

cell suspensions growth (fresh weight in g/l) of 10-day-old-stationary phase cultures. Abscissae: concentration

(uM).


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étant dans la réponse des cellules pour des doses supérieures à 0,3 uM ou l'effet toxique dû à une dose supra-optimale est moins apparent pour les uréïdes.

2. Effets sur la chlorophyllogenèse. — En présence de kinétine 0,3 uM la synthèse de chlorophylles dans les cultures devient exponentielle après une période de latence de

3 jours (fig. 1). Cette synthèse se poursuit même après l'arrêt de la croissance jusqu'au 15e jour de culture. L'évolution comparée des cinétiques de synthèse de chlorophylles dans les différentes conditions de culture est présentée sur la figure 4. La chlorophyllogenèse

4 PU-dépendante est tardive (fig. A, C) comparée à celle résultant de la présence de la kinétine (fig. 4, A). L'évolution du rapport chlorophylle a/chlorophylle b ne présente pas de variation significative quelle que soit la culture (fig. 4).

DISCUSSION. — Les résultats obtenus avec le 4 PU et 4PU-30 sur la croissance et la synthèse de chlorophylle des cellules de la lignée clonale 19, montrent l'analogie de leurs activités de type cytokinine avec celle d'une adénine N6 substituée, La comparaison des effets mesurés suggère de manière non équivoque que les pyridyl-phényl-urée sont des çytokinines potentielles. D'autres auteurs avec d'autres systèmes biologiques ont abouti

Fig. 3

Fig. 4

Fig. 3. — Cinétique de croissance, suivant les déterminations exprimées en grammes par litre de matière fraîche (I) ou sèche (II). O : milieu de base. A: kinétine. B : 4PU-30. C : 4 PU. Concentration en kinétine et analogues 0,3 uM. Temps en jours.

Fig. 3. — Growth kinetic of tobacco cell suspensions as expressed by fresh (I) or dry (II) cells weight (g/l). Curves: O; basal medium. A: kinetin. B: APU-30. C:4PU. Kinetin and ureides concentrations: 0.3 uM.

Fig, 4.: — Cinétique de la chlorophyllogenèse. Teneur en chlorophylle (ug/ml). O, A, B, C : voir la légende de la figuré 3. En médaillon : teneurs respectives de chlorophylle a (ligne continue) et de chlorophylle b (ligne

discontinue) correspondant aux différentes conditions A, B. C.

Fig. A. —. Chlorophylls net synthesis kinetic of tobacco cell suspensions (ug/m/).. 0, A, B, C: see legend of figuré 3..


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à cette conclusion ([7], [8], [14]). L'ensemble de nos résultats n'est pas en faveur de l'hypothèse selon laquelle l'activité cytokinine des dérivés de l'urée serait due à des effets indirects sur le métabolisme des cytokinines exogènes.

Les différences observées entre les effets des pyridyl-phényl-urées et la kinétine nécessiteraient d'être approfondies par une étude du devenir métabolique du 4 PU et du 4 PU-30. La comparaison des effets de ces deux types de substances met en évidence des différences d'ordre qualitatif. Nous avons noté que les cellules des cultures en présence de 4 PU-30 deviennent moins dissociées que celles des cultures en présence de kinétine et de 4 PU. Les structures moléculaires du 4 PU et du 4 PU-30 ne diffèrent que par un atome de chlore en position —2 sur le noyau pyridyl du 4 PU-30. Le chlore pourrait conférer une plus grande perméabilité membranaire au 4 PU-30 et modifier le comportement des cellules. Des différences qualitatives entre le 4.PU-30 et des cytokinines adénine N6 substituées ont été rapportées dans le cas d'utilisation agronomique de ces substances [14].

L'ensemble de ces particularités dans les effets physiologiques de ces structures pyridylphényl-urée, mériterait d'être pris en compte dans la recherche du, ou des modes d'action de ces structures en rapport avec celui des adénines N6 substituées.

Nous remercions le Dr Peaud-Lenoël qui a permis la réalisation de ce travail en nous accueillant dans son laboratoire.

Reçue le 9 juin 1986, acceptée le 23 juin 1986.

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Laboratoire de Physiologie cellulaire végétale, Université de Provence,

3, place Victor-Hugo, 13331 Marseille;

Adresse actuelle : Rectorat de Limoges, 13, rue François-Chénieux,

87031 Limoges Cedex.


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ECOPHYSIOLOGIE. — Adaptation de cinq coléoptères Scolytidae à des essences autres que leurs essences d'origine. Note de Christian Ducauze, Constantin Chararas, Douglas Neil Rutledge, Claude Revolon et Patrick Arpino, présentée par Constantin Chararas, Correspondant de l'Académie.

Cinq Scolytidae, Ips sexdentatus, Ips acuminatus, Orthotomicus erosus, Carphoborus minimus et Pityogenes chalcogrqphus, ont été éprouvés en présence de cinq essences de conifères : Pinus coulteri, Pinus radiata, Picea abies, Picea orientalis et Abies cephalonica. Les tests d'attraction ont été interprétés par une analyse statistique des résultats : tests de préférence en trio et en duo, analyse factorielle des correspondances. Les différentes essences ont été analysées d'autre part, après une extraction au pentane, par chromatographie en phase vapeur sur colonnes capillaires, couplée à la spectrométrie de masse : 35 composés terpéniques ont été identifiés. En l'absence de leur essence — hôte de prédilection, les Scolytidae peuvent d'adapter a des essences qu'ils n'ont jamais rencontrées.. Ce n'est pas une substance précise qui détermine l'installation de l'insecte mais le « bouquet d'odeurs » du conifère, formé d'un ensemble de constituants volatils agissant sur ses récepteurs sensoriels.

ECÔPHYSIOLOGY. — Adaptation of five scolytidae to tree-species other than those of their origin.

Five Scolytidae, Ips sexdentatus, Ips acuminatus, Orthotomicus erosus, Carphoborus minimus and Pityogenes chalcogrophys, were tested in presence of five conifer species: Pinus coulteri, Pinus radiata, Picea abies, Picea orientalis and Abies cephalonica. The tests of attraction were interpreted by statistical analysés of the results: trio and duo preference tests, factorial analysis. The different conifer species were dlso analysed, after extraction

with pentane, by capillary gas chromatography — mass spectrometry: 35 terpenic compounds were identified. In absence of their preferred host conifer, the Scolytidae are able to adapt to conifer species they have never before encountered. No one particular substance is responsable for the installation of thé insect but rather the "bouquet

of odours " ofthe conifer, formed by the action of a group of volatile substances on its sensory receptors.

La Famille des Scolytidae compte quelques espèces d'une grande nocivité pour les forêts et plus particulièrement pour les peuplements de conifères; c'est le cas notamment d'Ips typographus, d'Ips sexdentatus et des Dendroctonus. Si certaines espèces montrent une spécificité très étroite, comme Thamnurgus characiae pour Euphorbia characia ou Hypoborus ficus pour le figuier ou Phloeosinus armatus pour Cupressus sempervirens, les genres Ips, Orthotomicus et Pityogenes, entre autres, groupent des espèces oligophages qui peuvent s'attaquer indifféremment à divers Pinus, Picea, Abies et parfois même Larix [1]. En revanche la polyphagie reste très rare chez les Scolytidae puisque les espèces parasites des conifères ne s'adaptent jamais sur une essence feuillue; ceci prouve que le stimulus attractif et nutritionnel est lié à la présence de constituants végétaux spécifiques.

Ce sont les terpènes, nous l'avons démontré, qui doivent être mis en cause : à de faibles concentrations, ils exercent une attraction marquée sur les Scolytidae des conifères ([2], |3] et [4]), tandis que les tentatives d'infection expérimentale d'essences feuillues avec des insectes spécifiques des essences résineuses se sont toujours soldées par un échec, bien que ces essences renferment des glucides, lipides, protides et acides aminés capables d'assurer l'alimentation des insectes.

Nous nous proposons de montrer expérimentalement ici que certains Scolytidae sont capables de s'installer sur des essences autres que leur biotope d'origine.

1. MATÉRIEL ET MÉTHODES, — Nous avons suivi expérimentalement l'orientation et l'installation de différents Scolytidae en présence d'essence résineuses de provenance diverse.

1. Conifères. - Pinus coulteri et Pinus radiata, d'origine nord-américaine, utilisés dans les reboisements au Maroc et en Tunisie.

Picea abies, conifère des régions montagneuses d'Europe.

Picae orientalis, couvrant une grande partie, du Nord-Est de l'Anatolie.

Abies cephalonica de Grèce (Mont Pinde et Péloponèse, entre autres).

2. Insectes. — Ips sexdentatus et Ips acuminatus, insectes fréquents sur Pinus sylvestris dans la forêt de Fontainebleau,

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— Orthotomicus erosus, Carphoborus minimus, Pityogenes chalcographus, fréquents sur Pinus.

3. Tests d'attraction. — Les expériences ont été réalisées dans des cages de 1,00 x 0,45 x 0,70 m en grillage métallique, afin d'éviter la saturation de l'atmosphère en molécules volatiles; à chaque extrémité de la -cage, une petite pompe permettait de créer un courant d'air continu. Dans chaque cage on a placé pour chaque test 20 insectes en présence de deux ou trois troncs de 0,50 m de long sur 7 à 10 cm de diamètre; chaque test a comporté trois répétitions avec, entre chacune d'elles, nettoyage du grillage pour éliminer toute trace du produit qui aurait pu être adsorbé. Au bout de 24 h nous avons dénombré les insectes définitivement installés.

4. Analyses chimiques. — Elles ont été réalisées sur des extraits obtenus par macération à froid de 2 g de phloème dans 50 ml de pentane, puis concentration à quelques millilitres, au moyen d'un couplage chromatographie en phase vapeur — spectrométrie de masse, dans les conditions suivantes :

(a) colonne silice fondue (50 m x 0,2 mm); phase stationnaire=méthyl silicone; gaz vecteur = hélium à 2 bars; température du four: 1°C.mn- 1 de 60 à 220°C; température de l'interface: 140°C; vitesse de balayage: 1 balayage/s de 35 à 300 daltons; potentiel d'ionisation : 70 ev.;

(b) colonne silice fondue (50 m x 0,3 mm); phase stationnaire: carbowax 20 M; gaz vecteur = hélium à 0,8 bar; température du four = 25°C.mn- 1 de 40 à 60°C puis 1,5°C.mn- 1 de 60 à 190°C; température de l'interface : 140°C; vitesse de balayage : 1 balayage/s de 35 à 380 daltons; potentiel d'ionisation : 70 eV.

5. Analyses statistiques. — Deux méthodes ont été utilisées :

(a) le niveau de signification des tests d'attraction a été estimé au moyen de tests de préférence en trio puis en duo;

(b) une analyse factorielle des correspondances (AFC) a permis de visualiser l'ensemble des résultats.

Les résultats des tests d'attraction ont été rassemblés sous forme de matrices dans lesquelles chaque variable (colonne) correspond à une espèce d'insectes et chaque objet (ligne) à une essence; un objet supplémentaire a été créé pour les insectes non installés (N). L'intersection d'une ligne et d'une colonne donne le nombre d'insectes d'une espèce ayant préféré telle ou telle essence dans les conditions du test. Dans un second temps, l'AFC est utilisée pour trouver l'ensemble des facteurs — ou combinaisons linéaires orthogonales — dérivés des variables et objets qui expliquent le mieux la variance des données. En raison de la petite taille des matrices de départ, cette technique, qui vise à regrouper insectes et conifères suivant leurs ressemblances, ne peut fournir ici qu'une représentation graphique commode de l'information presque toujours directement accessible au niveau des données brutes.

II. RÉSULTATS OBTENUS. — 1. Tests d'attraction. — Une étude préliminaire a été réalisée en plaçant chaque espèce de Scolytidae en présence de trois essences : Picea orientalis, Picea abies et Abies cephalonica dans un premier cas; P. orientalis, Pinus radiata et A. cephalonica dans le second cas. Dans l'un et l'autre cas, l'attraction exercée par cette

Fig. 1. Analyse factorielle des correspondances portant sur l'attraction de Picea abies (PA) et de Picea orientalis (PO) vis-à-vis des adultes d'Ips sexdentatus (Is) et d'Ips acuminatus (la) ayant évolué soit sur P. abies, soit sur P. orientalis, soit sur Pinus sylvestris (PS).

Fig. 1. — Factorial Analysis of the attractive effect of Picea abies (PA) and of Picea orientalis (PO) versus adult Ips sexdentatus (Is) and Ips acuminatus (la) having developped either on P. abies, P. orientalis or Pinus sylvestris (PS).


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TABLEAU I

Nombre total d'insectes (sur 3x20) installés sur PR, PO et PC, N(PR, PO) et N(PR, PC) correspondent

aux insectes non installés. PR=Pinus radiata; PO=Picea orientalis; PC=Pinus coulteri; Is=Ips sexdentatus;

Ia = Ips acuminatus; Cm — Carphoborus minimus; Pc=Pityogenes chalcographus; Oe== Orthotomicus erosus.

Les préférences (tests en duo) sont données à des niveaux de signification estimés de 5 % (°); 1 % (*); 0,5 %

(**)et0,l %(***). Total number of insects (out of 3 x 20) installed on PR, PO and PC. N(PR, PO) and N(PR, PC) correspond to

the non-installed insects. PR =Pinus radiata; PO = Picea orientalis; PC=Pinus coulteri; Is=Ips sexdentatus;

Ia=Ips acuminatus; Cm = Carphoborus minimus; Pc=Pityogenes chalcographus; Oe—Orthotomicus

erosus. The préférences (Duo Tests) are given at the levels of significance estimàted as 5%(°); 1% (*);

0,5% (**) and 0,1% (***).

Insecte. ................ Is la Cm Pc Oe

Choix

PR(PO) 21 23 33 43 39

(**) (°)

PO(PR) 38 33 27 16 20

N(PR, PO) 1 4 0 1 1

PR(PC) ..32 32 47 32 40

(***) (°)

PC(PR) ... v ........ 27 27 13 27 18

N(PR, PC) 1 1 0 1 2

TABLEAU II .

Nombre total d'insectes (sûr 3 x 20) installés sur PA et PO. N(PO, PA) correspond aux insectes non intâllés. PO = P/cea orientalis; PA=Picea abies..Is (PS), Is (PO), Is(PA)=Ips sexdentatus élevé respectivement sur P. sylvestris (PS), P. orientalis (PO) et P. abies (PA). la (PS),Ia (PO); Ia (PA)=Ips acuminatus élevé respectivement sur PS, PO et PA.

Total number of insects (out of 3x20) installed on P A and PO. N(PO,PA) correspond to the non-installed insects. PO = Picea orientalis; PA = Picea abies. Is (PS), Is (PO), Is (PA)=Ips sexdentatus raised respectively on P. sylvestris (PS), P. orientalis (PO) and P. abies (PA). la (PS),Ia(PO), la (PA)=lps acuminatus raised respectively on PS, PO and PA.

Insecte........ Is(PS), Ia (PS) I s (PO), la (PO) Is(PA), la (PA)

Choix

PA (PO) 33 34 21 20 30 35

PO(PA) 26 25 38 39 26 23

(°)

N(POPA) 1 1 1 1 4 2

dernière essence est extrêmement faible, ce qui rend difficile l'interprétation statistique de ces essais : un test de préférence triangulaire suppose en effet que les choix proposés sont équiprobables a priori. On peut cependant constater que les insectes éprouvés semblent globalement préférer P. orientalis à P. abies, tandis qu'I. sexdentatus et I. acuminatus choisissent P. orientalis plutôt que P. radiata, cette dernière essence attirant plus fortement Carphoborus minimus, Pityogenes chalcographus et Orthotomicus erosus.

Pour tourner cette difficulté, nous avons procédé à des tests binaires entre P. orientalis et P. radiata puis entre les deux essences nord-américaines, P. radiata et P. coulteri (tableau I). Il apparaît ainsi que P. chalcographus et O. erosus préfèrent bien P. radiata à P. orientalis à des niveaux de signification respectifs de 0,5 et 4 %, I. sexdentatus montrant une légère prédilection pour P. orientalis (niveau proche de 5%); enfin, des deux essences nord-américaines, P. radiata exerce une attraction un peu plus forte que P. coulteri sur C. minimus (niveau 0,1 %) et O. erosus (niveau 2 %).

Pour préciser ces premiers résultats, une dernière série d'essais a été réalisée en plaçant, en présence de P. abies et P: orientalis, des adultes d' I. sexdentatus et d'I. acuminatus ayant évolué soit sur P. abies, soit sur P. orientalis, soit sur Pinus sylvestris.

L'ensemble des résultats (tableau II) a été visualisé par une AFC qui explique toute la variance au moyen des deux premiers axes (fig. 1). Le facteur F1 (81 % de la variance)


338

C. R. Acad. Sc. Paris, t. 303, Série III, n° 8, 1986

oppose les insectes élevés sur P. orientalis aux insectes élevés sur les deux autres essences, en même temps qu'il oppose la préférence pour P. orientalis à celle pour P. abies; le facteur F2 (19 % de la variance) est essentiellement lié aux insectes non installés. On voit ainsi que les insectes élevés sur P. orientalis sont proches de cette essence sur l'axe principal, alors que les insectes élevés sur P. abies ou P. sylvestris sont plus proches de P. abies.

L'interprétation statistique de ces résultats au moyen du duo-test montre que les adultes d'I. sexdentatus et d'I. acuminatus élevés sur P. sylvestris ou même sur P. abies ne distinguent pas significativement cette dernière essence de P. orientalis; par contre, dans le cas où les insectes ont été élevés sur P. orientalis, leur prédilection pour cette essence semble marquée à des niveaux de signification inférieurs à 10 % (I. sexdentatus) et à 3 % (I. acuminatus).

L'analyse des résultats obtenus autorise les conclusions suivantes :

1. aucun des 5 insectes n'est attiré significativement par Abies cephalonica;

2. chez Ips sexdentatus, les insectes élevés sur P. orientalis semblent mieux s'installer sur cette essence que qur P. abies; élevés sur P. abies ou P. sylvestris, ils ne font plus la différence entre P. orientalis et P. abies; élevés sur P. sylvestris, ils semblent préférer P. orientalis à P. radiata;

3. s'il a évolué sur P. orientalis, I. acuminatus marque une prédilection pour cette essence plutôt que pour P. abies; sinon il ne montre aucune préférence;

4. C. minimus est attiré de façon identique par P. orientalis et P. radiata mais préfère nettement cette dernière essence à.P. coulteri;

5. entre P. radiata et P. orientalis, P. chalcographus choisit visiblement la première essence, tandis qu'il ne fait pas de distinction entre P. radiata et P. coulteri;

Fig. 2. — Spectre d'odeur d'Abies cephalonica obtenu, à partir d'un extrait au pentane, par chromatographie en phase vapeur sur colonne méthyl-silicone. 8 = a-pinène; 12=camphène; 21 = p-pinène; 25 = myrcène; 34 = A3-carène; 37 = ocimène; 40 = limonène; 65 = a-terpinène; 73 (n.i.); 108 (n.i.); 182 (n.i.); 189 = acubébène; 216 = longifolène; 221 = P-caryophyllène; 247 (n.i.); 251=cadino 6,8-diène; 255=y-cadinène; 261=ot-muurolène; 263 = 5-cadinène; 271 (n.i.); 300 (n.i.).

Fig. 2. Odour spectrum of Abies cephalonica obtained, after extraction by pentane, using gas chromatography on a Methylsilicone column. & = a-pinene; 12 = camphene; 21 = $-pinene; 25 = myrcene; 3A=A3-carene; 37 = ocimene; A0 = limonene; 65 = a.-terpinene; 73 (n.i.); 108 (n.i.); 182=(n. i.); 189 = a-cubebene; 216 = longifolene; 221= B-caryophyllene; 2A7 = (n.i.); 251 = cadino-6,S-diene; 255 = y-cadinene; 261 = a-muurolene; 263 = 8cadinene; 271=(n.i.); 300 = (n.i.).


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339

6. enfin O. erosus semble légèrement préférer P. radiata à P. orientalis et P. coulteri.

2; Spectre d'odeurs des conifères. — Les chromatogrammes des cinq essences analysées ont permis de repérer respectivement, 39 pics pour A. cephalonica (fig. 2), 36 pour P. abies, 27 pour P. orientalis, 63 pour Pinus radiata et 46 pour P. coulteri, certains d'entre eux correspondant d'ailleurs à un même temps de rétention. Sur l'ensemble des composés présents dans ces extraits, 35 ont pu être identifiés par spectrométrie de masse.

Le nombre important de composés terpéniques et les différences qualitatives et quantitative d'un échantillon à l'autre ne permettent pas d'établir une concordance entre le nombre des composés terpéniques d'un échantillon et son pouvoir attractif sur les Scolytidae en expérience. Les tests d'olfaction ont cependant montré que les 5 insectes étudiés distinguent A. cephalonica de P. abies, P. orientalis et P. radiata (trio-test). En examinant les chromatogrammes, on peut alors constater qu'A cephalonica renferme 9 composés (pics nos 73, 108, 182, 189, 247, 251, 255, 271 et 300) absents des autres essences alors qu'un seul composé (pic 64) — composé non identifié dont le spectre de masse est donné sur la figure 3 — est absent chez A. cephalonica et présent dans les trois autres échantillons. Toutefois, il serait abusif de déduire de cette observation que l'absence dé quelques composés ou la présence d'un autre suffit à expliquer le pouvoir attractif d'une essence: En effet, les recherches que nous avons menées pour les mêmes insectes sur de nombreux autres conifères apportent autant d'exemples contraires à cette conclusion. Ce n'est donc pas la présence ou l'absence d'un ou plusieurs composés terpéniques qui permet d'expliquer le pouvoir attractif d'une essence : celui-ci dépend autant des concentrations respectives (tolérance des insectes) que de l'ensemble des composés présents (synergie des constituants).

III. DISCUSSION. — Cette étude montre qu'aucun des cinq Scolytidae étudiés n'est strictement spécifique d'une essence résineuse donnée et Ips sexdentatus constitue à cet égard un exemple particulièrement intéressant : dans le Nord-Est de l'Anatolie, cet insecte â causé des dommages considérables aux forêts de Picea orientalis (500000 ha infectés). En France, il s'attaque indifféremment à Pinus pinaster (forêt des Landes) ou à Pinus sylvestris (forêt de Fontainebleau), Les tests d'attraction et les infestations expérimentales montrent d'autre part qu'Ips sexdentatus pourrait aussi bien s'attaquer à Picea abies [1]. Si P. abies, esssence de montagne, était donc introduite dans l'aire d'extension correspondant à I. sexdentatus, elle se trouverait attaquée, comme cela s'est produit de façon limitée dans la forêt de Fontainebleau. De façon similaire, Ips acuminatus, tout en préférant P. orientalis, peut s'adapter sur P. abies et, dans des conditions naturelles, il se rencontre sur P. pinaster, P. brutia, P. halepensis, P. uncinata ou même Larix europea.

Fig. 3. — Spectre de masse du composé correspondant au pic 64

absent du spectre d'odeur d'Abies cephalonica (composé non identifié).

Fig. 3. — Mass spectrum of the compound corresponding to the peak 64

absent in the odour spectrum of Abies cephalonice (non-identified compound).


340 C. R. Acad. Sc. Paris, t. 303, Série III, n° 8, 1986

Carphoborus minimus, qui n'attaque normalement que les Pinus méditerranéens en présentant une certaine spécificité pour P. halepensis, a néanmoins été observé sur P. sylvestîis et P. nigra. De plus, nous venons de démontrer que cet insecte préfère P. radiata et P. coulteri, bien qu'il n'ait jamais rencontré aucune de ces deux essences.

De même, Pityogenes chalcographus et Orthotomicus erosus font la distinction entre Picea orientalis et Pinus radiata qu'ils ne rencontrent jamais dans les conditions normales.

Il est frappant de constater que certains Scolytidae originaires d'Europe et d'Afrique du Nord sont capables de coloniser des conifères nord-américains et même de faire un choix entre P. radiata et P. coulteri. Cette observation confirme l'importance de la faculté d'adaptation des insectes à une gamme plus ou moins large de conifères, malgré des différences notables dans leur spectre d'odeurs respectif. C'est cette faculté d'adaptation qui permet aux Scolytidae, en l'absence de leur essence-hôte de prédilection, de s'installer sur diverses essences pour s'y nourrir et se reproduire tout à fait normalement. On sait en effet [1] que la stricte monophagie est exceptionnelle chez les Scolytidae et que l'oligophagie est de règle au sein de cette Famille.

Nous constatons d'autre part que, dans le processus de sélection de la plante-hôte, ce n'est pas une substance précise qui détermine l'installation d'un insecte donné mais le " bouquet d'odeurs » formé par l'ensemble des constituants volatils agissant sur les récepteurs sensoriels des insectes. En conséquence, il apparaît primordial de préciser ce qui constitue exactement le bouquet d'odeurs reconnu par un insecte. On pourrait alors en déduire ses possibilités d'installation sur des essences exotiques aussi bien que sur les essences autochtones : il s'agit d'une donnée essentielle en raison de la tendance actuelle à introduire en Europe, en Afrique du Nord et au Moyen-Orient, de nombreux conifères à croissance rapide originaires d'Amérique du Nord. Reçue le 30 juin 1986.

RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES

[1] C. CHARARAS, Écophysiologie des insectes parasites des forêts, 297 p., édité par l'auteur, Paris, 1980.

[2] C. CHARARAS, Comptes rendus, 247, 1958, p. 1653-1654.

[3] C. CHARARAS, Etude biologique des Scolytidae des conifères, 556 p.. Le Chevalier, Paris, 1962.

[4] C. CHARARAS, Comptes rendus, 268, série D, 1969, p. 1080-1083.

C. D., D. N. R. et C. R. : Laboratoire de Chimie analytique

et C. C. : C.N.R.S., Laboratoire de Zoologie,

Institut national agronomique, 16, rue Claude-Bernard, 75231 Paris Cedex 05;

P. A. : C.N.R.S., Laboratoire C.A.P., École Polytechnique, 91128 Palaiseau Cedex.


C. R. Acad. Sc. Paris, t. 303, Série III, n° 8, 1986 341

MORPHOLOGIE VEGETALE (ERRATUM)

(Comptes rendus, tome 303, du 21 juin 1986)

Note reçue le 28 avril 1986, de Jean-François Leroy, intitulée : Anemopsis californica (Saururaceae) : interprétation de la fleur.

Page 92, 12e ligne : au lieu de : l'ancestralité des plantes à fleurs en ligne, fleurs $ (telles celles de Chloranthus ou

lire :

l'ancestralité des plantes à fleurs en lignes, fleurs $ (telles celles de Chloranthus ou



C. R. Acad, Sc. Paris, t. 303, Série III, n° 9, 1986 343

IMMUNOLOGIE-— Inhibition fonctionnelle par la Ciclosporine A du récepteur lymphocytaire du virus du sida (HIV), Note de David Klatzmann, Jean-Philippe Laporte, Ammar Achour, Edith Brisspn, Jacqueline Gruest, Luc Montagnier et Jean-Claude Gluckman, présentée par François Gros.

Le virus HIV a un tropisme sélectif pour les cellules exprimant la molécule CD4 à leur membrane. Ce tropisme est contrôlé par un récepteur membranaire dans lequel la molécule CD4 a un rôle essentiel, Ce récepteur est l'objet d'une régulation fonctionnelle, qui semble dépendre de l'activation cellulaire. Nous démontrons ici, que la Ciclosporine A, un puissant immunosuppresseur qui interfère avec les. événements précoces d'activation du lymphocyte T, inhibe totalement la fixation du HIV à son récepteur, Cet effet est observé à des concentrations de Ciclosporine A qui correspondent à celles observées dans le sérum des patients traités par cette drogue, et qui sont capable d'entraîner une inhibition de la prolifération lymphocytaire. La Ciclosporine A a deux effets sur la replication du HIV dans des cultures lymphocytaires T : l'inhibition de la fixation du virus à son récepteur protège les lymphocytes T de l'infection par. le HIV, et l'inhibition de la prolifération lymphocytaire se traduit par une inhibition de la replication virale dans les cellules déjà infectées. Ces résultats fournissent les bases théoriques indispensables à une éventuelle utilisation de la Ciclosporine A dans le traitement des infections par le virus HIV, et permettent une meilleure compréhension de la nature du récepteurde ce virus.

IMMUNOLOGY. — Receptor of AIDS virus (HIV) on CD4+ lymphocytes. ïs functionally inhibited by cyclosporin A.

The Humans Immunodeficiency Virus (HIV) displays a selective tropism for cells expressing the CDA molécule which, by itself, represents at least part of the specifie receptor for this virus. Howeber, modification of the activation state of each individual cell seems critical not only for virus replication but also for its binding and

subséquent penetration into its target, We demonstrate here that Ciclosporin-A (CSA), a drug which inhibits

IL-2 dependent T-lymphocyte proliferation and differentiation and which is known for its immunosuppressive activity, can prepent subsequent virus binding to cells otherwise susceptible to HIV, Normal. T-lymphocytes were

preincubated in vitro with CSA at concentrations that were in the same range than those reached in the serum of treated patients. This resulted in the complète disappearance of HIV receptors (HIV-R), as assessed by the direct measure of specifie binding of fuoresceinated HIV (HIV-FITC), and in the subsequent inhibition of HIV replication in cultrued cells. Moreover CSA pretreatment of IL-2 independent transformed cells derived from

the CEM line, before their infection, strongly inhibited HIV adsorption as well as further virus replication. These résults provide a new experimental basis for the potential application of CSA in the treatment of HIV-related diseases.

INTRODUCTION. — Le Human Immunodeficiency Virus (HIV) à un tropisme sélectif

por les lyphocytes normaux CD4 + [1] et molécule CD4 elle même apparaît comme

un élément essentiel du récepteur membranaire à ce virus (R-HIVà) [2], [3]), Cependant,

malgré la démostration récente que la glycoproétine d'enveloppe du HIV (gp 110) se

trouvait au contact de; la molécule CD4 lors de la fixation du virus à sa cellule cible [4],

la nature exacte du R-HIV reste à élucider. En effet, dans une culture de lymphocytes

CD4+ infectés, seuls10 % des lymphocytes expriment des antigènes viraux lors de la

replication virale, ce pourcentage variant de 10 à 50 % lorsque l'on étudie des lignées

cellulaires susceptibles à l'infection par le HIV ([1], [5]). De même, l'effet cytopathogène

de ce virus n'affecte qu'une petite fraction des cellules de la culture lors de la replication

virale. Ces observations suggéreraient qu'en plus de la molécule CD4, une autre molécule

encore inconnue pourrait participer aux interactions du virus avec ses cellules cibles, ou

bien que seuls une fraction des lymphocytes ou des lignées cellulaires CD4+ soit à un

moment donné dans un état fonctionnel permettant d'exprimer efficacement le récepteur

du HIV.

Pour répondre à cette question, nous avons utilisé du virus inactivé et couplé à l'isothiocianate de fluoresceine (HIV-FITC), ce qui permet de déterminer; ensuite optiquement ou en cytofluorométrie les cellules ayant fixé le virus: [6]. Le marquage ainsi obtenu, est spécifique: seuls les lymphocytes normaux ou transformés exprimant la

0249.6313786/03030343 $2.00 © Académie des Sciences C.R. 1986. 2e Semestre (T.303) Série III — 29


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C. R. Acad. Sc. Paris, t. 303, Série III, n° 9, 1986

TABLEAU I

La CSA inhibe la fixation du HIV à son récepteur.

I. Études cinétiques

CSA inhibits HIV-FITC binding to HIV receptor.

I. Kinetics studies

% de cellules fixant HIV-FITC

Milieu après une inabation de :

Cellules PHA Ethanol CSA Témoin 30 mn 2 h 4 h 24 h 72 h

Lymphocytes du sang

périphérique :

exp. 1 - - - 10 9 7 8

+ 9 8 9

+ + - 12 8 9

+ - + 4 <1 <1

exp. 2 - - - 9 9 8 10

+ - - 9 8 7

+ + - 9 4 8

+ - + <1 <1 4

exp. 3 - - - 8 10 8 8

+ - - 9 NT 8

+ + - 9 10 7

+ - + <1 <1 4

exp. 4 , . . . + + - 9 9 8 10

+ - + 8 2 <1

exp. 5 + + - 9 9 8 9

+ - + 7 <1 <1 Lymphocytes CD4+ :

exp. 6 - - + 10 <1 <1 <1

- - + 10 3 1 2

La fixation du HIV à son récepteur cellulaire a été étudiée en utilisant le HIV couplé à l'isothiocianate de fluoresceine [6]. 5.105 lymphocytes du sang périphérique ou lymphocytes CD4+ purifiés [1], obtenus a partir de donneurs volontaires sains, étaient incubés avec du HIV-FITC 1 h à 4°C puis lavés deux fois avec du milieu froid. La fixation du HIV-FITC aux cellules était déterminée à l'aide d'un microscope à épifluorescence, 200 à 500 cellules étant comptées. Les études cinétiques ont été réalisées soit avec des lymphocytes au repos, soit avec des lymphocytes stimulés par des concentrations mitogéniques suboptimales de PHA. Dans ces expériences la Ciclosporine A était utilisée à des concentrations de 600 ng/ml, et son effet comparé à celui de l'éthanol, le solvant dans lequel elle est dissoute.

HIV binding at the cell surface was determined by labelling cells with fluorescein isothiocianate-conjugated HIV in a ratio of fluorescein to viral protein of 1:2 [6]. 5 x 105 peripheral blood lymphocytes or purified CD4+ cells [1] obtained from healthy volunteer donors were incubated with concentrated HIV-FITC for 1 hr. at 4°C, washed with cold midium and then membrane fluorescence was assessed with an epifluorescence-microscope by counting 200 to 500 cells. Kinetics studies were performed with either resting cells cultured in RPMI 1640 (Flow laboratories) or with cells cultured in the presence of suboptimal mitogenic concentration of PHA (3 µg/ml PHA. M Difco). The effect of CSA was assessed at a concentration of 600 ng/ml and compared to that of ethanol, the CSA solvant, at the appropriate concentration.

molécule CD4 +, mais jamais les lymphocytes B ou CD8 +, sont marqués par le HIVFITC. De plus, la fixation du virus fluorescent peut être inhibée par préincubation des cellules avec du virus non marqué ou avec des anticorps monoclonaux dirigés contre la molécule CD4. Environ 10 % des lymphocytes CD4+ normaux, et environ 15 à 30 % des cellules de clones dérivés de la lignée CD4+ CEM peuvent être ainsi marquées par le HIV-FITC [6]. Ainsi, même s'il n'est pas exclu qu'une molécule autre que CD4 puisse être associée au R-HIV, ces résultats obtenus avec des cellules clonales suggèrent que seule une fraction de chacune des populations cellulaires éprouvées expriment le récepteur du virus HIV dans une configuration qui autorise une fixation de haute affinité aux récepteurs. C'est pourquoi nous avons émis l'hypothèse que la disponibilité (nombre, configuration et mobilité) de la molécule CD4 ainsi que l'état d'activation de chaque cellule pouvaient être des éléments critiques qui contrôlent la fixation du virus à son récepteur. Nous avons d'ailleurs récemment montré que la phytohémaglutinine A (PHA)


PLANCHE 1/PLATE I DAVID KLATZMANN

TABLEAU II

La CSA inhibe la fixation du HIV à son récepteur.

II. Etudes dose/réponse

CSA inhibits HIV-FITC binding to HIV receptor: II. Dosefresponse study

CSA (ng/ml) 0 0,1 1 10 100 1000

% cellules R-HIV +.

exp A.. .. ..... .............. 9 10 6 4 2

exp B.. ............. .... 10 9 9 8 3 3

éxp. C............: 9 7 4 2. 1

Exp d... ... 9 9 9 4..1 1

Prolifération cellulaire (cpm x 10- 3)

esp A.. 4.... ..... 42 44 : 31 16 12

exp. 19 22 17 11 7 8

L'effet dose-réponse de la Ciclosporine A sur la fixation du HIV-FITC a été étudié sur leslymphocytes de Quatre individus différents, dans deux expériences indépendantes. L'analyse de la variance des résultats présentés montre que l'effet; de la CSA sur le Précepteur au HIV est significatif dans ces conditions (P<;0,0001). L'effet de la Cic