Rappel de votre demande:
Format de téléchargement: : Texte
Vues 1 à 88 sur 88
Nombre de pages: 88
Notice complète:
Titre : Comptes rendus de l'Académie des sciences. Série 3, Sciences de la vie
Auteur : Académie des sciences (France). Auteur du texte
Éditeur : Elsevier (Paris)
Éditeur : Centrale des revuesCentrale des revues (Montrouge)
Éditeur : ElsevierElsevier (Paris)
Date d'édition : 1989-09-28
Notice du catalogue : http://catalogue.bnf.fr/ark:/12148/cb34394202h
Notice du catalogue : https://gallica.bnf.fr/ark:/12148/cb34394202h/date
Type : texte
Type : publication en série imprimée
Langue : français
Format : Nombre total de vues : 30522
Description : 28 septembre 1989
Description : 1989/09/28 (SER3,T309,N10 (DOUBLE)).
Droits : Consultable en ligne
Droits : Public domain
Identifiant : ark:/12148/bpt6k56754840
Source : Bibliothèque nationale de France, département Collections numérisées, 2008-93531
Conservation numérique : Bibliothèque nationale de France
Date de mise en ligne : 19/01/2011
Le texte affiché peut comporter un certain nombre d'erreurs. En effet, le mode texte de ce document a été généré de façon automatique par un programme de reconnaissance optique de caractères (OCR). Le taux de reconnaissance estimé pour ce document est de 100%.
1989 - DEUXIÈME SEMESTRE CRASEV ISSN 0249-6313
COMPTES RENDUS
DE L'ACADÉMIE DES SCIENCES
TOME 309 SÉRIE III N° 10 - 28 SEPTEMBRE 1989
Série III SCIENCES DE LA VIE
COMPTES RENDUS DE L'ACADÉMIE DES SCIENCES
Une Note à l'Académie des Sciences est la première relation publiée d'une découverte importante ou d'un résultat nouveau significatif. Après acceptation définitive, la Note bénéficie d'une publication rapide.
La présentation de la Note doit se conformer aux Instructions aux auteurs. Elle est obligatoirement présentée par un Membre, un Associé étranger ou un Correspondant et, pour les Sciences de la Vie, en particulier par les Membres du Comité de Rédaction.
Les Comptes Rendus de l'Académie des Sciences sont publiés sous la direction des Secrétaires perpétuels, Paul GERMAIN et Alfred JOST.
SÉRIE III - SCIENCES DE LA VIE
Comité de Rédaction
Ivan ASSENMACHER Jean-François BACH Étienne-Émile BAULIEU Edouard BOUREAU Pierre BUSER Jacques CAEN André CAUDERON Pierre CHAMBON Jean-Pierre CHANGEUX Pierre COR VOL Jean DORST Pierre Douzou Henri DURANTON Jean GIRARD François GROS
Claude HÉLÈNE François JACOB Alfred JOST Michel JOUVET Pierre KARLI Yves LAPORTE Raymond LATARJET Lucien LAUBIER Nicole LE DOUARIN Roger MONIER Théodore MONOD François MOREL Alexis MOYSE Raymond SCHNELL Piotr SLONIMSKI
Secrétaire scientifique Secrétariat administratif
Pierre VOLFIN Tél. : 43.26.66.21 - Poste 34 ou 35
23, quai de Conti, 75006 Paris. Tél. (1) 43.26.66.21; Télex 206521 F; Télécopie (1) 43.54.63.99
COMPTES RENDUS DE L'ACADÉMIE DES SCIENCES
Série I : Mathématique ; Série II : Mécanique, Physique, Chimie, Sciences de l'Univers, Sciences de la Terre; Série III : Sciences de la Vie.
Tarif d'abonnements. France 1989 Vol. 308 + 309-40 numéros
Une série 2440 F
Deux séries 4 370 F
Trois séries (I, II, III) 5490 F
Pour l'Étranger les tarifs postaux par voie normale sont inclus. Sur demande, l'envoi par avion sera facturé en sus. En 1989, Le service de la Série générale « La Vie des Sciences » est assuré gracieusement à tous les abonnés.
La Vie des Sciences : Institution 458 F/Particulier 275 F
Adresser les commandes à : C.D.R., Centrale des Revues, 11, rue Gossin, 92543 Montrouge Cedex, France.
Envoi de Spécimen sur demande
Série III : SCIENCES DE LA VIE
TOME 309 — SÉRIE III — N° 10 — 28 SEPTEMBRE 1989
« Reproduction in whole or in part without the permission of the author or his representative is prohibited (law of March 11, 1957, Article 40, line 1). Such reproduction by whatever means, constitutes an infringement forbidden by Article 425 and those following it, of the Penal Code. The law of March 11, 1957, lines 2 and 3 of Article 41, authorizes only those copies or reproductions made for the exclusive use of the copyist, and not intended for collective use, and such analyses and short quotations as are made for the purposes of an example or illustration. »
« Toute représentation ou reproduction, intégrale ou partielle, faite sans le consentement de l'auteur, ou de ses ayants-droits ou ayants-cause, est illicite (loi du 11 mars 1957, alinéa Ier de l'article 40). Cette représentation ou reproduction, par quelque procédé que ce soit, constituerait une contrefaçon sanctionnée par les articles 425 et suivants du code pénal. La loi du 11 mars 1957 n'autorise, aux termes des alinéas 2 et 3 de l'article 41, que les copies ou reproductions strictement réservées à l'usage privé du copiste et non destinées à une utilisation collective d'une part et, d'autre part, que les analyses et les courtes citations dans un but d'exemple et d'utilisation. »
The appearance of the code at the bottom of the first page of an article in this journal indicates the copyright owner's consent that copies of the article may be made for personal or internal use, or for the personal or internal use of specific clients. This consent is given on the condition, however, that the copier pay the stated per-copy fee through the Copyright Clearance Center, Inc., 21 Congress St., Salem, Mass, 01970 (U.S.A.) for copying beyond that permitted by Sections 107 or 108 of the U.S. Copyright Law. This consent does not extend to other kinds of copying, such as copying for general distribution, for advertising or promotional purposes, for creating new collective works, or for resale.
© Académie des Sciences, Paris, 1989
Les Comptes Rendus de l'Académie des Sciences sont une publication imprimée et diffusée par GAUTHIER-VILLARS, 1, boulevard Ney, 75018 Paris, Société anonyme, constituée pour 99 ans, au capital de 3089600 F. Siège social : 17, rue Rémy-Dumoncel, Paris. P.D.G. : J.-M. BOURGOIS. Actionnaire : BORDAS S.A. (99,8% des parts).
Directeurs de la publication et responsables de la rédaction : MM. les Secrétaires Perpétuels de l'Académie des Sciences, P. GERMAIN et A. JOST.
CONTENTS
1989 — VOLUME 309 — SECTION III — N° 10
Theoretical Biology
Maximization of pleasure, the answer to a conflict of motivations, Michel CABANAC. 397
An experiment has been set up to explore the hypothesis according to which behaviour is determined by the trend to maximize pleasure. Twelve subjects were placed individually in a situation of conflict where the pleasure of playing a videogame clashed with the increasing discomfort of a cold environment. The time lapse tolerated could be predicted from the algebraic sum of the rating of displeasure aroused by the cold environment and the rating of pleasure aroused by the videogame, obtained in other sessions. This result supports the working hypothesis and allows to conclude that pleasure is the common currency of tradeoffs among various motivations.
Molecular Biology
Nucleotidic mapping and kinetic model for a 4,666 base pairs heteroplasmic deletion in Kearns-Sayre syndrome, Isabelle NELSON, Luc d'AURIOL, Francis GALIBERT, Gérard PONSOT and Patrick LESTIENNE. 403
We report the nucleotidic mapping of a 4,666 base pairs deletion of the human mitochondrial DNA localized at positions 8571 and 13237 in a Kearns-Sayre syndrome patient. The gene fusion between the 15 N terminal amino acid residues of ATP synthetase subunit 6 and the 303 C terminal aminoacids of NADH dehydrogenase yields a potential protein of 35,000 d MW called A6-ND5. Deletion boundaries show a short inverted repeat ATCXTA. The heteroplasmic deletion mechanism is discussed in view of these data.
General Biochemistry
Hydroxylation at l'-carbon of deoxyribose as key step in the deavage of poly(dA) by a manganese porphyrin associated to potassium monopersulfate, Jean BERNADOU, Brigitte LAURETTA, Geneviève PRATVIEL and Bernard MEUNIER 409
Polyadenylic acid, poly (dA), was readily cleaved at neutral pH by meso-tetrakis (4-N-methylpyridyl) porphyrinatomanganeseIII pentaacetate after being activated by potassium monopersulfate. Spontaneously free adenine was released, and after heating an unstable sugar degradation product identified as 5-methylene-2-furanone was evidenced, indicating that C1-H is the main target of the porphyrin high-valent metal-oxo species.
Cancerology
Modifications of relative plasmatic concentrations in methylene and methyl groups in cancer: a proton NMR study, Jean VION-DURY, Martine SCIAKY, Sylviane CONFORT-GOUNY, Mostafa KRIAT, Roger FAVRE, François GRISOLI, Jean-Robert HARLÉ, Éric FONTANARAVA, Maurice MONGIN, Yves CARCASSONNE and Patrick COZZONE. 415
Fossel et al. [1] have recently proposed the proton NMR examination of plasmatic lipoproteins — and more precisely the determination of an index obtained from the averaged linewidth of the CH2 and CH3 résonances—as a possible tool for detection of cancer. Many evaluations conducted on an international basis have demonstrated that initial expectations were not met and that the test lacked sensitivity, specificity, and predictive value to be accepted as a screening and diagnostic tool. In our evaluation we have collected plasma from healthy subjects, from patients with various kinds of cancer at different stages of evolution and therapy, and from patients suffering from a variety of pathologies, including begnin tumors.
Evolution
Demonstration of the independent origin of digital pads in two phylogenetic lineages of Ranidae (Amphibia, Anura), Annemarie OHLER and Alain DUBOIS. 419
The fine study of the morphology of digital pads present in two groups of Ranidae demonstrates the existence of two distinct morphoclines leading from a non-differentiated digital extremity to a complete pad. Therefore, although the terminal stages of both morphoclines are identical in both groups, they cannot be considered homologous. These results support the phylogenetic hypothesis which had led to consider these two groups as distinct lineages.
General Ecology
Basai area increment in some semi-deciduous forests of Ivory Coast, Jean-Louis DEVINEAU 423
In Lamto forests (5°02'W, 6°13'N) girth growth of trees was monitored monthly with band dendrometers during 5 to 9 years. Annual and seasonal growth of stands basal area, as well as the relative importance of main climatic factors for wood production have been studied.
Molysmology
(see Tome 309, Series III, 1989, p. 447)
Animal Cytology
Ultrastructural detection of ribosomal RNA in animal cells by in situ hybridization on ultrathin sections using
a biotinylated probe, Françoise ESCAIG-HAYE, Vladimir GRIGORIEV and Jean-Guy FOURNIER 429
A genomic probe containing ribosomal sequences and labelled with biotine was used to hybridize rRNA molecules in ultrathin sections of animal cells embedded in Lowicryl K4M. After detection with streptavidin conjugated with 10 nm gold particles, ribosomal target sequences were localized preferentially in the dense fibrillar component of the nucleolus and in the polyribosome structures of the cytoplasm. The method presently described offers the possibility to detect rapidly and precisely ribosomal gene expression at the ultrastructural level, particularly under different physiological and pathological conditions.
Endocrinology
Testosterone specific binding and prolactin in the Gobius niger L. seminal vesicle cultured cells, Jean-Pierre BONNIN 435
Cultured seminal vesicle cells of Gobius niger L., precultured for about 15 days, are tested for their Testosteronebinding capacity. This whole cell system shows a specifie binding of the androgen, reaching saturation in the presence of increasing amounts of ligand and the Scatchard Plot indicates a good affinity (KD = 4.4x 10-9M), involving a number of sites of 5.06 x 10- 15 mole/culture. The possible existence of a second binding-site population with lower affinity and greater number of sites remains to be demonstrated. At 18°C, the time course shows a maximal binding after about 60 min. of incubation, followed by a rapid decline at 90 min. The competition experiments involving estradiol, 11 keto- and 11-hydroxytestosterone indicate an effective if not total specificity to these steroids. The cross-reaction percentages at the 50% binding level are respectively 10.9, 8.5, 4.02%. Ovine Prolactin treatment of the cultures for 6 days before the binding experiment significantly improves the specific binding level of testosterone if compared to the controls (p .019, p .005). This result indicates that the ProlactinTestosterone synergistic data already obtained on the seminal vesicles of Siluridae and Gobiidae is explained by a direct effect of the Prolactin on the androgen receptor level in the seminal vesicle cell.
Neurobiology
Stimulation of D1 and D2 dopaminergic receptors: effects on the electrically-evoked release of y-[3H] aminobutyric acid in the rat prefrontal cortex, Jacqueline PENIT-SORIA, Sylvie RETAUX and Yves MAURIN. . . . 441
The effects of D1 and D2 dopaminergic agonists and antagonists on the electrically-evoked release of y-[3H] aminobutyric acid (3H-GABA) have been studied on rat prefrontal cortex slices. The major part of the electrically-evoked release of3H-GABA appeared to be Ca++ dependent since a 62% decrease was observed when calcium was removed from the superfusion medium. Two specific D2 dopaminergic agonists, RU 24926 (10-7M) and lisuride (10-6M), respectively induced a 32% and a 50% inhibition of the electrically-evoked release of3HGABA. The selective D2 dopaminergic antagonist sulpiride (10- 5 M) totally abolished the effect of RU 24926 and partially abolished the effect of lisuride. The selective D1 agonist SKF 38393 (10-5M) did not affect 3HGABA release. These results suggest that in the rat prefrontal cortex in vitro, the dopaminergic modulation of 3H-GABA release is mediated through D2 but not D1 receptors. The activation of D2 dopaminergic receptors induces an inhibition of the electrically-evoked release of 3H-GABA.
Plant Physiology
Fixation and incorporation of atmospheric 14C-formaldehyde by sunflower leaves, Françoise GIRARD, Pascale JOLIVET and Yves BELOT. 447
The study of atmospheric 14C-formaldehyde incorporation in sunflower leaves (Helianthus anuus L.) has indicated that formaldehyde could bind on insoluble membrane proteins and on free amino acids, that there is free formaldehyde in the leaves and that this compound produces organic acids such as glycolate via a particular biochemical pathway.
Stimulation of indole alkaloid accumulation in suspension cell cultures of Catharanthus roseus (G. Don.) by cytokinins, Hippolyte KODJA, Di LIU, Jean-Michel MÉRILLON, Françoise ANDREU, Marc RIDEAU and Jean-Claude CHÉNIEUX. 453
Addition of cytokinins to culture media of tumorous cells of Catharanthus roseus stimulated the accumulation of two alkaloid markers (ajmalicine and serpentine). The response depended on the cell line, the nature and concentration of the cytokinin and the growth phase at which the cells were treated. It was enhanced by using media with high-saccharose level. It was inhibited by nifedipine, chlorpromazine or cycloheximide. Variation in cytoplasmic Ca2+ concentration might start a cascade of events leading to an increase of alkaloid levels.
Plant Cell Physiology
Time course of the cytoplasmic and vacuolar pH following pricking the cotyledons of Bidens pilosa L, Patrick BONNIN, Michel GENDRAUD and Marie-Odile DESBIEZ. 459
Pricking the cotyledons of young Bidens pilosa L. plants induces the inhibition of the hypocotyl growth. This long-distance effect is observed when the plants have been transferred previously onto deionized water. Pricking the plant cotyledons does not affect their growth; however, this induces a decrease of the cytoplasmic pH of the cotyledonary cells, which is observed 24 hrs. after pricking. The cytoplasmic pH of the hypocotyl cells also decreases, but here, the modification is fast and transient; it occurs just after the cotyledonary prickings inhibit hypocotyl growth. This might correspond to one of the first step of the expression of a growth inhibition message induced by pricking the cotyledons.
Plant Nutrition
Effect of maritime pine rhizosphere on water soluble copper of the soil, Etienne SAUR and Alain GOMEZ 465
Water soluble copper was determined by electrothermic atomic absorption spectrophotometry. A correlation between soluble copper and its bioavailability for roots was shown. Copper solubility in acid sandy soils increased markedly with pine culture or root exudate solutions. Some organic acids (tartric, malic, oxalic and citric acids) known as existing in pine root exudates showed a similar effect on the soil copper.
III
C. R. Acad. Sci. Paris, t. 309, Série III, p. 397-402, 1989 397
Biologie théorique/ Theoretical Biology
La maximisation du plaisir, réponse à un conflit de
motivations
Michel CABANAC
Résumé — L'expérimentation vise à éprouver l'hypothèse selon laquelle tout comportement est motivé par la tendance à maximiser le plaisir. Douze sujets ont été placés individuellement dans une situation de conflit de motivations où le plaisir d'un jeu vidéo était affronté à l'inconfort grandissant d'un environnement froid. Chaque sujet a choisi d'interrompre le conflit à un instant prévisible selon la somme algébrique des estimations de l'inconfort éveillé par le froid et du plaisir à jouer. Ce résultat est en faveur de l'hypothèse de départ et permet de conclure que le plaisir est la « monnaie commune » permettant la comparaison de motivations aussi différentes que l'inconfort et le jeu.
Maximization of pleasure, the answer to a conflict of motivations
Abstract — An experiment has been set up to explore the hypothesis according to which behaviour is determined by the trend to maximize pleasure. Twelve subjects were placed individually in a situation of conflict where the pleasure of playing a videogame clashed with the increasing discomfort of a cold environment. The time lapse tolerated could be predicted from the algebraic sum of the rating of displeasure aroused by the cold environment and the rating of pleasure aroused by the videogame, obtained in other sessions. This result supports the working hypothesis and allows to conclude that pleasure is the common currency of tradeoffs among various motivations.
Abridged English Version — One shortcoming of the theories of optimalization of behaviour is that the mechanism by which behaviour is optimized, is never mentioned; these theories do not explain why the subject "decides". Yet, the quantitative study of the relationship between the motivation, the behaviour, and the environmental parameters has produced results showing the paramount importance of sensory pleasure in the determinism of physiological behaviour [1]. One may question whether it is possible to extend this conclusion to domains other than biology. The notion of "behavioural common path" [7] is especially enlightening from this perspective. Paraphrasing the image created for the motoneuron, McFarland and Sibly pointed out that behaviour is also a final common path on which all motivations converge. It can be accepted that, at each instant, a subject responds to the most urgent motivation and it can be expected that the brain operates the ranking by using a common currency [6]. The thesis presented here is that pleasure is this common currency, and that the maximization of multidimensional pleasure (and the minimization of multidimensional displeasure) leads to the solution of motivational conflicts. This was verified, here, in a conflict where a biological motivation clashed against a purely psychological one.
The general principle of the experiment consisted in exposing each subject to three sessions: in the first session (play) the subject played a videogame for 1 hr., and every 5 min. was requested to rate on a magnitude estimation scale, the pleasure of playing the videogame; in the second session (cold) the ambient temperature (Ta) was reduced progressively from 25 to 7°C over 1 hr., and every 5 min. the subject was requested to rate the pleasure or the displeasure aroused by Ta. In the third session (conflict) both videogame and cold Ta were presented simultaneously and the only instruction received by the subjects was that they could interrupt the session whenever they wanted to. During ail sessions, including conflict, heart rate, systolic and diastolic arterial pressure, tympanic temperature, skin temperature of the hand and the back were recorded every 5 min. from the half naked subjects. The
Note présentée par Michel JOUVET.
0249-6313/89/03090397 $ 2.00 © Académie des Sciences
C. R., 1989, 2e Semestre (T. 309) série III — 29
398 C. R. Acad. Sci. Paris, t. 309, Série III, p. 397-402, 1989
sequence of three sessions was presented in counterbalanced orders to the 12 subjects, 6 males and 6 females. Informed consent was obtained after the experiment had been fully described. After debriefing, no subject had guessed what was the aim of the experiment.
The main resuit of the experiment was the duration of the stay of the subjects in the climatic chamber in conflict situation. This is shown by arrows on Figure 1 for the subjects with the shortest and the longest durations in conflict sessions. This figure gives also the time course of positive ratings for the pleasure of playing and negative ratings for the displeasure of cold discomfort. None of the autonomic variables monitored correlated with the ratings in such a way as to predict the duration of the conflict session. To hold true the hypothesis under test would imply that the subjects stayed in the cold during the conflict sessions as long as the pleasure of playing the videogame was stronger than the displeasure aroused by the decreasing Ta. It can be expected that the subjects would end the conflict when the sum of the rating obtained in cold session, plus that obtained in play session would be equal to zéro. This can be verified first by the two exemples of Figure 1; both subjects stayed somewhat longer than the predicted time, but the basic hypothesis remains valid. Figure 2 shows the results of the group of 12 subjects. Actual duration is plotted against theoretical duration as obtained through two différent methods: (i) graphie, theoretical duration obtained from the simple time course plot, as the time when positive rating was equal to négative rating as in Figure 1; (ii) algebraic, theoretical duration obtained from the family of two équations fitted to the time courses of both ratings, when their sum was equal to zéro. Both methods gave similar results. The coefficient of corrélation as well as the slope was close to 1 whatever the method to obtain theoretical duration. From the ratings of pleasure and displeasure, it was therefore possible to predict the actual duration of the conflict sessions.
The intersect of the regression line with the y axis in Figure 2 was y = 5.3 min. This indicates that the subjects did not stop the conflict at the time when both motivations, to stay in the climatic chamber and to leave it, became equal but some minutes later. Such a delay necessary for the subjects to make up their mind can be considered as the "cost of changing" [5].
The results validate the hypothesis tested. It is therefore permitted to conclude that pleasure was the common currency of the motivations here pitted against each other. This extends to ludic motivation the conclusions made previously mainly on physiological behaviours ([2], [3], [4]). If maximization of the algebraic sum of pleasures aroused by behaviours, as different from each other as thermoregulatory behaviour and playing a game, was the key to the conflict, it is likely that this resuit may be extrapolated to ail motivations as a general law predicting behaviour.
INTRODUCTION. — Un postulat de base de l'éthologie est que le comportement tend vers l'optimalité, mais les théories de l'optimisation ne mentionnent jamais le mécanisme par lequel le comportement s'optimise. En d'autres termes ces théories n'expliquent en rien pourquoi le sujet « décide ». Avec des sujets humains on peut explorer quantitativement les relations entre la motivation, le comportement du sujet et les paramètres environnementaux. Cette méthode a produit des résultats montrant l'importance fondamentale du plaisir dans le déterminisme des comportements physiologiques [1] et dans l'optimisation du comportement de sujets placés dans des conflits de motivations physiologiques ([2], [3], [4]).
C. R. Acad. Sci. Paris, t. 309, Série III, p. 397-402, 1989 399
On peut se demander cependant s'il est permis d'étendre cette conclusion à d'autres domaines que la biologie. Dans cette perspective la notion de « voie finale commune comportementale » [7] est particulièrement éclairante. Paraphrasant l'image du motoneurone voie finale commune de la motricité, McFarland et Sibly ont souligné que le comportement est aussi une voie finale commune sur laquelle convergent toutes les motivations qu'elles soient de nature physiologique, morale, esthétique, ludique ou sociale. L'image incorpore donc toutes les motivations en une catégorie unique. Cette démarche est justifiée par le fait que les comportements sont le plus souvent exclusifs : on ne peut simultanément travailler et dormir. Le cerveau, responsable du comportement doit donc à chaque instant classer les priorités pour attribuer « en temps partagé » la réponse comportementale aux différentes motivations en conflit. Si à chaque instant le cerveau accomplit cette fonction de décision de la plus urgente motivation à satisfaire, on doit s'attendre à ce qu'il dispose d'une « monnaie commune » [6] pour permettre la comparaison des urgences.
La thèse présentée ici est que le plaisir est cette monnaie commune et que la maximisation du plaisir pluridimensionnel est la solution des conflits de motivations. La situation expérimentale utilisée pour vérifier l'hypothèse était un conflit entre une motivation physiologique, l'inconfort thermique au froid et une motivation purement psychologique, le plaisir à jouer un jeu vidéo.
MÉTHODES. — Le principe général de l'expérimentation a été utilisé précédemment avec des conflits physiologiques ([2], [3], [4]); il consiste à placer le sujet dans trois situations au cours de trois séances différentes séparées chacune par une semaine. Les deux premières séance sont destinées uniquement à recueillir les estimations quantitatives de plaisir à jouer et de déplaisir à se trouver au froid. La première séance (jeu) a une durée fixe de 1 h : le sujet joue à un jeu vidéo de son choix pendant 60 mn. Toutes les 5 mn on lui demande d'estimer, sur une échelle quantitative, la grandeur du plaisir à jouer. La deuxième séance (froid) a également une durée fixe de 1 h : la température ambiante est ajustée à 25°C au début puis elle baisse progressivement jusqu'à 7°C au bout de 1 h et, chaque 5 mn, le sujet estime la grandeur du déplaisir éveillé par le froid. Les sujets reçoivent pour instruction de donner des nombres positifs pour le plaisir, des nombres négatifs pour le déplaisir et zéro pour l'indifférence. Les sujets savent qu'ils peuvent interrompre l'expérimentation à tout moment.
La troisième séance (conflit) est destinée à mesurer la durée tolérée lorsqu'on présente à la fois le jeu vidéo et le froid ambiant. On indique aux sujets qu'ils peuvent interrompre la séance quand ils le désirent, et on ne leur demande aucune estimation de plaisir ni de déplaisir. Au cours des trois séances on mesure toutes les 5 mn la fréquence cardiaque, les pressions artérielles diastolique et systolique, la température tympanique et les températures cutanées de la main droite et du centre du dos. Les sujets sont à demi-nus. La séquence des trois séances combinait six possibilités, jeu-froid-conflit, froid-jeu-conflit, jeu-conflit-froid, etc. Afin de supprimer toute possibilité d'influence de la séquence, chacune des six combinaisons a été présentée à deux sujets, un homme et une femme, avec un total de 12 sujets. Le consentement éclairé à été recueilli après que la nature et les conséquences possibles de l'expérience aient été décrites et expliquées. A la fin de l'expérimentation aucun sujet n'avait deviné que le but de l'expérience était la mesure de la durée tolérée au cours de la séance de conflit.
RÉSULTATS. — Le résultat principal de l'expérimentation était la durée du séjour des sujets dans la chambre climatique au cours de la séance de conflit. La figure 1 donne, à
400 C. R. Acad. Sci. Paris, t. 309, Série III, p. 397-402, 1989
titre d'exemple, la durée tolérée (flèche) par le sujet au plus court séjour (à gauche) et au plus long séjour (à droite) en situation de conflit. La figure indique en outre en fonction du temps pour chacun des deux sujets, les évaluations données au plaisir du jeu et au déplaisir du froid. On a converti l'évaluation négative du déplaisir au froid en positif afin que les deux courbes se croisent, pour la clarté de la figure. Aucune des variables autonomes enregistrées périodiquement n'a montré de corrélation avec les évaluations, de façon prédictive de la durée des séances de conflit. On peut donc rejeter ces variables comme déterminants directs de la durée de tolérance du conflit. L'hypothèse à l'épreuve indique qu'à chaque instant les sujets tendent à maximiser la somme algébrique de leur plaisir/déplaisir. Pour vérifier l'hypothèse il faudrait que les sujets restent dans la chambre climatique pendant le conflit aussi longtemps que le plaisir de jouer soit plus grand que le déplaisir croissant du froid. On peut voir qu'il en a été bien ainsi pour les deux sujets donnés en exemple figure 1. On s'attendait à ce que chaque sujet termine sa session de conflit lorsque la somme des deux évaluations serait égale à zéro, c'est-à-dire lorsque les deux courbes des évaluations (obtenues dans des séances différentes) se croisent. On peut voir que le sujet de gauche a terminé la séance (flèche) environ 6 mn après le croisement des courbes. Le sujet de droite était un cas particulier car elle aimait tant le jeu vidéo que les courbes de ses évaluations ne se croisent pas au cours des 60 mn de la durée des séances de jeu et de froid. Elle a confirmé cela en dépassant au cours de la séance de conflit la durée de 60 mn des deux autres séances. La flèche indique qu'elle est restée 74 mn au cours du conflit soit environ 9 mn au-delà de l'instant du croisement des deux
Fig. 1. — Résultats obtenus sur les sujets restés le moins longtemps (à gauche) et le plus longtemps (à droite) dans la chambre climatique lors de leur séance de conflit. Les évaluations positives du plaisir à jouer au jeu vidéo ont été obtenus en une séance (^). Les évaluations négatives du déplaisir créé par le froid progressif ont été obtenus en une autre séance (D); au début de cette séance la température ambiante tiède était agréable et évaluée positivement. Afin de comparer aisément les deux évaluations et amener les deux courbes à se couper, les évaluations du déplaisir créé par le froid ont été multipliées par — 1 sur la figure. Au cours de la troisième séance le jeu et le froid étaient présentés simultanément, et la flèche indique la durée réellement tolérée par le sujet.
Fig. 1. — Results obtained over three separate sessions by the subjects who endured the shortest (left) and the longest (right) duration on the third session. The positive ratings of videogame (pleasure) were obtained in one session (^). The ratings related to the cold environment (D) started positive (pleasure), then turned negative (displeasure) after a few minutes; they were obtained in another session. To facilitate the comparison of both ratings, and let the curves cross each other, the cold ratings have been multiplied by — 1 on the Figure. In the third session, both videogame and cold environment were present, and the arrows show the actual duration of the sessions.
C. R. Acad. Sci. Paris, t. 309, Série m, p. 397-402, 1989 401
courbes, obtenu par extrapolation. Ainsi les deux sujets de la figure 1 sont demeurés au froid en conflit plus longtemps qu'on ne s'y attendait, cependant l'hypothèse de départ demeure valide car l'erreur sur la durée réelle n'était que de +6mn et +9 mn en comparaison avec une durée prévue de 5 mn pour le sujet de gauche et plus de 60 mn pour le sujet de droite. Rappelons que les sujets donnés en exemple étaient loin d'être les « meilleurs », du point de vue de l'adéquation de la durée réelle à la durée théorique, mais qu'ils ont été choisis pour avoir la plus courte et la plus longue séance de conflit.
La figure 2 donne les résultats obtenus sur le groupe de 12 sujets. La durée réelle, variable dépendante, est représentée en fonction de la durée théorique, variable indépendante. La durée théorique a été calculée de deux façons différentes : (i) graphique, la durée théorique a été prédite simplement à partir des évolutions des évaluations quantitatives de plaisir et de déplaisir comme le temps où la somme des deux évaluations était égale à zéro (intersection simple); (ii) algébrique, la durée théorique a été calculée à l'aide des deux équations de régression des deux évaluations en fonction du temps, comme la valeur de x pour laquelle y'+y" = 0. Les deux méthodes de calcul ont donné des résultats similaires comme on voit pour les 12 sujets, figure 2. Les équations de régression linéaire de la durée réelle en fonction des deux durées théoriques étaient les suivantes :
Fig. 2. — Durée réelle des séances de conflit des 12 sujets, considérée comme la variable indépendante, représentée en fonction de la durée théorique considérée comme la variable indépendante. La durée théorique a été obtenue de deux façons : graphique, première intersection des deux courbes d'évaluation de plaisir à jouer et de déplaisir du froid; algébrique à l'aide de la famille de deux équations : évaluation—jeu =f(temps) et évaluation—froid = g (temps), et en posant évaluation—jeu+évaluation—froid=zéro. La ligne continue est la droite de régression de la durée réelle contre la durée théorique obtenue par la méthode algébrique (y=0,99 x + 5,2, avec r = 0,96). La droite de régression de la durée théorique obtenue par la méthode graphique est pratiquement superposée et n'est pas représentée. La ligne interrompue indique le cas théorique où la durée réelle serait égale à la durée théorique. On peut voir que la durée réelle, pour le groupe de sujets, était égale à la durée théorique plus 5,3 mn.
Fig. 2. — Actual duration endured by the 12 subjects, considered the dependent variable, plotted against theoretical duration, considered the independent variable. Theoretical duration was obtained through two different methods: (i) graphie, as the first crossing of the respective time courses of positive rating of the pleasure of playing with negative rating ofthe displeasure ofcold discomfort; (ii) algebraic, as the solution of the family of two equations: y'=f (rating play) and y"'=g (rating cold), with y'=y". The dotted line gives the hypothetical case where actual would equal theoretical duration. The solid Une gives the regression of actual duration (algebraic method) against theoretical (y = 0.99 x + 5.2, r = 0.96). The regression line obtained with graphie method is practically superimposed. It can be seen that actual duration for the group was theoretical duration +5.3 min.
402 C. R. Acad. Sci. Paris, t. 309, Série III, p. 397-402, 1989
(i) graphique : y= 1,09 x +2,9 avec r = 0,98 et, (ii) algébrique : y=0,99x +5,2 avec r=0,96. Les coefficients de corrélation (r), aussi bien que les pentes sont voisins de 1, quelle que soit la méthode d'obtention de la durée théorique. Il est donc possible de prédire la durée réelle des séances de conflit, à partir des évaluations quantitatives de plaisir et de déplaisir obtenues dans des séances différentes. Ce résultat valide l'hypothèse de départ.
DISCUSSION. — Il est donc permis de conclure que le plaisir/déplaisir était la monnaie commune aux deux motivations affrontées dans le conflit étudié ici. Cela étend à la motivation ludique les conclusions obtenues précédemment avec des motivations physiologiques ([2], [3], [4]). Si la maximisation de la somme algébrique de plaisirs éveillés par des comportements aussi différents l'un de l'autre que la thermorégulation et le jeu était la clef du conflit, il est vraisemblable que ce résultat peut s'extrapoler à toutes les motivations comme une loi générale de prédiction du comportement en situation de conflit de motivation.
L'ordonnée à l'origine de la droite de régression, figure 2, est 5,3 mn. Cela indique que les sujets n'ont pas quitté l'environnement froid à l'instant où les deux motivations étaient égales mais quelques minutes plus tard, comme on l'a vu pour les deux sujets de la figure 1. Ce délai est semble-t-il nécessaire pour que les sujets prennent leur décision, puisqu'à l'instant où les deux motivations sont égales les sujets n'ont pas de raison de poursuivre la séance, mais ils n'en ont pas non plus pour l'interrompre. Il est vraisemblable que cette interprétation explique ce que Larkin et McFarland appellent le « coût du changement » (cost of changing) [5]. Cette dernière notion pourrait n'être que le simple délai avant que la décision ne devienne évidente pour le sujet en conflit de motivations.
Travail subventionné par le C.R.S.N.G., Canada (GP 0040955). Note remise le 3 janvier 1989, acceptée après révision le 19 juin 1989.
RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES
[1] M. CABANAC, Science, 173, 1971, p. 1103-1107.
[2] M. CABANAC, Physiol. Behav., 38, 1986, p. 839-843.
[3] M. CABANAC et C. FERBER, Appetite, 8, 1987, p. 15-28.
[4] M. CABANAC et J. LE BLANC, Am. J. Physiol, 244, 1983, p. R621-R628.
[5] S. LARKIN et D. MCFARLAND, Anim. Behav., 26, 1978, p. 1237-1246.
[6] D. MCFARLAND, Animal Behaviour, Pitman, London, 1985.
[7] D. MCFARLAND, R. M. SIBLY, Philos. Trans. Roy. Soc. (London), 270, 1975, Biol., p. 265-293.
Département de Physiologie, Faculté de Médecine, Université Laval, Québec G\K 7P4, Canada.
C. R. Acad. Sci. Paris, t. 309, Série III, p. 403-407, 1989 403
Biologie moléculaire/Molecular Biology
Identification nucléotidique et modèle cinétique d'une
délétion hétéroplasmique de 4 666 paires de bases de l'ADN
mitochondrial dans le syndrome de Kearns-Sayre
Isabelle NELSON, LUC d'AURIOL, Francis GALIBERT, Gérard PONSOT et Patrick LESTIENNE
Résumé — Nous avons déterminé au niveau nucléotidique les bordures d'une délétion de 4 666 paires de bases, dans l'ADN mitochondrial, à la position 8571 et 13237, chez un patient atteint du syndrome de Kearns-Sayre. La fusion des gènes, entre les 15 acides aminés N terminaux de la sousunité 6 de l'ATP synthétase et des 303 acides aminés C terminaux de la sous-unité 5 de la NADH deshydrogénase, produirait potentiellement une nouvelle protéine de 35000 d appelée A6-ND5. La jonction de la délétion fait apparaître une répétition inverse ATCXTA. Le mécanisme des délétions hétéroplasmiques est aussi discuté.
Nucleotidic mapping and kinetic model for a 4,666 base pairs heteroplasmic deletion
in Kearns-Sayre syndrome
A bs tract — We report the nucleotidic mapping of a 4,666 base pairs deletion of the human mitochondrial DNA localized at positions 8571 and 13237 in a Kearns-Sayre syndrome patient. The gene fusion between the 15 N terminal amino acid residues of ATP synthetase subunit 6 and the 303 C terminal aminoacids of NADH dehydrogenase yields a potential protein of 35,000 d MW called A6-ND5. Deletion boundaries show a short inverted repeat ATCXTA. The heteroplasmic deletion mechanism is discussed in view of these data.
Abridged English Version — INTRODUCTION. — Kearns-Sayre syndrome (KSS) is characterized by ophtalmoplegia, pigmentary retinopathy and cardiac conduction defects [1]. In a previous communication we hâve first shown an heteroplasmic mitochondrial DNA deletion of 4.7 kbase pairs in the muscle of a patient presenting KSS [2].
In order to identify the deletion at the nucleotidic level, we have amplified in vitro by the polymerase chain reaction [3], the outer border of the deletion, then cloned and sequenced the resulting DNA fragment.
METHOD. — DNA amplification. — 1 ug of total muscle DNA was amplified in 100 ul reaction mixture containing 10 mM Tris-HCl pH 8.5, 50 mM KC1, 2 mM MgCl2, 0.01% (w/v) gelatin, 0.2 mM of each dNTP, 10% DMSO (v/v), 0.1% (v/v) Triton X 100, 30 pmoles of each primer and 2.5 U of Taq polymerase (Promega). The amplification was performed with one cycle of 5 min. denaturation at 90°C, 2 min. annealing at 50°C 4 min. elongation at 70°C, 34 cycles 2 min. at 90°C, 2 min. at 50°C, 4 min. at 70°C with 10 min. at 70°C for elongation of the last cycle. The oligonucleotide primers
Pl'I (5' GGATCC TGCCCATCGTCCTAGAATT3') and
PI'II (5' CTGCAG GTCCTCCTATTTTTCGAATA3')
had at their position the BamHI, and PstI, linkers (italic). The amplified fragment was purified on 1 % agarose gel, digested with PstI and BamHI, then cloned into the BamHI, PstI sites of Ml3 DNA. The single stranded template was sequenced using the dideoxytermination chain using the sequenase kit (United States Biochemicals).
RESULTS. — Oligonucleotides mapping at position 8205 to 8224 (Pl'I) and at position 13420 to 13400 (PI'II) [4] were used to amplify by PCR a 561 base pair fragment which
Note présentée par Piotr SLONIMSKI. 0249-6313/89/03090403 $ 2.00 © Académie des Sciences
404 C. R. Acad. Sci. Paris, t. 309, Série III, p. 403-407,1989
was then cloned into M13, then sequenced by the dideoxytermination chain according to Sanger. Figure 1 A shows the resulting autoradiogram of heavy strand sequence with deletion boundaries mapping at positions 8571 and 13237 respectively providing a 4,666 base pair deletion in agreement with our previous estimation [2].
Analysis of the deletion boundaries shown on Figure 1B indicates a short ATCXTA inverted repeat outside of the deletion. The universal TAG termination codon for ATP synthetase A6L is replaced by TAA, another terminaison codon. The deletion involves indispensable gènes for tRNAGlu, tRNAArg, tRNAHis, tRNASer and rRNALeu as well as genes for subunit III of cytochrome C oxidase and subunits 3, 4L, 4 and almost half of subunit 5 of NADH dehydrogenase.
The fusion of the deletion borders allows the potential formation of an in frame fused protein called A6-ND5 between the 15 N terminal aminoacid residues of ATP synthetase subunit 6 and the 303 C terminal residues of NADH dehydrogenase subunit 5 producing a protein of 35,000 d MW.
DISCUSSION. — These data differ from the report of a 13 base pairs repeat at the deletion boundaries [5] or of short repeat starting at the D Loop [6] which suggest homologous recombination. On other hand a short ATCXTA inverted repeat is found at the outer border of our deletion close to hairpin structures. The cleavage site also differs from plant an yeast recombination site from the cleavage site of T4 DNA topoisomerase II [7] and from E. coli DNA gyrase cleavage site [8].
Our previous data shows that ail deletions map in the potentially single stranded DNA region of the displaced H strand during H strand DNA replication between OH and OL. As shown on Figure 2 we put forward the hypothesis that a double break occurs on the H strand as a resuit of internai hairpin formation allowing deletion and ligation process. In this case, a single H strand of the length of the deletion called "P" structure could be formed during the replication cycle due to a lag in priming and replication at the light strand DNA origin of replication. This model would explain heteroplasmy since at each replication cycle of the normal sized molecule a deleted molecule would be synthesized as a resuit of the excision of the "P" structure.
That new protein A6-ND5 could compete with the normal one in the edification of respiratory chain complexes I and V, and also could present peculiar catalytic activities. Worthwhile to note, Kearns-Sayre patients have an elevated protein content in their cerebrospinal fluid, and abnormal proteins results from in mitochondria translation [9]. Further studies with antibodies directed against the fusion peptide may give a new diagnostic tool to Kearns-Sayre syndrome patients as well as providing a direct evidence for a biological function to the deleted genome.
INTRODUCTION. — Le syndrome de Kearns-Sayre est caractérisé par une ophtalmoplégie, une rétinite pigmentaire et des troubles de la conduction cardiaque [1]. Lors d'une précédente communication nous avons mis en évidence une délétion hétéroplasmique de 4,7 kpaires de bases dans l'ADN mitochondrial provenant du muscle d'un patient présentant ce syndrome [2].
Afin de procéder à la localisation précise de la délétion au niveau nucléotidique, nous avons procédé à l'amplification in vitro [3] du segment encadrant la délétion puis l'avons clone et séquence.
C. R. Acad. Sci. Paris, t. 309, Série III, p. 403-407, 1989 405
MÉTHODES. — Amplification du DNA. — 1 ug de DNA total provenant du muscle du patient [2] a été amplifié dans un milieu réactionnel de 100 ul contenant 10 mM de TrisHC1 pH 8,5, 50 mM KC1, 2 mM MgCl2, 0,01 % (w/v) gelatin, 0,2 mM des 4 dNTP, 10% (v/v) DMSO, 0,1 % (v/v) Triton X100, 30 pmoles de chaque oligonucléotide amorce et 2,5 unités de Taq polymerase (Promega). L'amplification a été faite selon la méthode suivante : 1 cycle de dénaturation à 90°C pendant 5 mn, puis 2 mn d'association à 50°C, 4 mn d'élongation à 70°C, 34 cycles de 2 mn à 90°C, 2 mn à 50°C, 4 mn à 70°C puis 10 mn à 70°C pour l'élongation du dernier cycle. Les oligonucléotides amorces
Pl'I (5' GGATCC TGCCCATCGTCCTAGAATT3') et
PI'II (5' CTGCAG GTCCTCCTATTTTTCGAATA 3')
ont à leur extrémité 5' les sites de restriction BamHI et PstI (italiques).
Le fragment amplifié a été purifié sur gel d'agarose à 1 % digéré par PstI et BamHI puis clone dans les sites BamHI et PstI du vecteur M13 puis séquencé selon la méthode décrite par Sanger en utilisant le kit de sequenase (United States Biochemicals).
Fig. 1. — Identification nucléotidique de la délétion. La partie' gauche (A) montre l'autoradiogramme de la séquence du brin lourd et la jonction de la délétion aux nucléotides 8571 et 13237. La partie droite (B) montre l'organisation génique des bordures de la délétion avec les nucléotides A (O) et A (•) représentant les bordures de la délétion respectivement 8571 et 13237. Dans ce cas la séquence du brin léger est indiquée.
Fig. 1. — Nucleotidic boundaries ofthe deletion. Part A: autoradiogram of the H strand sequence. Part B: A (O) and A (#) represent nucleotides 8571 and 13237 respectively with light strand sequence.
406 C. R. Acad. Sci. Paris, t. 309, Série III, p. 403-407, 1989
RÉSULTATS. — Les oligonucléotides situés en position 8205 à 8224 (Pl'I) et 13420 à 13400 (PI' II) [4] ont été utilisés pour amplifier un fragment de 561 paires de bases. Ce fragment a été clone dans le vecteur Ml3 puis séquence selon la méthode des dideoxy de Sanger.
La figure 1A montre l'autoradiogramme de la séquence du brin lourd dans M13Mpl9 avec des bordures de délétion situées aux positions 8571 et 13237 respectivement donnant ainsi une délétion de 4 666 paires de bases en accord avec notre approximation précédente [2].
L'analyse de la jonction de la délétion indiquée sur la figure 1 B montre une séquence inversée ATCXTA à l'extérieur de celle-ci. Le codon de terminaison universel TAG de l'ATP synthétase 6 est remplacé par un autre codon stop TAA. La délétion comporte les gènes indispensables des tRNAGlu, tRNAArg, tRNAHis, tRNASer et tRNALeu ainsi que les gènes codant pour la sous-unité III de la cytochrome C oxydase et les sous-unités 3, 4L, 4 et la moitié de la sous-unité 5 du complexe de la NADH deshydrogénase.
La fusion des bordures de la délétion permettrait la formation potentielle d'une protéine fusion appelée A6-ND5 entre les 15 acides aminés N terminaux de l'ATP synthétase 6, et les 303 acides aminés C terminaux de la sous-unité 5 de la NADH deshydrogénase, une protéine de 35 000 d de poids moléculaire.
DISCUSSION. — Le résultat présenté dans cette communication diffère de 2 résultats publiés récemment. L'un indique qu'aux bordures de la délétion de l'ADN mitochondrial humain il y a une répétition de 13 paires de bases [5] et l'autre une courte répétition aux
Fig. 2. Mécanisme hypothétique de la délétion. Le cycle normal de replication de l'ADN mitochondrial (réactions 1 et 2) est suivi de la délétion du brin lourd déplacé (3) donnant une molécule normale (N), une molécule délétée (6) et une molécule relique du brin lourd ("p").
Fig. 2. — hypothetical model for the deletion mechanism with abnormal reaction 3 yielding to the deletion ofthe displaced heavy strand.
C. R. Acad. Sci. Paris, t. 309, Série III, p. 403-407, 1989 407
bordures de la D loop [6] qui suggèrent une recombinaison homologue. Par contre une courte répétition inverse ATCXTA est trouvée aux bordures externes chez notre patient, localisée à proximité de structures en épingles à cheveux. La séquence du site de coupure diffère des sites de clivage de la DNA topoisomerase II du bactériophage T4 [7], et de la DNA gyrase de E. coli [8].
Nos expériences précédentes ont montré que les délétions étaient toujours localisées dans une région potentiellement en simple brin pendant la réplication du brin lourd (entre l'origine de réplication du brin lourd et celle du brin léger) comme indiqué sur la figure 2. Nous proposons donc l'hypothèse qu'une double coupure se produise dans le brin lourd en conséquence des appariements internes ou externes ce qui permettrait les réactions de délétion et de ligation. Dans ce cas un brin de séquence lourde de la longueur de la délétion appelé « P » pourrait être formé à cause d'un retard dans la synthèse du brin léger. Ce modèle expliquerait l'hétéroplasmie après ligation au point de rupture de la délétion sur le brin lourd, la DNA polymerase pourrait répliquer entièrement le génome délété tandis que la replication du brin léger se produirait normalement.
La nouvelle protéine A6-ND5 pourrait compétitivement inhiber la formation des complexes de l'ATP synthétase et de la NADH deshydrogénase et ainsi déstabiliser les complexes de la chaîne respiratoire. Des études ultérieures cherchant à mettre en évidence la protéine A6-ND5 permettraient de prouver que le génome hétéroplasmique délété est fonctionnel dans ces maladies.
Il est intéressant de noter que les patients atteints du syndrome de Kearns-Sayre ont une teneur élevée ( > 1 mg/ml) de protéines dans leur liquide céphalorachidien et que des protéines anormales sont produites par des mitochondries provenant de ces patients [9].
Nous remercions l'Association française pour la lutte contre les Myopathies pour son soutien. Note remise le 21 juillet 1989, acceptée le 31 juillet 1989.
RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES
[1] T. P. KEARNS et G.-P. SAYRE, A.M.A. Archives of Ophtalmology, 60, 1958, p. 280-289.
[2] P. LESTIENNE et G. PONSOT, Lancet, i, 1988, p. 885.
[3] R. K. SAIKI, D. H. GELFLAND, S. STOFFEL, S. J. SHARF, R. HIGUCHI, G. T. HORN, K. B. MULLIS et H. A. ERUCH, Science, 239, 1988, p. 487-491.
[4] ANDERSON et coll., Nature, 290, 1981, p. 457-465.
[5] E. A. SCHON, R. RIZZUTO, C. T. MORAES, H. NAKASE, M. LEVIANI et S. DIMAURO, Science, 1989, p. 346-349.
[6] M. ZEVIANI, S. SERVIDEI, C. GALLERA, E. BERTINI, S. DIMAURO et S. DIDONATO, Nature, 339, 1989, p. 309-311.
[7] L. F. Liu, T. C. ROWE, L. YANG, K. M. TEWEY et G. L. CHEN, J. Biol. Chem., 258, 1983, p. 1536515370.
[8] L. M. FISCHER, K. MIZUUCHI, M. H. O'DEA, H. OHMORI et M. GELLERT, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 78, 1981, p. 4165-4169.
[9] E. BYRNE, S. MARZUKI, N. SATTAYASAI, X. DENNETT et I. TROUNCE, Neurology, 37, 1987, p. 1530-1534.
I. N. et P. L. : Unité 298 I.N.S.E.R.M., CH.R.U. Angers, 49033 Angers Cedex;
L. d'A. et F. G. : Laboratoire de Recombinaison génétique,
Hôpital Saint-Louis, 75475 Paris Cedex 10;
G. P. : Service de Neuropédiatrie, Hôpital Saint-Vincent-de-Paul, 75674 Paris.
C. R. Acad. Sci. Paris, t. 309, Série III, p. 409-414, 1989 409
Biochimie générale/General/ Biochemistry
Sur l'hydroxylation du carbone-1' du déoxyribose comme mécanisme de coupure du poly (dA) par une porphyrine de manganèse associée au monopersulfate de potassium
Jean BERNADOU, Brigitte LAURETTA, Geneviève PRATVIEL et Bernard MEUNIER
Résumé — L'acide polydéoxyadénylique, poly(dA), traité à pH 7,2 par un système oxydant associant le pentaacétate de méso-tétrakis(N-méthyl-4-pyridyl) porphyrinatomanganèsIII à un donneur d'oxygène hydrosoluble, le monopersulfate de potassium, est fragmenté et libère de l'adénine, spontanément, et de la méthylène-5-furanone-2, après chauffage. Cette observation doit être interprétée comme la résultante d'une hydroxylation en position 1' du déoxyribose (avec libération concomitante de la base) et d'une double P-élimination (coupure des deux liaisons esters en 3' et 5' avec relargage de la partie sucre résiduelle).
Hydroxylation at l'-carbon of déoxyribose as key step in the cleavage of poly (dA)
by a manganese porphyrin associated to potassium monopersulfate
Abstract — Polyadenylic acid, poly(dA), was readily cleaved at neutral pH by meso-tetrakis (4-Nmethylpyridyl) porphyrinatomanganeseIII pentaacetate after being activated by potassium monopersulfate. Spontaneously free adenine was released, and after heating an unstable sugar degradation product identified as 5-methylene-2-furanone was evidenced, indicating that C1-H is the main target of the porphyrin high-valent metal-oxo species.
Abridged English Version — During the last decade besides the great research effort directed towards the isolation and evaluation of naturally ocurring DNA cleaving agents [1], it should be noted the interest of several groups on the design and synthesis of model compounds that can specifically recognize and eut DNA. For example, nuclease activity has been demonstrated for porphyrin derivatives after photoactivation ([2], [3], [4]) or after being activated by molecular oxygen in the presence of a reducing agent ([5], [6]) or an oxygen atom donor (for example iodosylbenzene [7]). These interactions might also be modulated by coupling the porphyrin with an intercalating agent ([8], [9], [10]) or an oligonucleotide [11]. Previous work in our laboratory ([12], [13]) has focused on the DNA cleavage efficiency of a cationic manganese porphyrin, meso-tetrakis (4-N-methylpyridyl) porphyrinatomanganeseIII pentaacetate (Mn-TMPyP), in association to potassium monopersulfate KHSO5). Subsequent work [14] has shown that this System can, in aqueous phase, hydroxylate a substrate such as adenosine-5'-monophosphate. Here we try to get insight into the mechanism of DNA cleavage by this cationic manganese porphyrin from a preliminary study undertaken with polydeoxyadenylic acid, poly(dA), as a model substrate. A phosphate buffer (25 mM, pH 7.2) solution of 50 uM poly(dA) (nucleotides) and 20 uM Mn-TMPyP was reacted with 1.2 mM KHSOs for 3 min. at 25°C. Then the reaction was stopped by addition of Tris buffer (125 mM, pH 6.8; Tris buffer readily degradates KHSO5, [12]) and heated in a water-bath at 90°C for 1 hr. HPLC profiles are indicated in Figure 1: part 1, A was obtained with a protein Pak 1-125 Waters column eluted isocratically with a mixture of 15 mM phosphate buffer (pH 6.8)/0.1 M NaCl; part 1, B was realized by using a Hypersil-phenyl reverse-phase column (10 um, 0.46 x 25 cm) and a mixture of methanol/5 mM ammonium acetate/acetic acid (1/98.9/0.1; v/v/v) for elution. Figure 1, A shows that the initial peak of poly(dA) (a) appeared broader with an
Note présentée par Jean-Marie LEHN. 0249-6313/89/03090409 $ 2.00 © Académie des Sciences
C. R., 1989, 2e Semestre (T. 309) Série III - 30
410 C. R. Acad. Sci. Paris, t. 309, Série III, p. 409-414, 1989
increase of the retention time R, (from 5.5 to 7 min.) after treatment with the catalytic System (b); free adenine 3 was released; after heating 20 min. at 90°C no significative change was observed (d). Figure 1 B clearly indicates that oxidation by the Mn-TMPyP/KHSO5 system led to release of free adenine 3 (tr=10min.) before heating (b) and to additional liberation of compound 4 (tr = 7.5 min.) after heating for 10 (c) or 25 (d) min. In control experiments, when poly (dA) was incubated with only one of the constituents of the catalytic System, neither adenine nor compound 4 was produced; compound 2 appeared in the reacting medium even in the absence of poly(dA) and probably is a degradative product of porphyrin. Compound 4 has been unambiguously identified as 5-methylene-2-furanone (5MF) on the basis of its chromatographics properties on two types of reverse phase column compared to those of an authentic sample synthetized according to Grundman and Kober protocole [15]: on the Hypersil-phenyl column (see above for conditions) compound 4 as reference 5-MF have identical retention times and they elute before adenine; on a Bondex C18 column (9 um, 0.39 x 30 cm) eluted with methanol/ammonium acetate 5 mM/acetic acid: 10/88.9/0.1, 5-MF and the authentic compound show also the same retention time tr = 9 min. and elute after adenine tr = 6.5 min. Furthermore UV spectra of compound 4 and reference 5-MF acquired during the HPLC analysis with a Waters 990 photodiode array detector were strictly identical and in agreement with litterature [16]. Compound 3 (adenine) has also been identified by this technique. For each HPLC profile, adenine and 5-MF were quantified from linear calibration curves (peak areas vs concentrations) obtained with pure reference samples. In the conditions described above, the respective ratios of adenine and 5-MF related to the number of nucleotides introduced were 0.11 and 0.065. Considering the partial degradation of 5-MF in the experimental conditions, the stoechiometry for adenine/5-MF ratio is about 1/1 (kinetic data not shown). So the reaction pathway (Fig. 3) for oxidative cleavage of poly(dA) by the Mn-TMPyP/KHSO5 System would be a selective hydroxylation of C1 on the deoxyribose with adenine release, followed by one P-elimination step leading to the break of the phosphate-sugar backbone through the release of the phosphate group at C'3. This result appears similar to that yet described by Goyne and Sigman [17] for the oxidative degradation of DNA using a 1,10-phenanthroline-copper complex and H202. Both complexes bind in the minor groove ([17], [18]) where are located the two reactive sugar tertiary C—H bonds, C'1—H'1 and C4 — H4. Althought C4 seems a better target as it is more accessible, the present results indicate that C1, hidden in the depth of the groove, is also a good candidate as a reactive site for the hydroxylation by the cationic manganese porphyrin activated by KHSO5.
Preliminary trials on oxidative degradation of double-stranded copolymers [poly (dA)- poly (dT), poly (dG)-poly (dC)] and calf thymus DNA also show spontaneous release of free bases and, after heating, of 5-MF. These results obtained with double-stranded polymers indicate that the mechanism proposed here for the single-stranded poly(dA) may have a more generai interest to explain the nuclease activity of the manganese-porphyrin/KHSO5 System. We are currently investigating the quantitative analysis of the release of free bases versus the formation of 5-MF.
Ces dernières années, à côté des efforts réalisés pour isoler et évaluer des substances naturelles capables de couper l'ADN [1], il faut souligner l'importance des travaux consacrés à la synthèse et à l'étude de composés capables de reconnaître et de couper sélectivement l'ADN. De telles lésions de l'ADN peuvent être induites par des composés
C. R. Acad. Sci. Paris, t. 309, Série m, p. 409-414, 1989
411
de la famille des porphyrines par photoactivation ([2], [3], [4]) ou par activation oxydative par l'oxygène moléculaire en présence d'un réducteur ([5], [6]) ou d'un donneur d'oxygène (par exemple l'iodosylbenzène, [7]). On peut également espérer moduler cette interaction en couplant la porphyrine utilisée à un agent intercalant ([8], [9], [10]) ou à un oligonucléotide [11]. Nous avons récemment décrit ([12], [13]) l'efficacité comme agent de coupure de l'ADN du système oxydant associant le pentaacétate de méso-tétrakis (N-méthyl-4pyridyl) porphyrinatomanganèseIII (Mn-TMPyP) à un donneur d'oxygène hydrosoluble, le monopersulfate de potassium (KHSO5). Par la suite nous avons montré que ce système est capable en phase aqueuse d'hydroxyler un substrat comme l'adénosine-5'- monophosphate [14]. Nous rapportons ici quel pourrait être le mécanisme des coupures de l'ADN observées avec le système Mn-TMPyP/KHSO5 à partir d'une étude menée sur un modèle simplifié, l'acide polydéoxyadénylique, poly(dA).
Le poly (dA) (Sigma) est dissous (conc. finale = 50 uM en nucléotides) dans 800 ul de tampon phosphate pH 7,2 (25 mM), puis mis en présence de Mn-TMPyP (conc. finale=20 uM; pour la synthèse de ce composé, voir [12]) et ensuite additionné de KHSO5 (conc. finale = 1,2 mM; l'Oxone(R), Alfa-Ventron, est en fait le sel triple 2 KHSO5, KHSO4, K2S04). Après 3 mn de réaction à 25°C, la réaction est stoppée par addition de tampon Tris pH 6,8 (conc. finale = 125 mM; le tampon Tris dégrade rapidement le KHSO5, [12]). Le milieu réactionnel est ensuite chauffé au bain-marie à 90°C pendant 1 h. L'étude de la réaction a été réalisée essentiellement par HPLC et les résultats sont présentés sur la figure 1. Le graphique 1, A a été obtenu à partir d'une analyse sur colonne protéine Waters I-125 (0,78 x 30 cm) éluée isocratiquement avec un tampon phosphate 15 mM (pH 6,8)+NaCl 0,1 M à un débit de 1,2 ml/mn; le
Fig. 1. - Profils HPLC du poly(dA) avant traitement (a), et après traitement avec Mn-TMPyP/KHSO5
avant l'étape de chauffage (b) ou après (c et d). Voir les conditions expérimentales dans le texte.
Fig. 1. - HPLC profiles of poly(dA) before treatment (a), after treatment with Mn-TMPyP/KHSO5
without (b) or with (c and d) additional heating. See experimental conditions in the text.
412 C. R. Acad. Sci. Paris, t. 309, Série III, p. 409-414, 1989
graphique 1 B a été réalisé à partir d'une analyse sur colonne phase inverse Hypersilphényl (10 u, 0,46x25 cm) éluée isocratiquement avec un mélange méthanol/acétate d'ammonium 5 mM/acide acétique (1/98, 9/0,1; v/v/v) à un débit de 1,5 ml/min. Sur la figure 1, A, le poly(dA) initial (a) apparaît sous forme d'un pic fin de temps de rétention tr = 5,5 mn alors qu'après traitement par la porphyrine de manganèse (b), il est fragmenté avec élargissement du pic et augmentation du tr (tr = 7 mn). Il faut noter également la libération concomitante d'adenine; 25 mn de chauffage à 90°C n'entraîne pas de modification apparente du pic de poly(dA); le pic correspondant à l'adénine est peut-être augmenté mais ce type de colonne ne permet pas une analyse plus fine. Par contre la figure 1, B montre clairement que le traitement par le système Mn-TMPyP/KHSO5 entraîne la libération d'adénine (tr= 10 mn); un chauffage ultérieur à 90°C conduit à la libération supplémentaire dans le milieu du composé 4 (tr = 7,5 mn); cette formation déjà nette après 10 mn (fig. 1, B, c) est optimale pour 25 mn de temps de chauffage (fig. 1, B, d et fig. 2). Des contrôles réalisés en l'absence d'au moins un des constituants de la réaction n'ont jamais montré de libération d'adenine ou de composé 4; le composé 2, qui apparaît dans le milieu réactionnel même en l'absence de poly(dA), est vraisemblablement un produit de dégradation de la porphyrine. Le composé 4 a été identifié comme étant la méthylène-5-furanone-2 (5-MF) par comparaison de son temps de rétention en HPLC sur deux types de colonnes phase inverse différentes, avec ceux d'un échantillon authentique préparé par ailleurs selon la méthode de Grundman et Kober [15] : sur la colonne Hypersil-phenyl (voir conditions ci-dessus), le composé 4 comme le 5-MF de référence ont des temps de rétention identiques et sont élues avant l'adénine; sur une colonne Bondex C18 (9 um, 0,39x30 cm; mélange éluant : méthanol/acétate d'ammonium 5 mM/acide acétique 10/88,9/0,1) les temps de rétention du produit 4 et du 5-MF de référence coïncident également à tr = 9 mn et ils sont élues alors après l'adénine (tr = 6,5 mn). De plus, les spectres UV du composé 4 et du 5-MF de référence (enregistrés lors de l'analyse HPLC avec un détecteur à photodiodes Waters 990) sont rigoureusement identiques et conformes à la littérature [16]. L'identité du composé 3 (adenine) a été également confirmée par cette méthode.
La quantification du nombre de molécules d'adenine et de 5-MF libérées par rapport au nombre de nucléotides introduits sous forme de poly(dA) a été obtenue par comparaison des profils HPLC du milieu réactionnel avec ceux de solutions étalons préparées avec des produits de référence. Dans les conditions décrites ci-dessus, ces rapports sont respectivement de 0,11 et 0,065. Compte tenu de la dégradation partielle du 5-MF au
Fig. 2. — Cinétique d'apparition du 5-MF en fonction du temps de chauffage. Voir les conditions expérimentales dans le texte. * Les pourcentages de 5-MF sont exprimés en fractions molaires par rapport à la concentration initiale en nucléotides introduits sous forme de poly(dA); la quantité d'adenine libérée avant l'étape de chauffage était de 11 % et n'a pas varié par la suite.
Fig. 2. — Effect of incubation (90°C) time on 5-MF release. Experimental conditions are indicated in the text. * % 5-MF is expressed as molar fraction of initial concentration in nucleotides of poly (dA); amount of adenine released before heating was 11% and did not change subsequently.
C. R. Acad. Sci. Paris, t. 309, Série III, p. 409-414, 1989 413
cours même de sa formation, une stoechiométrie 1/1 pour le rapport adénine/5-MF est probable (les résultats de cinétique ne sont pas montrés). Le schéma réactionnel (fig. 3) serait alors pour l'action de la métalloporphyrine étudiée associée au KHSO5 une hydroxylation en position 1' du déoxyribose conduisant spontanément à la libération d'adénine et peut-être aussi à la première f3-élimination (avec coupure de la liaison phosphodiester en 3'); l'étape de chauffage en permettant une deuxième (3-élimination avec rupture du lien phosphodiester en 5' entraîne la libération du sucre résiduel sous forme de 5-MF. La formation et la caractérisation du 5-MF ont été précédemment décrites par Goyne et Sigman [17] lors de l'étude de coupures d'ADN générées par le complexe phénanthroline-cuivre 1 en présence d'H2O2. La métalloporphyrine étudiée ici se lie dans le petit sillon de l'ADN [18] comme le complexe phénanthroline-Cu [17] et l'on ne peut qu'émettre l'hypothèse d'un positionnement favorable du complexe lors de l'interaction pour expliquer une attaque préférentielle sur le carbone-1', plus enfoui, que sur le carbone-4', plus accessible à l'entrée du petit sillon; rappelons que Ci et C4 sont les deux seuls carbones tertiaires présents dans le petit sillon et que d'une manière générale l'activation d'une liaison C—H tertiaire est plus facile que celle de liaisons secondaires ou primaires.
Des essais préliminaires de dégradation oxydative réalisés sur des copolymères doublebrins [poly (dA)-poly (dT) et poly(dG)-poly(dC)] ainsi que sur l'ADN de thymus de veau ont également mis en évidence la libération de bases, spontanément, et de 5-MF, après un temps de chauffage. Cette analogie de comportement, observé cette fois avec des formes double-brins, permet de penser que l'hydroxylation en l'du déoxyribose démontrée dans le cas particulier du poly(dA), modèle simple-brin et non structuré, n'est donc pas spécifique des nucléotides à adenine ni des modèles monobrins d'ADN, et constitue vraisemblablement une voie plus générale permettant d'expliquer l'activité nucléase du système catalytique étudié ici. Une étude détaillée de ces phénomènes dans le cas de l'ADN est en cours.
Note remise le 2 août 1989, acceptée le 21 août 1989.
RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES
[1] J. STUBBE et J. W. KOZARICH, Chem. Rev., 87, 1987, p. 1107-1136. [2] J. MOAN, Photochem. Photobiol., 43, 1986, p. 681-690. [3] D. KESSEL, Biochem. Pharmacol., 33, 1984, p. 1389-1393.
Fig. 3. — Comment l'hydroxylation catalytique du carbone-1' peut conduire, après chauffage,
à deux coupures contigûes sur la chaîne de poly(dA) avec libération de 5-MF. A = adenine.
Fig. 3. — Mechanism for two contiguous strand breakages ofpoly(dA) resulting
from catalytic hydroxylation at C1 followed by an heating step. A — adenine.
414 C. R. Acad. Sci. Paris, t. 309, Série III, p. 409-414, 1989
[4] D. PRASEUTH, A. GAUDEMER, J. B. VERLHAC, I. KRALJIC, I. SISSOËF et E. GUILLÊ, Photochem. Photobiol, 44, 1986, p. 717-724.
[5] R. J. FIEL, T. A. BEERMAN, E. H. MARK et N. DATTA-GUPTA, Biochem. Biophys. Res. Commun., 107, 1982, p. 1067-1074.
[6] R. L. AFT et G. C. MUELLER, J. Biol. Chem., 258, 1983, p. 12069-12072.
[7] B. WARD, A. SKOROBOGATY et J. C. DABROWIAK, Biochemistry, 25, 1986, p. 6875-6883.
[8] J. W. LOWN, S. M. SONDHI, C. W. ONG, A. SKOROBOGATY, H. KISHIHAWA et J. DABROWIAK, Biochemistry, 25, 1986, p. 5111-5117.
[9] Y. HASHIMOTO, H. IIJIMA, Y. NOZAKI et K. SHUDO, Biochemistry, 25, 1986, p. 5103-5110.
[10] F. TADJ et B. MEUNIER, C. R. Acad. Sci. Paris, 306, série II, 1988, p. 631-634.
[11] T. LE DOAN, L. PERROUAULT, M. CHASSIGNOL, N. T. THUONG et C. HÉLÈNE, Nucl. Acids Res., 15, 1987, p. 8643-8659.
[12] E. FOUQUET, G. PRATVIEL, J. BERNADOU et B. MEUNIER, J. Chem. Soc, Chem. Commun., 1987, p. 1169-1171.
[13] J. BERNADOU, G. PRATVIEL, F. BENNIS, M. GIRARDET et B. MEUNIER, Biochemistry (sous presse).
[14] J. BERNADOU, P. GELAS et B. MEUNIER, Tetrahedron Letters, 29, 1988, p. 6615-6618.
[15] C. GRUNDMAN et E. KOBER, J. Am. Chem. Soc, 11, 1955, p. 2332-2333.
[16] E. SHAW, J. Am. Chem. Soc, 68, 1946, p. 2510-2513.
[17] T. E. GOYNE et D. S. SIGMAN, J. Am. Chem. Soc, 109, 1987, p. 2846-2848.
[18] B. WARD, A. SKOROBOGATY et J. C. DABROWIAK, Biochemistry, 25, 1986, p. 7827-7833.
Laboratoire de Chimie de Coordination du C.N.R.S., 205, route de Narbonne, 31077 Toulouse Cedex.
C. R. Acad. Sci. Paris, t. 309, Série m, p. 415-418, 1989 415
Cancérologie/Ca/Jcero/ogy
Modification des concentrations relatives des groupements
méthyle et méthylène plasmatiques dans la pathologie cancéreuse : une étude par spectroscopie RMN du proton
Jean VION-DURY, Martine SCIAKY, Sylviane CONFORT-GOUNY, Mostafa KRIAT,
Roger FAVRE, François GRISOLI, Jean-Robert HARLÉ, Éric FONTANARAVA,
Maurice MONGIN, Yves CARCASSONNE et Patrick COZZONE
Résumé — Une étude par spectroscopie RMN du proton réalisée sur le plasma de sujets cancéreux illustre l'intérêt du rapport calculé à partir de l'aire de la raie provenant des groupements CH2 et celle provenant des groupements CH3 des lipides plasmatiques, par comparaison avec l'indice de largeur de raie décrit par Fossel et coll. Ce rapport est augmenté dans la pathologie cancéreuse. Il permet de mieux séparer les malades cancéreux des autres malades. De plus, il met en évidence des modifications différentes de la quantité relative de ces groupements selon que le cancer est dérivé de tissus endodermiques ou neurectodermiques ou bien du mésoderme (sarcome ou tumeur des lignées sanguine). Ce travail tend à démontrer que les modifications du métabolisme lipidique induites par la présence d'un cancer dépendent pour partie de l'origine embryologique de celui-ci.
Modifications of relative plasmatic concentrations in méthylène and methyl groups
in cancer: a proton NMR study
Abstract — Fossel et al. [1] have recently proposed the proton NMR examination of plasmatic lipoproteins—and more precisely the determination of an index obtained from the averaged linewidth of the CH2 and CH3 resonances—as a possible tool for detection of cancer. Many evaluations conducted on an international basis have demonstrated that initial expectations were not met and that the test lacked sensitivity, specificity, and predictive value to be accepted as a screening and diagnostic tool. In our evaluation we have collected plasma from healthy subjects, from patients with various kinds of cancer at different stages of evolution and therapy, and from patients suffering from a variety of pathologies, including begnin tumors.
In accordance with Chmurny et al. [2], we observed that the linewidth index (LWI) is precise and reproducible when care is taken in the handling and storage of samples and in the fasting of subjects. After finding no predictive value to the test, we have reanalyzed the spectra and studied the variations of the ratio defined by the methylene signal area over the methyl signal area. This ratio is significantly increased in cancer. Furthermore, it offers a better separation of statistical populations permitting a more precise discrimination between cancer, other pathologies and controls.
We have also found that malignant tumors arisingfrom mesenchyma (sarcoma, leukemia, lymphoma) induce less important variations in the CH2/CH3 ratio than adenocarcinoma or glioma, when such differences cannot be documented using the LWI. These observations are particularly interesting since they might bring new information on the metabolic modifications induced by cancerogenesis. The alterations ofthe lipidic metabolism reflected in the modifications of the LWI and the CH2ICH3 ratio might reflect the embryologie origin of the tumors and raise the issue of the heterogeneity of cancer desease.
INTRODUCTION. — En 1986, Fossel et coll. [1] publiaient une étude tendant à montrer que les spectres obtenus par Résonance Magnétique Nucléaire (RMN) du proton à partir des plasmas des sujets cancéreux différaient significativement de ceux des sujets sains. Ce phénomène était objectivé par un indice de largeur de raie l'ITLR) calculé à partir des groupements méthyle et méthylène des lipides plasmatiques. Chez les cancéreux, cet indice est abaissé par rapport à l'indice calculé dans la population témoin. Les modifications de l'ILR ont pu être attribuées principalement à des modifications qualitatives et quantitatives des différents types de lipoprotéines présentes dans le plasma en fonction de l'état pathologique du malade [2]. A la lumière des différentes évaluations réalisées par de nombreuses équipes ([2]-[7]), il est à présent acquis que la différence entre les
Note présentée par Jean-Pierre EBEL.
0249-6313/89/03090415 S 2.00 © Académie des Sciences
416 C. R. Acad. Sci. Paris, t. 309, Série III, p. 415-418, 1989
indices des deux populations n'est pas suffisamment significative pour permettre, comme le proposaient initialement les auteurs, un dépistage systématique du cancer.
Une analyse plus systématique de la morphologie de ces raies, amène à constater qu'un autre paramètre varie également dans la pathologie cancéreuse : il s'agit du rapport entre l'aire de la raie provenant des groupements méthylène (CH2) et l'aire de la raie provenant des groupements méthyle (CH3) (rapport CH2/CH3). Par ailleurs, les études réalisées à
Fig. 1. — Indice de largeur de raie (ILR) obtenu à partir des résonances méthyle et méthylène des lipoprotéines, en RMN du proton à 400,13 MHz. L'ILR moyen (±SD) est présenté chez différentes populations de malades sélectionnés en fonction de la nature de leur pathologie et de leur état clinique. Population n° 1 : adénocarcinomes (n = 39), n° 2 : sarcomes et tumeurs des lignées sanguines (« = 44), n° 3 : gliomes (n=18), n° 4 : tumeurs bénignes (n = 23), n° 5 : pathologie non tumorale (n = 45) essentiellement malades recrutés en neurochirugie (hernies discales et traumatismes crâniens), et n° 6 : témoins (n = 50). Différences significatives (analyse de variance) entre les populations 1-6 (p<0,01) et 1-5 (p<0,05).
Fig. 1. — Linewidth index (LWI) obtained from methyl and methylene resonances of lipoproteins, by proton NMR at 400.13 MHz. Averaged LWI (±sd) is presented for different populations selected using the nature of pathology. Populations: No. 1; adenocarcinoma (« = 39), No. 2: sarcoma and blood tumors (n = 44), No. 3; glioma (n = 18); No. 4: begnin tumors (« = 23), No. 5: non tumoral pathology of central nervous System (« = 45); and No. 6: controls (« = 50). Significant différences (Variance analysis) between populations 1-6 (p<0.0l) and 1-5 (p<0.05).
Fig. 2. — Rapport « aire des groupements CH2 sur aire des groupements CH3 » mesuré sur les mêmes spectres que ceux utilisés pour le calcul de l'ILR. Les populations sont identiques à celles de la figure 1. Des différences significatives (analyse de variance) entre les populations 1-2, 1-4, 1-5, 1-6, 2-6, 3-4, 3-5, 3-6 avec p<0,0l et entre les populations 1-2 et 5-6 avec p<0,05 sont observées.
Fig. 2. — Ratio between areas of CH2 groups and CH3 groups measured on the same spectra as used for LWI determination. Populations are identical to those of Figure 1. Significant differences (variance analysis, p<0.01) between populations 1-2, 1-4, 1-5, 1-6, 2-6, 3-4, 3-5, 3-6 with p<0.0\ and 1-2, and 5-6 withp<0.05 are observed.
C. R. Acad. Sci. Paris, t. 309, Série III, p. 415-418, 1989 417
ce jour sur ce sujet ne tiennent pas compte de la très grande diversité histologique (et donc embryologique) des cancers et supposent a priori que tous les types de cancer sont susceptibles de modifier de façon identique le profil lipoprotéique.
Dans ce travail nous avons voulu montrer 1° qu'il existe peut être d'autres indices que l'ILR susceptibles d'être plus représentatifs des variations induites sur le spectre RMN du plasma par la présence d'un cancer, et que 2° ces variations ne sont pas univoques, et doivent prendre en compte l'hétérogénéité histologique de la maladie cancéreuse.
MATÉRIEL ET MÉTHODES. — Prélèvements. — Les prélèvements étudiés proviennent de malades hospitalisés dans des services de chimiothérapie (n = 83), de neurochirurgie (n = 63), de médecine interne (n=23) du C.H.U. de Marseille et de l'Institut PaoliCalmettes; les prélèvements témoins (n = 51) ont été fournis par la Centre de Transfusion sanguine de Marseille. Tous les prélèvements étaient collectés chez des malades à jeun, puis centrifugés dans les 2 h à 3000 g (pendant 15 mn) puis à 10000 g (pendant 30 mn) avant d'être conservés à — 20°C jusqu'au jour de l'étude RMN. Ce protocole correspond à celui proposé par le National Cancer Institute (N.C.I.). Le plasma des sujets étudiés était prélevé à l'entrée du malade dans le service, avant tout traitement, ou bien après une fenêtre thérapeutique de 2 semaines au minimum. L'expérience RMN était effectuée en aveugle, l'interprétation des spectres étant réalisée sans connaître ni l'origine du prélèvement, ni le nom du malade; les corrélations anatomo-cliniques étaient enfin régulièrement discutées avec les responsables des services concernés.
Les études statistiques (tests paramétriques, test de Student, analyse de variance, test F, test de Schéffé) ont été réalisées à partir du premier prélèvement de chaque malade.
Spectroscopie RMN. — Les spectres de RMN du proton étaient enregistrés à 400 MHz sur un spectromètre « Bruker AM400 WB » équipé d'une sonde admettant des tubes de 5 mm et doté d'un aimant supraconducteur de 9,4 T. Le signal provenant des protons de l'eau était éliminé par une séquence de présaturation du solvant par irradiation sélective de 6 s. L'ILR était déterminé de la même façon et selon les mêmes critères que ceux proposés par Fossel et coll. [1] et le protocole du NCI. Le rapport CH2/CH3 était déterminé par intégration des raies, la ligne de base choisie étant celle utilisée pour calculer l'ILR.
RÉSULTATS. — Ainsi que l'ont montré les différentes évaluations notamment l'évaluation multicentrique dirigée par Chmurny et coll. [2] l'ILR est un test sensible et reproductible, mais ne permettant pas le dépistage systématique du cancer dans une population standard. Ainsi l'ILR est-il significativement abaissé chez les malades atteints de tumeurs malignes (37,89 + 0,51 Hz) comparativement aux témoins (41,84+0,57 Hz) (p<0,005, test t de Student). Cependant, il n'est pas possible de différencier sur ce critère les malades atteints de cancers de ceux atteints d'autres pathologies non tumorales ou tumorales bénignes
(fig. 1)-
En revanche, comme le montre la figure 2, le rapport CH2/CH3 permet 1° d'obtenir un meilleur regroupement des éléments constituant les populations statistiques, et 2° d'objectiver une meilleure séparation des diverses populations. Ainsi, le rapport CH2/CH3 est-il très augmenté dans les adénocarcinomes et les gliomes, un peu moins dans les sarcomes. Ce rapport est également modifié, mais de façon moindre que dans les cancers, lors de la survenue d'une pathologie tumorale bénigne ou autre.
DISCUSSION. — L'augmentation du rapport CH2/CH3 lors de la présence d'un cancer est sans doute un meilleur témoin que l'ILR des modifications qualitatives qu'entraîne
418 C. R. Acad. Sci. Paris, t. 309, Série III, p. 415-418, 1989
cette pathologie sur un certain nombre d'espèces chimiques présentes dans le plasma et possédant des groupements méthyle et méthylène. La nature du rapport CH2/CH3 rend mieux compte de ces variations que l'ILR qui fait intervenir des paramètres plus composites et difficilement quantifiables, notamment la forme des signaux RMN.
Si la nature de ces modifications qualitatives induites au niveau de ces groupements reste encore largement controversée, l'augmentation du rapport CH2/CH3 tend à suggérer que les modifications du spectre RMN ne sont pas dues à la seule augmentation des lipides circulants ([3], [4], [6]), mais qu'il pourrait se produire, lors de la survenue d'un cancer, 1° soit une modification de la proportion des différents types de chaînes grasses (augmentation de la concentration des chaînes longues et/ou saturées) ([4], [8]), 2° soit l'apparition d'une espèce moléculaire plus particulière, comme un lipide fucosylé [9], et dont le signal serait susceptible de participer plus spécifiquement à la raie des CH2. La discrimination sur ce critère des tumeurs d'origine mésenchymateuse d'une part et des adénocarcinomes (endoderme) et gliomes (neurectoderme) d'autre part, montre la complexité des processus impliqués et la nécessité d'envisager le problème sous un angle biochimique, mais également embryologique et cytologique.
Enfin, il convient, en l'état des recherches, de ne pas considérer les modifications du rapport CH2/CH3 comme un nouveau test de dépistage du cancer, en raison notamment du recouvrement important de certaines populations. En revanche, le suivi longitudinal de nombreux cancéreux (Vion-Dury et coll., en préparation) tend à suggérer que ce rapport pourrait, sous certaines conditions, présenter un intérêt plus grand que l'ILR dans le suivi thérapeutique en cancérologie.
Ce travail est soutenu financièrement par l'Association pour la Recherche sur le Cancer et l'Administration de l'Assistance publique à Marseille.
Note remise le 18 juillet 1989, acceptée le 9 août 1989.
RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES
[1] E. T. FOSSEL, J. M. CARR et J. MCDONAGH, New Eng. J. Med., 315, (22), 1986, p. 1369-1376.
[2] G. N. CHMURNY, B. D. HILTON, D. HALVERSON, G. N. MCGREGOR, J. KLOSE et H. J. HISSAQ, NMR in Biomedecine, 1, (3), 1988, p. 136-150.
[3] K. T. HOLMES, W. B. MACKINNON, G. L. MAY, L. C. WRIGHT, M. DYNE, M. H. N. TATTERSALL, C. E. MOUNTFORD et D. SULLIVAN, NMR in Biomedecine, 1, (1), 1988, p. 44-49.
[4] P. WILDING, M. B. SENIOR, T. INUBUSHI et M. L. LUDWICK, Clin. Chem., 34, (3), 1988, p. 505-511.
[5] S. D. BUCHTHAL, M. A. HARDY et T. R. BROWN, Am. J. Med., 85, 1988, p. 528-532.
[6] S. TRAN DINH, M. SCHLUMBERGER, C. GICQUEL, J. M. NEUMANN, M. HERVÉ, G. TURPIN et C. PARMENTIER, Bull. Cancer, 75, 1988, p. 795-800.
[7] J. PEELING, G. SUTHERLAND, K. MARAT, E. TOMCHUK et E. BLOCK, J. Neurosurg., 68, 1988, p. 931-937.
[8] A. SPECTOR, Prog. Biochem. Pharmacol., 1975, 10, p. 43-76.
[9] C. E. MOUNTFORD, G. L. MAY, L. C. WRIGHT, W. B. MACKINNON, M. DYNE, K. T. HOLMES, C. VAN HAAFTEN-DAY et M. H. N. TATTERSALL, Lancet, 1987, p. 829-833.
J. V.-D., M. S., S. C.-G., M. K., E. F. et P. C. : Centre de Résonance magnétique biologique et médicale,
Faculté de Médecine, boulevard Jean-Moulin, 13005 Marseille;
R. F. et Y. C. : Institut Paoli-Calmettes, 232, boulevard Sainte-Marguerite, 13009 Marseille;
F. G. : Service de Neurochirurgie, C.H.U. Timone, rue Saint-Pierre, 13005 Marseille;
J.-R. H. et M. M. : Service de Médecine interne, C.H.U. Timone, rue Saint-Pierre, 13005 Marseille.
C. R. Acad. Sci. Paris, t. 309, Série III, p. 419-422, 1989 419
Évolution/Evolution
Démonstration de l'origine indépendante des ventouses
digitales dans deux lignées phylogénétiques de Ranidae
(Amphibiens, Anoures)
Annemarie OHLER et Alain DUBOIS
Résumé — L'étude fine de la morphologie des ventouses digitales présentes dans deux groupes de Ranidae permet de mettre en évidence l'existence de deux morphoclines distincts menant d'une extrémité digitale non différenciée à une ventouse complète. Bien que les stades terminaux de ces deux morphoclines soient identiques dans les deux groupes, ils ne peuvent donc être tenus pour homologues. Ces résultats confortent l'hypothèse phylogénétique qui avait amené à considérer ces deux groupes comme des lignées distinctes.
Demonstration of the independent origin of digital pads in two phylogenetic lineages
of Ranidae (Amphibia, Anura)
Abstract — The fine study of the morphology of digital pads present in two groups of Ranidae demonstrates the existence of two distinct morphoclines leading from a non-differentiated digital extremity to a complete pad. Therefore, although the terminal stages of both morphoclines are identical in both groups, they cannot be considered homologous. These results support the phylogenetic hypothesis which had led to consider these two groups as distinct lineages.
La majorité des Amphibiens actuels de l'ordre des Anoures, et notamment tous ceux de ses deux sous-ordres considérés les plus primitifs (1), présentent des doigts et des orteils à extrémités arrondies ou obtuses, portant parfois des structures complexes, proches de la symétrie radiaire [3], mais toujours dépourvues de structures différenciées à symétrie bilatérale. Cette condition peut donc être interprétée comme plésiomorphe chez les Anoures.
Dans 12 familles d'Anoures appartenant au troisième sous-ordre, considéré plus évolué (2), se rencontrent des espèces dont les doigts et/ou les orteils sont plus ou moins élargis, allant jusqu'à porter de véritables « ventouses » différenciées, à symétrie bilatérale. Ces structures, qui facilitent l'adhésion des animaux sur divers substrats (feuilles, bois, rochers), se ressemblent d'un groupe à l'autre jusque dans leurs moindres détails histologiques et cytologiques ([4]-[10]). Toutefois, ces structures existant dans des familles ou sous-familles d'origines phylogénétiques distinctes [11], il faut admettre qu'elles sont apparues par convergence dans ces diverses lignées.
La phylogénie des Ranoidea, l'une des deux superfamilles de ce sous-ordre [12], est mal connue; aucun travail récent n'a été effectué sur l'ensemble de cette superfamille. En se basant sur des caractères squelettiques, Dubois [12] a proposé de nouveaux groupes qu'il considère comme des unités phylogénétiques. Au sein de la sous-famille des Raninae, il reconnaît six nouvelles tribus, dont celles des Ranini et des Dicroglossini, qui comportent chacune plusieurs genres et des espèces jusqu'ici réunies dans un même genre (Rana). Dans chacune de ces deux tribus se trouvent des formes sans et avec ventouses, alors que dans la classification en vigueur auparavant [1] les premières étaient réunies dans une tribu (Ranini) et les dernières dans une autre (Platymantini). Si l'absence de ventouses est la situation plésiomorphe dans les deux nouvelles tribus [12], et si celles-ci correspondent bien à des lignées distinctes, les ventouses qu'on y trouve sont apparues indépendamment et ne sont pas homologues.
Note présentée par Jean DORST. 0249-6313/89/03090419 S 2.00 © Académie des Sciences
420 C. R. Acad. Sci. Paris, t. 309, Série 111. p. 419-422, 1989
Douze caractères morphologiques liés aux extrémités postérieures et antérieures ( 3) ont été étudiés sur 690 spécimens de Ranidae, pour la plupart asiatiques et pour quelquesuns africains ou européens, appartenant à 11 genres et 52 espèces. La plupart de ces caractères (élargissement de la ventouse, forme de l'extrémité du doigt, forme de la sole, développement de la ventouse) manifestent une forte variabilité au sein des différents groupes étudiés (genres et groupes d'espèces) et semblent être étroitement corrélés avec la biologie et l'écologie des espèces.
Un examen superficiel des ventouses montre la grande similitude des ventouses complètes dans les deux tribus, qui semble réfuter l'hypothèse précédente. L'étude de la morphologie des ventouses incomplètes, en revanche, permet de mettre en évidence l'existence de deux morphoclines (fig. 2-3) qui mènent du doigt/orteil obtus ou arrondi à une ventouse complète.
Chez les Ranini, des sillons latéro-ventraux pairs sont présents, qui ne sont pas fermés distalement (fig. 2, C, D). Chez les espèces à ventouses plus élargies, les sillons latéraux sont plus fermés et constituent le sillon latéro-terminal (fig. 2, E, F), qui peut se trouver en position marginale (fig. 2, G, H).
Chez les Dicroglossini, la première spécialisation est une extrémité de doigt légèrement dilatée (fig. 3, C, D). Le stade suivant montre la présence d'un sillon dorso-terminal avec des parties de la sole qui dépassent distalement (fig. 3, E, F). Chez les formes à ventouse plus élargie, le sillon reste dorso-terminal, mais il est plus étendu latéralement (fig. 3, G, H). Chez certaines espèces le sillon dorso-terminal se trouve en position marginale (fig. 3, I, J) et ressemble aux sillons trouvés chez les Ranini à ventouses complètes.
Les phénotypes à ventouse incomplète observés peuvent toujours être classés dans l'un ou l'autre morphocline. Les ventouses extrêmement dilatées montrent des sillons terminaux et une morphologie d'ensemble très semblables dans les deux lignées.
Ces observations renforcent l'hypothèse phylogénétique proposée [12] et confirment que les ventouses complètes, malgré leurs ressemblances à tous les niveaux, ne sont pas homologues dans les deux tribus, mais des convergences? Chez les Ranini seules les parties ventrales de l'extrémité du doigt participent à la formation de la sole. Chez les Dicroglossini la sole comporte une partie ventrale et une partie dorsale qui n'est pas couverte par l'ongle. La démonstration de la convergence des ventouses complètes dans les deux tribus indique que la simple présence de telles ventouses ne peut plus être utilisée comme caractère pour l'analyse cladistique, du moins à un niveau élevé (tribu ou au-dessus).
Fig. 1. — Schéma d'une ventouse généralisée de Ranoidea. A, vue dorsale; B, vue ventrale (o, ongle; pd, pli dorsal; bt, bourrelet terminal; sl, sillon latéro-terminal; s, sole; sb, sillon basai).
Fig. 1. — Diagram of a generalized toe-pad of ranoid frogs. A, dorsal view; B, ventral view (o, cover; pd, dorsal fold ; bt, terminal knuckle; si, latero-terminal groove ; s, pad; sb, basal groove).
C. R. Acad. Sci. Paris, t. 309, Série m, p. 419-422, 1989 421
Les numéros des spécimens figurés ci-dessus sont ceux qu'ils portent dans les collections du Laboratoire des
Reptiles et Amphibiens du Muséum national d'Histoire naturelle (MNHN). The numbers of the specimens figured above correspond to those they bear in the collection of the Laboratoire
des Reptiles et Amphibiens of the Muséum national d'Histoire naturelle (MNHN).
Fig. 2. — Morphocline des ventouses de la tribu des Ranini. A, B : Rana (Rana) lessonae, MNHN 1986.1987, France; C, D : Rana (Hylarana) erythraea, MNHN 1987.3343, Thaïlande; E, F : Amolops nasicus, MNHN 1938.73, Viet Nam; G, H : Staurois natator, MNHN 1889.345, Bornéo (A, C, E et G : vue dorsale du doigt III de la patte antérieure droite; B, D, F et H : vue ventrale du même doigt; échelle : 1 mm).
Fig. 2. — Morphocline of digital discs of the tribe Ranini. A, B: Rana (Rana) lessonae, MNHN 1986.1787, France; C, D: Rana (Hylarana) erythraea, MNHN 1987.3343, Thailand; E, F: Amolops nasicus, MNHN 1938.73, Viet Nam; G, H: Staurois natator, MNHN 1889.345. Borneo (A, C, E and G: dorsal view offinger
III of right forelimb ; B, D, F and H: ventral view of the same finger; scale: 1 mm).
Fig. 3. — Morphocline des ventouses de la tribu des Dicroglossini. A, B : Limnonectes (Fejervarya) nepalensis, MNHN 1988.4996, Népal; C, D : Limnonectes (Limnonectes) kuhlii, MNHN 1987.3328, Thaïlande; E, F : Limnonectes (Bourretia) doriae, MNHN 1987.3130, Thaïlande; G, H : Ingerana tasanae, MNHN 1987.2002, Thaïlande; I, J : Platymantis hazelae, MNHN 1964.281, Philippines (A, C, E, G et I : vue dorsale de l'orteil
IV de la patte postérieure droite; B, D, F, H et J : vue ventrale du même orteil; échelle : 1 mm).
Fig. 3. — Morphocline of digital pads of the tribe Dicroglossini. A, B: Limnonectes (Fejervarya) nepalensis, MNHN 1988.4996, Nepal; C, D: Limnonectes (Limnonectes) kuhlii, MNHN 1987.3328, Thailand; E, F: Limnonectes (Bourretia) doriae, MNHN 1987.3130, Thailand; G, H: Ingerana tasanae, MNHN 1987.2002, Thailand; I, J: Platymantis hazelae, MNHN 1964.281, Philippines (A, C, E, G and I: dorsal view of toe IV of right hindlimb; B, D, F, H and J: ventral view of the same toe; scale: 1 mm).
422 C. R. Acad. Sci. Paris, t. 309, Série III, p. 419-422, 1989
Ces résultats devraient être confirmés par l'étude du développement ontogénétique (indications quant à la polarité des caractères) et par l'application des méthodes de l'embryologie expérimentale (greffe de tissus marqués), ce qui est pour l'instant extrêmement difficile car chez un grand nombre d'espèces de ces groupes tropicaux la biologie reproductive est encore inconnue. La combinaison de ces méthodes avec une analyse morphologique détaillée portant sur d'autres caractères pourra apporter des réponses à diverses questions concernant la phylogénie des Ranoidea ainsi que l'origine évolutive des structures complexes telles que les ventouses.
(1) Sous-ordres dénommés Archaeobatrachia et Mesobatrachia par Laurent [1], et Discoglossoidei et Pipoidei par Dubois [2].
( 2) Sous-ordre dénommé Neobatrachia par Laurent [1], et Ranoidei par Dubois [2].
( 3) Les caractères étudiés sont les suivants: (1) état d'élargissement des doigts et orteils; (2) forme de l'extrémité du doigt ou orteil; (3) forme de la sole; (4) longueur relative des doigts et orteils; (5) présence de ventouse avec sillon sur les différents doigts et orteils ; (6) présence de sillon latéro-terminal sur le doigt III ; (7) présence de sillon dorso-terminal sur le doigt III ; (8) présence de sillon basai sur le doigt III ; (9) présence d'un cartilage intercalaire; (10) longueur du tibia; (11) longueur du pied; (12) type de cellules en position médioventrale sur l'extrémité du doigt.
Note remise le 19 juin 1989, acceptée le 5 juillet 1989.
RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES
[1] R. F. LAURENT, Sous-classe des Lissamphibiens (Lissamphibia). Systématique, in P.-P. GRASSE et M. DELSOL (réd.), Traité de Zoologie, XIV, Batraciens, Fasc. I-B, Masson, Paris, 1985, p. 594-797.
[2] A. DUBOIS, Mém. Mus. natn. Hist. nat., (A), 131, 1984, p. 1-64.
[3] L. TRUEB et D. C. CANNATELLA, Herpetologica, 42, 1986, p. 412-449.
[4] G. K. NOBLE et M. E. JAECKLE, J. Morphol. Physiol., 45, 1928, p. 259-292.
[5] U. WELSCH, V. F. STORCH et W. FUCHS, Cell Tissue Res., 148, 1974, p. 407-416.
[6] D. GREEN, Canadian J. Zool, 57, 1979, p. 2033-2046.
[7] S. B. EMERSON et D. DIEHL, Biol. J. Linn. Soc, 13, 1980, p. 199-216.
[8] D. GREEN, Copeia, 1981, p. 790-796.
[9] W. MCALLISTER et A. CHANNING, S. Afr. J. Zool., 18, 1983, p. 110-114.
[10] D. GREEN et M. P. SIMON, Austr. J. Zool., 34, 1986, p. 135-145.
[11] W. E. DUELLMAN et L. TRUEB, Biology of Amphibians, New York, Saint Louis et San Francisco, McGraw-Hill, 1985, xvii + 670 p. : p. 473.
[12] A. DUBOIS, Alytes, Paris, 5, 1987, p. 7-95.
Laboratoire des Reptiles et Amphibiens, Muséum national d'Histoire naturelle, 25, rue Cuvier, 75005 Paris.
C. R. Acad. Sci. Paris, t. 309, Série m, p. 423-428, 1989 423
Écologie générale/Gênera/ Ecology
Accroissements en surface terrière dans des forêts semi-caducifoliées de Côte-d'Ivoire
Jean-Louis DEVINEAU
Résumé — La croissance en circonférence des arbres a été suivie pendant 5 à 9 ans dans les forêts de Lamto (5°02'W, 6°13'N) à l'aide de rubans dendromètres lus mensuellement. Les croissances annuelle et saisonnière de la surface terrière des peuplements ont été étudiées ainsi que l'influence relative des principaux facteurs climatiques pour la production de bois.
Basai area increment in some semi-deciduous forests of Ivory Coast
Abstract — In Lamto forests (5°02'W, 6°13'N) girth growth of trees was monitored monthly with bond dendrometers during 5 to 9 years. Annual and seasonal growth of stands basai area, as well as the relative importance of main climatic factors for wood production have been studied.
Abridged English Version — Mean annual rainfall at Lamto (5°02'W, 6°13'N) is 1,200 mm with a yearly bimodal pattern (Fig. 1). Lamto semi-deciduous forests are closely related to the "fire zone subtype" described in Ghana [2]. Mean basai area, for trees over 2 m high, is 24 m2/ha in zonal formations. However basai area reaches 32 to 38 m2/ha in gallery or swamp forests [3].
Girth growth of trees was studied in Lamto forests with Liming's dendrometers ([1], [4]). Every tree over 20 cm gbh was monitored monthly during 5 to 9 years in 7 forest stands. With these data the following relations have been calculated:
STi = STci + STe; _ 1 _i
where STi is basai area for trees more than 20 cm gbh at year i, STci basai area of encircled trees at year », STei-1 _i basai area of trees entering the 20 cm gbh class between years i— 1 and i;
where ANi_1 _i is net annual increment between years i — 1 and i and Mi_1 _i basai area of trees dead between years i — 1 and i;
R = (ANi_1 _ i/(STi_1 -Mi-1 _i)) x 100 where R is relative growth rate;
where M is the rate of loss due to mortality.
The seasonal variations of stands basai area increment follows the climatic rhythm. However the rainfall deficit in august does not lead to a decrease in cambial activity (Fig. 2) which sustains the idea that at Lamto august is not biologically dry ([5], [6]).
Variations of annual basai area increment are high. For instance in a gallery forest (T 6), with a mean annual increment of 0.51 ±0.18 m2/ha/year, the growth of basai area was 0.20 m*2/ha/year during 1980 and reached 0.74 m2/ha/year during 1974 which respectively correspond to 1 and 3.9% relative growth rate.
Annual increments are not only correlated with rainfall (Fig. 3). Indeed monthly amount of rainfall is not the only climatic factor determining basai area growth rates. The rains'
Note présentée par Raymond SCHNELL. 0249-6313/89/03090423 S 2.00 © Académie des Sciences
424 C. R. Acad. Sci. Paris, t. 309, Série III, p. 423-428, 1989
distribution and the evaporation rate are determinant, specially for extreme values. For example, high growth rates are more closely related to widely distributed rainfall, rather than to heavy précipitation, while trunk shrinkage occurs when evaporation rate is high. Moreover, climatic conditions and water deficit of previous months are also determinant (Fig. 4).
The variation between plots is wide and age dependent: the extreme values observed are 0.82 m2/ha/year for a young forest and 0.22 m2/ha/year for an old one, which respectively represent relative growth rates values of 8 and 1.3% (Table).
Annual losses due to mortality are very irregular as they are related to dead trees size. Their mean values vary from 0.4 to 2%. For a mature forest stand in which mortality balances increment, basai area turn over rate is 1.3 ±0.3%, with a 5% risk. In other stands basai area increases from the beginning to the end of the experiment and relative growth rate varies from 1.4 to 2.6% and even reaches 8% in a forest regrowth.
In Lamto forests basai area growth rate is similar to those observed in other African forests ([7], [8]). In conformity with Jordan theory ([12], [13]), this stands in contrast with the decrease in leaves production from low to high latitudes ([3], [8] to [11]).
However the high variability of wood production with stands characteristics and climatic fluctuations brings up the problem of comparing natural tropical forests. Several years' monitoring of stand growth and the study of community at steady state are required to record useful values.
I. INTRODUCTION. — La surface terrière d'un peuplement forestier est la somme de celles, mesurées de façon conventionnelle à 1,30 m de hauteur, de l'ensemble des arbres présents sur une superficie donnée. Elle est utilisée pour caractériser les peuplements forestiers car elle est directement liée au volume de bois sur pied et son accroissement est donc une mesure de la production de bois.
En forêt tropicale, où la méthode des cernes de croissance n'est pas utilisable, la croissance des arbres peut être étudiée grâce à des mesures périodiques de la circonférence ou du diamètre des troncs [1]. La croissance en circonférence des arbres de sept peuplements forestiers de Lamto a ainsi été suivie mensuellement durant plusieurs années, jusqu'à 9 ans sur certains sites.
II. MATÉRIEL ET MÉTHODES. — (a) Caractéristiques des forêts étudiées. — Le climat de la mosaïque forêt-savane où est implantée la station écologique de Lamto (5°02'W, 6°13'N) est de type tropical de transition à deux saisons sèches dont la première dure généralement de décembre à février. Pendant la seconde, en août, l'humidité relative de l'air reste forte, même si l'affaissement pluviométrique est toujours net (fig. 1). Les précipitations, dont la moyenne est de 1 200 mm, sont par ailleurs très variables d'une année à l'autre : entre 1972 et 1981, la plus forte valeur, celle de 1979, a été supérieure de 45 % à la plus faible, celle de 1975 (fig. 3).
Les forêts semi-caducifoliées à Celtis spp. de Lamto sont apparentées à la forêt dense semi-décidue perturbée par les feux décrite au Ghana [2]. La surface terrière moyenne des formations matures est à Lamto de 24 m2/ha pour les arbres et arbustes de plus de 2 m de haut. Elle est sensiblement supérieure dans les forêts galeries et dans les faciès forestiers les plus humides, où elle atteint 32 à 38 m2/ha [3].
C. R. Acad. Sci. Paris, t. 309, Série III, p. 423-428, 1989 425
(b) Protocole expérimental. — Des sept parcelles de 300 à 400 m2 correspondant aux principaux faciès forestiers, quatre sont situées en forêt de plateau (PI, P3, P4, P5) et trois en galerie forestière (T2, T6, S 4).
Les accroissements en circonférence ont été suivis grâce à des rubans dendromètres fixés à 1,30 m de hauteur sur le tronc de tous les arbres de plus de 20 cm de circonférence [4]. Au total la croissance de 161 arbres appartenant à 33 espèces a ainsi été étudiée.
Ces accroissements résultent de l'activité du cambium et de celle du phellogène, mais la mesure intègre aussi l'état de turgescence de l'ensemble des cellules du tronc. Des rétractions du tronc peuvent en effet survenir au cours de la saison sèche et masquer, au moins partiellement, la croissance. Pour pallier cet inconvénient les accroissements de surface terrière des peuplements ont été calculés à partir des courbes de croissance des surfaces terrières des différents individus établies en gardant, s'il y a rétraction, la valeur maximale enregistrée au cours des mois précédents.
A partir de ces observations plusieurs expressions ont été obtenues :
— la surface terrière des arbres de plus de 20 cm de circonférence pour l'année i,
où STci représente la surface terrière des arbres cerclés l'année i et STei-1 _ i la surface terrière des arbres entrés dans la classe 20 cm entre les années i— 1 et i;
C. R„ 1989, 2e Semestre (T. 309) Série III - 31
Fig. 1. — Répartition mensuelle des précipitations (PP) et des évapotranspirations potentielles (ETP) moyennes à Lamto (1971-1981). Si PP est supérieur à ETP, la période est dite humide; si PP est compris entre ETP et ETP/2, la période est dite semi-humide; si PP est inférieure ou égale à ETP/2, la période est dite sèche.
Fig. 1. — Monthly distribution of mean rainfall (PP) and potential evapotranspiration (ETP) at Lamto (19711981). If PP is greater than ETP: period is said moist; if PP is comprised between ETP and ETP/2: period is said semi-moist; if PP is less than ETP/2: period is said dry.
Fig. 2. — Répartition mensuelle des accroissements en surface terrière de trois peuplements forestiers à Lamto. Fig. 2. — Monthly distribution of basai area increment for three forest stands in Lamto.
Fig. 3. — Précipitations et accroissements en surface terrière de trois peuplements forestiers au cours de 9 années successives à Lamto [gal. = forêt galerie (gallery forest); Ft. plateau = forêt de plateau ("plateau" forest)}.
Fig. 3. — Annual rainfall and basai area increment of three forest stands during 9 years in Lamto.
426 C. R. Acad. Sci. Paris, t 309, Série III, p. 423-428,1989
TABLEAU
Accroissements en surface terrière et principales caractéristiques des peuplements étudiés.
Basai area increment and main characteristics of the stands studied.
Forêt galerie Forêt de plateau
Parcelle T2 T6 S4(a) PI (b) P3 P4 P5
t y 9 4 9 6 4 4
STi (m2/ha) 17,4 17,6 8,1 - 18,7 13,9 27,4
STf (m2/ha) 17,0 20,9 12,5 - 19,4 15,5 28,2
L (%) 1,5 1,4 0,4 - 0,6 2,0 1,2
AN (m2/ha/an) 0,22 0,51 0,82 - 0,27 0,38 0,59
R (%) 1,3 2,6 8,0 1,8 1,4 2,6 2,1
CV(%) 42 36 21 76 44 34 11
Rmn (%) 0,7 1,0 5,7 0,5 0,4 1,3 1,8
max (%) 2,1 3,9 10,4 4,5 2,4 3,5 2,4
(a) Jeune peuplement forestier en lisière forêt-savane protégée des feux depuis 15 ans (Young forest stand on a forest-savanna boundary protected from fire for 15 years).
(b) Arbres de la strate supérieure seulement (Upper loyer trees only).
t : nombre d'années de mesure; number of years of monitoring; STi, STf : surface terrière au début et à la fin de l'expérience (arbres de plus de 20 cm de circonférence); basai area at the beginning and at the end of the experimentation (trees over 20 cm girth); AN : accroissement net annuel; net annual increment; L : pertes de surface terrière dues à la mortalité;, losses of basai area due to mortality; R : accroissement relatif; relative growth rate; CV : coefficient de variation de la moyenne des accroissements; variation coefficient of the mean growth rate; Rmin, Rmax, : accroissements relatifs minimal et maximal observés; minimum and maximum relative growth rates observed.
— l'accroissement net annuel entre les années i— 1 et i,
où M;_1 _ i est la surface terrière des arbres morts entre les années i— 1 et i; — l'accroissement annuel relatif des arbres vivants l'année i,
— le taux de disparition de surface terrière dû à la mortalité,
III. RÉSULTATS. — (a) Répartition saisonnière des accroissements. — Les histogrammes des distributions mensuelles des accroissements en surface terrière des peuplements ont la même allure générale que les histogrammes des pluviosités; on y retrouve en particulier le maximum de juin et le minimum de janvier (fig. 1 et 2). L'affaissement du mois d'août n'y apparaît en revanche généralement pas, ce qui confirme l'idée selon laquelle août n'est pas ici un mois biologiquement sec ([5], [6]).
(b) Variabilité inter-annuelle. — La^production d'un même peuplement varie considérablement d'une année à l'autre : dans une galerie forestière (parcelle T6) étudiée de 1972 à 1981, le plus faible accroissement est de 1 % en 1980 et le plus fort de 3,9 % en 1974 (fig. 3); ces valeurs correspondent à des accroissements absolus de 0,20 et 0,74 m2/ha/an, la moyenne durant ces 9 années étant de 0,51+0,18 m2/ha/an (tableau).
C'est sur la parcelle PI, où seuls les arbres de la strate supérieure ont été étudiés, que l'amplitude de variation la plus grande a été observée, probablement parce que ces arbres sont soumis plus directement aux aléas climatiques : l'accroissement le plus faible, en 1980, y est de 0,5 %, le plus fort, en 1975, de 4,5 %
Sur les autres parcelles l'écart entre les extrêmes est également important puisque les valeurs maximales observées sont jusqu'à cinq fois supérieures aux minimales (tableau).
C. R. Acad. Sci. Paris, t. 309, Série III, p. 423-428, 1989 427
(c) Influence des facteurs climatiques. — Pour les trois parcelles suivies pendant 9 années (T 2, T 6, P1), les corrélations entre pluviosité et accroissement annuel, respectivement de 0,232, 0,423 et 0,132, ne sont pas significatives (fig. 3). L'analyse montre en outre que les accroissements mensuels les plus forts ne correspondent pas aux plus fortes précipitations, mais qu'ils sont en revanche liés à une faible evaporation et à un large étalement des pluies dans le mois, ainsi qu'à l'excédent hydrique du mois précédent (fig. 4). Les fortes rétractions du tronc correspondent au contraire à une forte demande évaporatoire; elles sont d'autant plus accusées que les déficits hydriques du mois et du mois précédent sont importants.
(d) Variabilité inter-faciès. — La production varie largement en fonction des stades évolutifs des formations. Les accroissements passent en effet du simple au quadruple entre une forêt mature (T2 : 0,22 m2/ha/an) et un peuplement de reconstitution d'une lisière forestière protégée des feux de savane depuis une quinzaine d'années (S4: 0,82 m2/ha/an). Dans un même îlot forestier, d'importantes différences existent entre les diverses phases sylvigénétiques : 0,27 m2/ha/an pour une phase mature (P3) et 0,59 m2/ha/an pour un stade de régénération (P5) (tableau).
Selon l'état de maturité de la forêt, le jeu de la croissance et de la mortalité peut se traduire par l'accroissement ou au contraire la stabilité dans le temps de la surface terrière.
Fig. 4. — Principaux facteurs climatiques déterminant les accroissements en surface terrière d'un peuplement forestier à Lamto. La figure est une représentation simplifiée de la projection des principales variables dans le plan des axes 1 et 2 d'une analyse factorielle des correspondances multiples. L'infléchissement pour les fortes valeurs de la courbe reliant dans l'ordre les classes d'accroissement est très significatif de la compensation qui existe entre la pluviosité (axe 2) et les facteurs représentés par l'axe 1 (insolation, évaporation, nombre de jours de pluie,...).
Fig. 4. — Main climatic factors governing basai area increment of a forest stand in Lamto. The figure is a simplified representation of main variables projection on the plane formed by axis 1 and 2 of a factorial analysis. The compensation between rainfall (axis 2) and the climatic factors determining axis 1 (sunlight duration, evaporation, number ofrainy days,...) is shown by the bending of the increments curve for high values.
428 C. R. Acad. Sci. Paris, t. 309, Série III, p. 423-428, 1989
Dans le cas de la parcelle T 2, galerie forestière dont les caractéristiques architecturales et dendrométriques sont celles d'une formation mature [3], la surface terrière semble relativement stable et son taux annuel de renouvellement est estimé, au risque de 5 %, à 1,3 ±0,3%.
Dans tous les autres peuplements étudiés la surface terrière a augmenté entre le début et la fin de l'expérience. Les accroissements relatifs annuels moyens y varient de 1,4 à 2,6 % et atteignent même 8 % dans un peuplement de reconstitution forestière (S 4). Les pertes par mortalité, qui varient en moyenne de 0,4 à 2 % (tableau), surviennent de façon très irrégulière et leur importance dépend de la taille des individus morts.
DISCUSSION ET CONCLUSIONS. — Les accroissements annuels moyens en surface terrière observés à Lamto varient — si l'on excepte les peuplements récents de reconstitution forestière — de 0,22 à 0,59 m2/ha/an. Dans un peuplement en équilibre le taux annuel moyen de renouvellement de la surface terrière est de l'ordre de 1,3+0,3 %. Ces valeurs sont du même ordre de grandeur que celles observées dans d'autres forêts denses africaines sèches ou humides ([3], [7], [8]). Cette similitude de la production cambiale contraste avec la différence de la production foliaire entre les forêts sempervirentes humides et les forêts semi-décidues ou sèches ([3], [8] à [11]). Ces résultats sont cohérents avec la théorie de Jordan ([12], [13]) pour qui la production de bois reste constante alors que la production foliaire diminue des basses vers les hautes latitudes.
La variabilité inter-annuelle de la production de bois est cependant importante puisque le coefficient de variation va de 36 à 42 % sur les parcelles étudiées pendant 9 ans. Pour obtenir une précision de 10 % sur l'estimation de la moyenne, au risque de 5 %, 24 à 33 années de mesures seraient donc nécessaires !
Les accroissements ne peuvent par ailleurs pas être déduits des totaux pluviométriques annuels puisqu'ils ne leur sont pas directement liés. La répartition des pluies, le stock hydrique des sols ou encore le pouvoir évaporant de l'air sont en effet déterminants pour la production de bois au cours du cycle annuel.
L'âge des peuplements est une autre cause de variabilité qui rend délicate la comparaison des sites expérimentaux en forêt tropicale naturelle. Pour être valables les comparaisons doivent porter sur des peuplements d'âge connu, aux caractéristiques dynamiques définies, ou sur des peuplements en équilibre où les accroissements compensent les pertes par mortalité. Note remise le 19 juin 1989, acceptée après révision le 8 août 1989.
RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES
[1] P. S. ASHTON et coll. in ORSTOM, UNESCO, Ecosystèmes forestiers d'Afrique, 1983.
[2] J. B. HALL, M. B. SWAINE, Forest vegetation in Ghana W. JUNK éd., La Haye-Boston-Londres, 1981, 383 p.
[3] J. L. DEVINEAU, Structure et dynamique de quelques forêts tropophiles de l'ouest africain, Thèse d'État es Sciences, Université Paris-VI, 1984, 295 p.
[4] F. G. LIMING, X Forestry, 55, 1957, p. 575-577.
[5] P. FORGE, Ann. Univ. Abidjan, E, 15, 1982, p. 7-25.
[6] C. LECORDIER, Bull, liaison chercheurs Lamto, n° spécial, 1, 1974, p. 45-103.
[7] A. HLADIK, Acta OEcologica/OEcologia Generalis, 3, (3), 1982, p. 373-392.
[8] Ch. HUTTEL et F. BERNHARD-REVERSAT, Terre et Vie, 29, 1975, p. 203-228.
[9] J. R. BRAY et E. GORGHAM, Advances in Ecological Research, 2, J. CRAGG éd., Académie Press, Londres, 1964, p. 101-157.
[10] J. L. DEVINEAU, OEcol. Plant., 11, 1976, p. 375-395.
[11] J. L. DEVINEAU, Ann. Univ. Abidjan, E, 15, 1982, p. 27-62. [12] C. F. JORDAN, Am. Sci., 59, 1971, p. 426-433.
[13] C. F. JORDAN et P. G. MURPHY, Am. Midl. Nat., 99, 1978, p. 415-434.
U.R.A. n° 1183, C.N.R.S., Laboratoire de Zoologie, 46, rue d'Ulm, 75005 Paris.
C. R. Acad. Sci. Paris, t. 309, Série III, p. 429-434, 1989 429
Cytologie animale/Animal Cytology
Détection ultrastructurale d'ARN ribosomal par hybridation
in situ à l'aide d'une sonde biotinylée sur coupes ultrafines
de cellule animale en culture
Françoise ESCAIG-HAYE, Vladimir GRIGORIEV et Jean-Guy FOURNIER
Résumé — L'utilisation d'une sonde génomique ribosomale marquée à la biotine a permis d'hybrider les molécules d'ARNr sur des coupes ultrafines de cellules incluses en résine hydrosoluble Lowicryl K4M. Après révélation avec la streptavidine couplée à l'or colloïdal de 10 nm, les séquences cibles ribosomales ont été localisées préférentiellement dans la zone fibrillaire dense du nucléole et dans des amas granulaires du cytoplasme correspondant aux polyribosomes. La méthode d'hybridation qui a été décrite offre la possibilité d'une détection rapide et précise de l'expression des gènes ribosomaux à l'échelle ultrastructurale.
Ultrastructural détection of ribosomal RNA in animal cells by in situ hybridization
on ultrathin sections using a biotinylated probe
Abstract — A genomic probe containing ribosomal sequences and labelled with biotine was used to hybridize rRNA molecules in ultrathin sections of animal cells embedded in Lowicryl K4M. After detection with streptavidin conjugated with 10 nm gold particles, ribosomal target sequences were localized preferentially in the dense fibrillar component of the nucleolus and in the polyribosome structures of the cytoplasm. The method presently described offers the possibility to detect rapidly and precisely ribosomal gene expression at the ultrastructural level, particularly under different physiological and pathological conditions.
Abridged English Version — The detection of genetic information at the cellular level with nucleic acid probes is possible with the in situ hybridization technique. This method is now widely used to localize DNA and RNA sequences from cellular or viral origins using optical microscopy.
Several attempts have been made to localize nucleic acid sequences more precisely at the ultrastructural level through electron microscopy ([1]-[6]). Recently a fine localization was obtained with probes labelled with biotine ([7]-[10]). We used this approach to study the expression of ribosomal genes (rRNA) in animal cells. So far, this expression has only been analyzed by indirect methods at the ultrastructural level [11] or by molecular hybridization at the optical level [12]. The present work describes a method which permits with a biotinylated double-stranded DNA probe to hybridize rRNA molecules in ultrathin sections of cells embedded in a hydrosoluble resin.
The VERO cell line used in this study was fixed in 4 % paraformaldehyde and 0.1% glutaraldehyde and embedded in Lowicryl K4M with the progressive low temperature technique [13]. The probe was an EcoRI genomic fragment of mouse DNA containing ribosomal sequences (a generous gift of Dr. Muramatsu) [14], cloned in pBR 322. 2 ug of the probe were labelled with Bio-11-dUTP using nick translation [15]. After precipitation, the probe was resuspended in 50 ul of freshly deionized formamide, SSC4X, 10 % Dextran sulfate and 1 mg/ml of salmon sperm and incubated with 80 nm ultrathin sections for 20 hrs. at 37°C. After successive washings, the hybrids were visualized with streptavidin conjugated with 10 nm gold particles.
The cell morphology was well preserved after the different stages of the hybridization protocol (Fig. 1, A, B). This could be related to the presence of glutaraldehyde in the
Note présentée par René COUTEAUX.
0249-6313/89/03090429 $ 2.00 © Académie des Sciences
430 C. R. Acad. Sci. Paris, t. 309, Série III, p. 429-434, 1989
fixative, as noted by several authors ([5]-[7]), the absence of deproteinization before hybridization, the reduced length of the wash and the absence of chemical treatment of autoradiography, since hybrids were revealed by immunotechnology. The specificity of the detection was controlled by the presence of labelling in a cell structure well known to contain rRNA such as the nucleolus and by the absence of labelling after hybridization with pBR 322 probe.
The gold particles which visualize the rRNA sequences were found essentially on the dense fïbrillar component of the nucleolus (Fig. 2, A) and the cytoplasmic polyribosomes (Fig. 2, B), while none of the other cell structures as labelled. In a recent work, detection of rRNA sequences in plant material was also observed exclusively in the nucleolus and cytosol [17]. Their detection in the dense fïbrillar component of the nucleolus reported here is in agreement with data on the site of the transcriptional activity of the rDNA ([11], [16]). Studies are in progress in our laboratory to specify why the granular component of the nucleolus and the rough endoplasmic reticulum reacted poorly with the probe.
The present data report the detection at the ultrastructural level of rRNA sequences in animal cells. The method described hère constitutes a baseline for further studies on ribosomal gene expression.
INTRODUCTION. — La détection d'une information génétique à l'échelle cellulaire avec des sondes geniques est possible grâce à la technique d'hybridation in situ. Son utilisation en microscopie optique est devenue une méthode courante pour localiser des séquences d'ARN ou d'ADN d'origine cellulaire ou virale.
Plusieurs tentatives ont été effectuées, pour préciser la localisation des acides nucléiques à l'échelle subcellulaire en employant le microscope électronique ([1]-[6]). Récemment des localisations fines ont même été obtenues avec des sondes biotinylées ([7]-[10]).
Nous avons utilisé ce type d'approche pour étudier l'expression des gènes ribosomaux (ARNr) dans la cellule animale. Deux raisons ont guidé ce choix. D'une part, le nucléole fournit un contrôle de spécificité, car il est le siège de la synthèse et de l'accumulation de l'ARNr. D'autre part, la détection moléculaire des transcripts ribosomaux n'a pas encore été effectuée en rapport direct avec l'ultrastructure du nucléole. En effet, la synthèse de l'ARNr a été étudiée jusqu'ici à l'échelle ultra-structurale par des méthodes indirectes [11] ou par hybridation moléculaire in situ en microscopie optique [12]. Le présent travail
LÉGENDE DE LA FIGURE 1
Fig. 1. — Cellules VERO hybridées avec la sonde biotinylée contenant les gènes ribosomaux et révélée à l'or colloïdal. (A) Les particules d'or qui visualisent les séquences d'ARNr sont présentes exclusivement dans le nucléole (n) et le cytoplasme. La matrice nucléaire (m), la chromatine (chr), l'enveloppe nucléaire (doubles flèches), et les mitochondries (flèches) ne sont pas marquées (G x 15000). (B) Dans le cytoplasme le reticulum endoplasmique granulaire est faiblement marqué (flèche), Lowicryl (L), nucléole (n), cytoplasme (c) (G x 35 000).
Fig. 1. — VERO cell hybridized with the biotinylated probe containing ribosomal genes. (A) The gold particles visualize rRNA sequences present exclusively in the nucleolus (n) and in the cytoplasm. Nuclear matrix (m), chromatine (chr), envelope (double arrows), mitochondria (arrows) are not labelled (M x 15,000). (B) In the cytoplasm a weak labelling is observed on the rough endoplasmic reticulum (arrow), L (Lowicryl), nucleolus (n), cytoplasm (c) (M x 35,000).
C. R. Acad. Sci. Paris, t. 309, Série III, p. 429-434, 1989 431
432 C. R. Acad. Sci. Paris, t. 309, Série III, p. 429-434, 1989
décrit une méthode qui permet d'hybrider l'ARNr sur coupes ultrafines de cellule animale en culture incluse en résine hydrosoluble avec une sonde ADN double brin biotinylée et révélée à l'or colloïdal.
MATÉRIEL ET MÉTHODES. — La lignée cellulaire VERO cultivée dans le milieu MEM contenant 5 % de sérum de veau foetal a été utilisée dans cette Note. Le culot cellulaire après fixation dans une solution de tampon phosphate contenant 4 % de paraformaldéhyde et 0,1 % de glutaraldéhyde a été inclus dans la résine Lowicryl K4M à basse température ( —20°C) et polymérisée sous rayons UV [13]. La sonde génomique est un fragment EcoRI contenant les séquences ribosomales 28 S et 18 S de souris cloné dans pBR 322 (fournie par le Dr Muramatsu) [14]. Le nucléotide biotinylé Bio-11-dUTP (Enzo) a été incorporé dans 2 ug de DNA sonde par déplacement de coupures (Nick translation) [15]. L'incorporation a été vérifiée après le dépôt de la sonde sur filtre de nitrocellulose et révélation par un système streptavidine-phosphatase alcaline (BRL). Après précipitation, la sonde est resuspendue dans 50 ni de la solution d'hybridation contenant 50 % de formamide fraîchement déionisée, SSC 4X (SSC lX = NaCl 0,15 M citrate de sodium 0,015 M), 10 % de sulfate de dextran et 1 mg/ml d'ADN de sperme de saumon dénaturé par sonication. Des coupes de 80 nm sont déposées sur grilles en or dépourvues de membrane et incubées avec la sonde pendant 20 h à 37°C à l'abri de la lumière. Les grilles sont ensuite transférées successivement dans des tampons de lavage
Fig. 2. — (A) Fort grandissement du nucléole de la figure 1 montrant un marquage à l'or au niveau du composant fibrillaire dense (G x 25000). (B) Particules d'or associées à des amas granulaires cytoplasmiques correspondant aux polyribosomes (G x 42000).
Fig. 2. — (A) Higher magnification of the nucleolus in Figure 1 a, showing gold labelling on the dense fïbrillar component (M x 25,000). (B) Gold particles associated with polyribosome structures (M x 42,000).
C. R. Acad. Sci. Paris, t. 309, Série III, p. 429-434, 1989 433
correspondant à 50 % de formamide SSC 4X : 2 x 10 mn puis SSC 4X : 2 x 10 mn et SSC 0,2 X : 2 x 5 mn. Pour révéler les hybrides formés, les grilles sont incubées pendant 15 mn dans un tampon phosphate 100 mM, sérum albumine bovine 1 % puis dans la streptavidine couplée à des particules d'or de 10 nm (Janssen) diluée au 1/50 pendant 45 mn à température ambiante. Après lavage dans un tampon phosphate-tween 0,05 % et dans l'eau, les coupes sont colorées à l'acétate d'uranyle à 5 % dans l'eau pendant 20 mn.
RÉSULTATS. — Après le traitement d'hybridation et de lavage la morphologie cellulaire reste bien préservée. Les organites cellulaires majeurs tels que le noyau, les mitochondries et le réticulum endoplasmique rugueux sont bien identifiables. Les particules d'or qui visualisent les séquences d'ARNr hybridées avec la sonde sont localisées dans l'organite cellulaire attendu c'est-à-dire le nucléole ainsi que dans le cytoplasme. Les structures nucléaires (matrice, chromatine, enveloppe) et les mitochondries ne sont pas marquées (fig. 1 A). Par ailleurs, la résine d'inclusion montre une très faible réactivité de bruit de fond (fig. 1 B). Une analyse des particules d'or montre qu'au niveau du nucléole la zone fibrillaire dense contient des séquences qui se sont appariées préférentiellemnt avec la sonde (fig. 2 A). Dans le cytoplasme la répartition des particules d'or est diffuse, associée parfois à des amas granulaires (fig. 2B) tandis que le reticulum endoplasmique rugueux montre une plus faible réactivité d'hybridation (fig. 1 B).
DISCUSSION. — Nous avons décrit une méthode qui permet de visualiser avec des particules d'or des séquences d'ARNr à l'échelle subcellulaire après hybridation avec une sonde génomique biotinylée. Le protocole utilisé permet une bonne préservation de l'ultrastructure cellulaire qui peut s'expliquer par : (1) l'addition de glutaraldehyde (0,1 %) au paraformaldéhyde (4 %) comme l'ont remarqué d'autres auteurs ([5], [7]) qui protège mieux la substance cellulaire d'une extraction par la formamide surtout au cours de l'étape d'hybridation; (2) l'absence d'un prétraitement perméabilisant (HC1, protéase, détergent) d'usage classique pour l'hybridation en optique; (3) les lavages courts et la révélation non radioactive des hybrides qui évite le traitement chimique de l'autoradiographie.
La spécificité de la détection des séquences ribosomales est contrôlée par la localisation attendue de la réactivité au niveau du nucléole et par l'absence d'hybridation lorsque les coupes sont incubées avec une sonde ne contenant pas les gènes ribosomaux.
Notre approche qui consiste à hybrider sur des coupes ultrafines après inclusion (postembedding) nous a permis d'utiliser une sonde de type DNA double brin qui en raison de son faible pouvoir de diffusion, comparé aux sondes oligonucléotidiques, a un rendement médiocre en hybridation sur coupes au vibratome (pré-embedding) [5]. Ce type de sonde peut toutefois incorporer plus de molécules de biotine que les sondes oligonucléotidiques et présenter ainsi plus de sites de révélation [5].
L'utilisation de sondes non radioactives offre l'avantage en microscopie électronique de pouvoir atteindre des résolutions extrêmement fines surtout lorsqu'elles sont révélées avec des particules d'or ([7]-[9]) ou de ferritine [10]. Dans ce travail la précision du marquage à l'or colloïdal a permis de localiser les séquences d'ARNr surtout dans la zone fibrillaire dense du nucléole, en accord avec les données de la littérature sur le site de l'activité transcriptionnelle des gènes ribosomaux ([11], [16]). Dans le cytoplasme les particules d'or sont localisées dans certains cas sur des formations granulaires difficilement identifiables sur le plan cytologique, mais qui compte tenu de leur réactivité avec la sonde ribosomale peuvent être considérées comme des polyribosomes. Quant au reste du
434 C. R. Acad. Sci. Paris, t. 309, Série III, p. 429-434, 1989
marquage qui n'est pas associé à des structures discernables on peut penser qu'il correspond à des ribosomes libres. Dans un travail récent, la localisation des séquences d'ARNr dans du matériel végétal a aussi été décrite dans le nucléole et le cytosol [17]. Le faible marquage à l'or sur le réticulum endoplasmique rugueux et pratiquement son absence au niveau du composant granulaire du nucléole peut s'expliquer par une protection des séquences cibles due à une conformation spatiale particulière des molécules d'ARNr qui les rend peu accessibles à la sonde. Des études sont en cours pour préciser ce point. Même si des paramètres techniques peuvent être encore améliorés, le protocole d'hybridation présenté ici constitue déjà une base de travail pour l'analyse de l'expression des gènes ribosomaux à l'échelle ultrastructurale, protocole que l'on peut envisager d'étendre à l'étude d'autres gènes cellulaires, voire viraux.
Ce travail a été effectué dans le cadre d'une coopération franco-soviétique entre l'I.N.S.E.R.M. et l'Académie de Médecine de Moscou dont V. Grigoriev est bénéficiaire. Les auteurs remercient G. Morel, A. Trembleau, D. Leguellec pour leurs discussions fructueuses, M. Vignal pour l'amplification du plasmide, D. Touret pour l'iconographie, L. Sergent et M. C. Rufino pour la préparation du manuscrit.
Note remise le 26 juin 1989, acceptée le 18 juillet 1989.
RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES
[1] J. K. JACOB, M. TODD, L. BIRNSTEIL et A. BIRD, Biochim. Biophys. Acta., 228, 1971, p. 761-766.
[2] O. CROISSANT, C. DAUGET, P. JEANTEUR et G. ORTH, C.R. Acad. Sci., Paris, 274, série III, 1972, p. 614-618.
[3] M. GEUSKENS et E. MAY, Exp. Cell. Res., 87, 1974, p. 175-185.
[4] G. MOREL, P. DUBOIS et F. GOSSARD, C.R. Acad. Sci. Paris, 302, série III, 1986, p. 479-484.
[5] A. TREMBLEAU, M. FEVRE-MONTANGE et A. CALAIS, C.R. Acad. Sci. Paris, 307, série III, 1988, p. 869-874.
[6] D. LEGUELLEC et M. FRAPPARD, Biol. Cell (soumis).
[7] M. BINDER, S. TOURMENTE, J. ROTH, M. RENAUD et W. J. GEHRING, J. Cell. Biol, 102, 1986, p. 1646-1653.
[8] N. HARRIS et R. R. D. CROY, Protoplasma, 130, 1986, p. 56-67.
[9] J. BRANGEON, J. L. PRIOUL et A. FORCHIONI, Plant. Physiol, 86, 1988, p. 990-992.
[10] H. de F. WEBSTER, L. LAMPERTH, J. T. FAVILLA, G. LEMKE, D. TESIN et L. MANUELIDIS, Histochem., 86, 1987, p. 441-444.
[11] G. GOESSENS et A. LEPOINT, Biol. Cell, 35, 1979, p. 211-220.
[12] J. T. MCCABE, J. I. MORELL, R. IVELL, H. SCHMALE, D. RICHTER et D. W. PFAFF, J. Histochem. Cytochem, 34, 1986, p. 45-50.
[13] V. B. GRIGORIEV, J. P. KADOCHICOV, I. A. RUDNEVA, E. V. KARAMOV, S. M. KLIMENKO, F. ESCAIG et J. G. FOURNIER, Path. Res. Pract., 184, 1989, p. 494-497.
[14] Y. MISHIMA, R. KOMINAMI, R. HOUJO et M. MURAMATSU, Biochemistry, 19, 1980, p. 3780-3786.
[15] J.-G. FOURNIER, A. KESSOUS, G. RICHER, C. BRECHOT et R. SIMARD, Biol. Cell, 43, 1982, p. 225-228.
[16] M. THIRY, U. SCHEER et G. GOESSENS, Biol. Cell, 63, 1988, p. 27-34.
[17] G. I. MCFADDEN, I. BONIG, E. C. CORNISH et A. E. CLARKE, Histochemical J., 20, 1988, p. 575-586.
F. E. et J.-G. F. : Hôpital Saint-Vincent-de-Paul, I.N.S.E.R.M., U. n°43,
74, avenue Denfert-Rochereau, 75014 Paris;
V. G. : Institut Ivanovsky de Moscou, U.R.S.S.
C. R. Acad. Sci. Paris, t. 309, Série III, p. 435-440, 1989 435
Endocrinologie/Endocrinology
Prolactine et liaison spécifique de testosterone dans les cellules de vésicule séminale de Gobius niger L. en culture
Jean-Pierre BONNIN
Résumé — Les cellules de vésicule séminale de Gobius niger L., cultivées en monocouche, sont utilisées, après 15 jours environ de culture préalable, pour suivre leur capacité de liaison de la testosterone. Ces cellules entières montrent une liaison spécifique de cet androgène évoluant vers la saturation, en présence de concentrations croissantes d'hormone; l'analyse de Scatchard indique une bonne affinité (KD=4,4.10-9M) pour un nombre de sites de 5,06.10- 15 mole par culture. L'existence possible d'une autre population de sites à affinité plus faible et effectif plus élevé n'a pu être précisée avec certitude. L'évolution en fonction du temps, à la température de 18°C, indique une liaison maximale à 60 mn, suivie d'une chute rapide dès 90 mn. La compétition à l'égard de l'oestradiol, des 11-céto- et 11-hydroxytestostérone indique une spécificité non totale mais relativement marquée à l'égard de ces stéroïdes, les taux de réaction croisée au niveau de 50% de liaison étant respectivement de 10,9, 8,5 et 4,02%. Après traitement préalable des cultures par la prolactine ovine pendant 6 jours, le niveau de liaison est augmenté de façon très significative (p .019, p .005) par rapport aux cultures témoins. Ce résultat montre que les effets de synergie prolactine-testostérone déjà signalés chez les Siluridés et les Gobiidés s'expliquent par une influence de la prolactine sur les taux de récepteurs d'androgènes, s'exerçant directement sur les cellules de la vésicule séminale.
Testosterone specifie binding and prolactin in the Gobius niger L. seminal vesicle
cultured cells
Abstract — Cultured seminal vesicle cells of Gobius niger L., precultured for about 15 days, are tested for their Testosterone-binding capacity. This whole cell System shows a specific binding of the androgen, reaching saturation in the presence of increasing amounts of ligand and the Scatchard Plot indicates a good affinity (KD=4.4x 10-9M), involving a number of sites of 5.06 x 10- 15 mole/culture. The possible existence of a second binding-site population with lower affinity and greater number of sites remains to be demonstrated. At 18°C, the time course shows a maximal binding after about 60 min. of incubation, followed by a rapid decline at 90 min. The competition experiments involving estradiol, W-keto- and 11-hydroxytestosterone indicate an effective if not total specificity to these steroids. The cross-reaction percentages at the 50% binding level are respectively 10.9, 8.5, 4.02%. Ovine Prolactin treatment of the cultures for 6 days before the binding experiment significantly improves the specifie binding level of testosterone if compared to the controls (p .019, p .005). This resuit indicates that the Prolactin-Testosterone synergistic data already obtained on the seminal vesicles of Siluridae and Gobiidae is explained by a direct effect of the Prolactin on the androgen receptor level in the seminal vesicle cell.
Abridged English Version — The synergistic effects of androgens and prolactin on the seminal vesicle have been demonstrated in some maie teleosts ([1], [2], [3]) and ovine Prolactin (oPRL) increases the weight of the seminal vesicle in the intact Gobius niger [4]. In the mammalian prostate, such effects are related to a reciprocal regulation of the levels of cellular hormone receptors ([7], [8], [9]). The present study, using an in vitro whole cell System previously described [6], investigates specifie testosterone binding and the effect of oPRL on the testosterone binding level.
Two-week-old cultures were incubated at 18°C with 3 H-testosterone alone to determine total binding and with the same hormone plus a 300-fold excess of cold steroid to determine non-specific binding. The cultures were then washed at 4°C. Incubation and washing media contained charcoal-treated steroid-free serum. In all cases the results were expressed per culture unit. Binding saturability was studied by incubation in the presence of increasing amounts of label (range 0.3 to 10 nM) and expressed by curves (Fig. 1) and Scatchard plot analysis (Fig. 2). Inhibition curves and specificity data were obtained by competition
Note présentée par Maurice FONTAINE. 0249-6313/89/03090435 $ 2.00 © Académie des Sciences
436 C. R. Acad. Sci. Paris, t 309, Série in, p. 435-440, 1989
between a constant concentration of label and increasing amounts of four different cold steroids (Fig. 3) in proportions ranging from zero (total binding) to 105 (total inhibition or non-specific binding). The difference between the two values for testosterone is the maximum specifie binding (100%) and all other values are expressed as percentages of this. The time course has been previously studied [6]. The effect of temperature was not examined here. To study the action of prolactin, each series was divided into control and 6-day oPRL-treated cultures (2 changes of medium, 150 ug oPRL/ml) and used to determine the testosterone specifie binding at three incubation times (30, 60 and 90 min.) (Fig. 4). The results were expressed as percentages of the maximum control value.
(i) Specifie binding of testosterone was demonstrated. This binding tended towards saturation in the presence of increasing amounts of ligand. Scatchard-plot analysis reveals the involvement, between 0.3 and 5nM of label, of a site population with good affinity (KD=4.4x 10-9M) and site number of 5.06 x 10-15mole/culture (Fig. 2). A slope change at l0nM possibly indicates a second binding site population, (ii) Competition experiments indicate an effective, if not total, specificity against E2, 11 KT and 11 oHT. The crossreaction percentages at the 50% binding level are respectively 10.9, 8.5 and 4.02%. (iii) Maximum binding occurs around 60 min. with rapid decline around 90 min. as previously described [6] (Fig. 4). Variance analysis shows a significant effect of the time factor (p .018). (iv) oPRL treatment increases the testosterone binding level and variance analysis of the three series indicates that the treatment is statistically significant (p .03). Concerning the statistically-authorised pool of the three series, the treatment is even more significant (p .019) for all three incubation times considered globally. For the maximum-binding individual incubation time (60 min.), the effect of oPRL is highly significant (p .005).
These results show that this seminal vesicle whole cell System specifically binds testosterone and that oPRL increases the testosterone-receptor cell content, which explains the synergistic effect between androgens and prolactin in the seminal vesicle.
La synergie de la prolactine avec les androgènes dans la stimulation des vésicules séminales est connue chez un Gobiidé, Gillichthys mirabilis[l] et un Siluridé, Heteropneustes ([2], [3]). Chez Gobius niger [4], le traitement du poisson intact par la prolactine ovine augmente la testostéronémie, et les niveaux pondéraux de la gonade et des vésicules séminales. Ces deux derniers faits n'apparaissent qu'après un temps de traitement prolongé jusqu'à 3 semaines ce qui laisse supposer un mode d'action indirect de cette hormone. Chez les Mammifères, de très nombreux travaux [5] traitent des effets synergiques de la prolactine et des androgènes sur la prostate. Pour tenter de déterminer le mode d'action de la prolactine sur les vésicules séminales chez Gobius niger, nous avons réalisé un dispositif expérimental basé sur des cultures cellulaires de cet organe [6], et pu vérifier de façon préliminaire que la prolactine seule semble peu efficace sur les niveaux de sécrétion in vitro de ces cellules glandulaires. Par analogie avec les Mammifères chez qui il existe dans la prostate des interactions androgènes-prolactine influençant réciproquement les taux de récepteurs respectifs ([7], [8], [9]), nous avons tenté : (1) de définir les modalités de la liaison de testosterone par les cellules de vésicule séminale en culture; (2) de détecter une modification possible de cette liaison sous l'effet de la prolactine.
C. R. Acad. Sci. Paris, t. 309, Série III, p. 435-440, 1989 437
MATÉRIEL ET MÉTHODES. — Comme précédemment décrit [6], les différents protocoles comportent une incubation de cultures âgées de 2 semaines en présence de 1, 2, 6, 7, 3 H testosterone (A.S. 86Ci/mmol), à 18°C, suivie de quatre rinçages successifs à 4°C. Le sérum inclus dans les milieux d'incubation et de rinçage a chaque fois été traité par le charbon-dextran pour l'élimination des stéroïdes sériques. Les résultats, exprimés par rapport à l'unité de culture, sont soumis à l'analyse de variance, et aux comparaisons de moyennes par les tests de Student, de Cochran, de Mann et Whitney.
A. LIAISON. — 1° Saturabilité. — Chaque série de cultures est partagée en sept lots dont un lot témoin incubé en milieu neutre pour les contrôles histologiques, et six lots incubés pendant 55mn face à des concentrations de traceur étagées entre 0,3 et 10nM. Dans chaque lot, deux cultures reçoivent en plus un excès de testosterone froide (300 x ) pour déterminer la liaison aspécifique moyenne, trois autres indiquent la liaison totale. Les différences entre les deux représentent les liaisons spécifiques exprimées par un graphique et soumises à l'analyse de Scatchard.
2° Inhibition. Spécificité. — Toutes les cultures de chaque série sont incubées en présence de 3 H-testostérone à la concentration de 0,4 uCi/ml pendant 55 mn : quatre cultures sans addition de stéroïde froid (point zéro) indiquent la liaison totale; les autres sont réparties en six groupes soumis à la compétition de stéroïde froid, selon une gamme croissant dans des rapports de concentration au traceur étages entre 1 et 105. Les stéroïdes utilisés sont la testosterone, l'oestradiol, la 11. cétotestostérone, la 11. hydroxytestostérone. Chaque point représente deux cultures, le point 105 une seule. Ce dernier, dans le cas de la testosterone, représente l'inhibition maximale, donc la liaison aspécifique, et sa soustraction de la liaison totale (point zéro) donne la liaison spécifique maximale égale à 100%. Les autres niveaux de liaison spécifique, dans tous les groupes, sont exprimés en fonction de celle-ci.
3° Évolution dans le temps. — Déjà publiée [6], elle n'est pas répétée ici.
4° Température. — L'influence des variations de ce paramètre n'a pas été étudiée.
B. PROLACTINE. — Le traitement par la prolactine ovine (NIADD-oPRL 16) (1) est effectué à raison de 150ug/ml de milieu pendant 6 jours avant l'expérimentation, ce qui implique deux renouvellements de milieu. Trois séries A, B, C de 48 cultures âgées de 19, 17 et 15 jours ont chacune été partagées en lot témoin et lot traité, eux-mêmes répartis en trois groupes aux temps d'incubation progressifs de 30 mn (t1, 60 mn (t2), 90 mn (t3). Dans chaque groupe, quatre cultures donnent la liaison totale, quatre la liaison aspécifique. La moyenne de ces dernières valeurs est soustraite de chacune des valeurs précédentes pour obtenir les valeurs de la liaison spécifique, exprimées pour finir en pourcentage de la liaison spécifique témoin maximale. Le milieu d'incubation des lots traités comporte de la prolactine. La concentration de 3 H-testostérone est de 1 uCi/ml (séries A, C) ou de 0,4 uCi/ml (série B).
RÉSULTATS. — A. Liaison de testosterone. — (a) La liaison spécifique évolue vers la saturation qui dans les conditions utilisées n'est toutefois pas totale (fig. 1). L'analyse de Scatchard traduit la mise en jeu, entre des concentrations de 0,3 et 5nM de traceur, d'une population de sites dont le KD est de 4,4.10-9M et l'effectif de l'ordre de 5,06.10-15mole/culture (fig. 2). Entre 5 et 10nM de traceur, un début de changement de pente pourrait indiquer l'existence d'une autre population de sites qui reste à caractériser.
438 C. R. Acad. Sci. Paris, t. 309, Série m, p. 435-440, 1989
C. R. Acad. Sci. Paris, t. 309, Série III, p. 435-440, 1989 439
LÉGENDES DES FIGURES
Fig. 1. — Courbe de saturation pour des concentrations croissantes de traceur (• • liaison totale,
+ + liaison aspécifique, * * liaison spécifique).
Fig. 1. — Saturation curve by increasing labelled hormone concentrations (• • total binding, + +
non specifie binding, * * spsecific binding).
Fig. 2. — Représentation de Scatchard (BS: liaison spécifique, U: radioactivité libre). Fig. 2. — Scatchard Plot (BS : Specifie bound radioactivity, U: unbound radioactivity).
Fig. 3. — Courbes comparées d'inhibition pour des concentrations croissantes des stéroïdes indiqués (E2: oestradiol; 11-céto-T= 11-cétotestostérone; 11-hydroxyT= 11-hydroxytestostérone).
Fig. 3. — Comparative curves of binding inhibition by increasing amounts of mentionned steroids (E2: Estradiol, 11-ceto T: 11-ketotestosterone, 11-hydroxy T: 11-hydroxytestosterone).
Fig. 4. — Liaison spécifique de testosterone : cultures témoins ou traitées par la prolactine (moyennes ± erreurs
standard; t1 t2, t3 : temps d'incubation). Fig. 4. — Specifie testosterone binding: control cultures and prolactin treated cultures (mean±SEM; tx, t2, t3:
incubation time scale).
(b) Les courbes comparées d'inhibition par divers stéroïdes (fig. 3) montrent que les pourcentages de croisement au niveau de 50 % de liaison sont de 10,9 % pour l'oestradiol, 8,5% pour la 11-cétotestostérone et 4,02% pour la 11-OH-testostérone.
(c) L'observation antérieure [6] d'une liaison maximale vers 60 mn suivie d'une chute rapide à 90 mn puis lente jusqu'à 4 h se retrouve sur la figure 4, où l'analyse de variance confirme un effet significatif du facteur temps (p .018).
B. Prolactine. — (a) Dans chaque série la liaison maximale au temps t2 est largement supérieure dans les cultures traitées par la prolactine. Les niveaux entre témoins et traités sont beaucoup plus comparables pour les temps t1 et t3.
(b) Toutefois, l'analyse de variance respective de chaque série n'indique pas un effet significatif du traitement, et les tests de comparaisons de moyennes pour les temps t2 où la liaison est maximale donnent des niveaux de significativité confinés entre p .057 et p. 17.
(c) En revanche, l'analyse de variance portant sur les trois séries indique un effet significatif du traitement (p .03), tout en démontrant la non-intervention du facteur « série » (F=0,065) et surtout l'absence totale d'interaction entre les facteurs « série » et « traitement » (F = 0,844), ce qui autorise la réunion des trois séries.
(d) L'analyse de variance portant alors sur le pool des trois séries indique que les niveaux de liaison pour les cultures témoins et les cultures traitées, sur l'ensemble des temps d'incubation, diffèrent de façon significative (p .019).
(e) L'analyse de variance et les comparaisons de moyennes portant sur le temps t2 seul des trois séries réunies indiquent une différence de liaison spécifique entre témoins et traités significative au niveau p .005.
DISCUSSION. — Les résultats ci-dessus permettent d'affirmer : ( 1) il existe une liaison spécifique de testosterone, caractérisable et quantifiable, dans les cellules de vésicules séminales en culture; (2) la prolactine ovine modifie en l'augmentant le niveau de cette liaison.
Sachant que dans chaque série les effectifs cellulaires sont comparables [6] et qu'après 2 semaines de culture les niveaux physiologiques doivent être uniformes, les résultats sont rapportés à l'unité de culture, ce qui évite des sources d'erreurs [6] et la réduction des lots.
440 C. R. Acad. Sci. Paris, t. 309, Série III, p. 435-440, 1989
a il existe une population de sites saturables a bonne attinite, l' éventualité d une deuxième, à affinité plus faible, reste à démontrer : les essais de saturation par de plus fortes concentrations allant jusqu'à 30 nM ont chaque fois donné des résultats discordants liés soit à des phénomènes métaboliques dus à de telles concentrations d'hormone pendant le temps d'incubation à la température physiologique, soit plutôt à un « trapping » trop important dans ces conditions et difficile à éliminer : le rinçage après incubation de la radioactivité non liée a été difficile à perfectionner; cela peut s'expliquer par les microstructurations qui tendent à affecter les cultures [6] et vraisemblablement favorisent le piégeage de radioactivité.
La spécificité à l'égard de la 11-céto et de la 11-hydroxy testosterone, si elle n'est pas totale (croisements de 8,5 et 4% respectivement), est toutefois nettement marquée. Il serait nécessaire de vérifier si ces cellules possèdent des sites de liaison plus spécifiques des 11-dérivés.
La chute rapide entre 60 et 90 mn doit être liée à une métabolisation qu'il serait intéressant de suivre.
Le résultat majeur est que la prolactine ovine augmente la liaison spécifique de testosterone : puisque la prolactine n'agit directement ni sur l'activité sécrétoire ni sur la densité cellulaire [6], son action consiste en une augmentation du nombre de sites de liaison, donc de récepteurs cellulaires de testosterone. La dose apparemment forte d'oPRL, choisie après les essais préliminaires, se justifie par la nature hétérologue de l'hormone et son instabilité probable entre deux changements de milieu.
Cet effet de la prolactine explique donc la synergie avec la testosterone déjà signalée chez les Siluridés et certains Gobiidés. Ce modèle rappelle celui, très étudié, de la prostate des Mammifères ([7], [8], [9]) et, comme pour cet organe il serait d'un grand intérêt de préciser : (a) comment évoluent respectivement les récepteurs cytosoliques et les récepteurs nucléaires; (b) comment et dans quelles conditions ces cellules lient la prolactine, et s'il existe une interrégulation réciproque des taux respectifs de récepteurs de prolactine et d'androgènes.
(1) La prolactine ovine a été gracieusement fournie par le N.I.H. Bethesda, U.S.A. Note remise le 26 juin 1989, acceptée le 8 août 1989.
RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES
[1] V. L. DE VLAMING et B. I. SUNDARARAJ, Biol. Bull, 142, 1972, p. 243-250.
[2] B. I. SUNDARARAJ et S. V. GOSWAMI, Gen. Comp. Endocrinol, 5, 1965, p. 464-474.
[3] B. I. SUNDARARAJ et S. K. NAYYAR, Gen. Comp. Endocrinol, Supplt. 2, 1969, p. 69-80.
[4] J. P. BONNIN, C. R. Acad. Sci. Paris, 292, série III, 1981, p. 319-322.
[5] A. A. SANDBERG, The prostatic Cell: Structure and Function, part B, 1981, p. 55-62.
[6] J. P. BONNIN, C. R. Soc. Biol, 181, 1987, p. 574-583.
[7] G. S. PRINS, Endocrinology, 120, 1987, p. 1457-1464.
[8] S. ODOMA, S. D. CHILSHOLM, K. NICOL et F. K. HABIB, J. UroL, 133, 1985, p. 717-720.
[9] J. L. S. BARANAO, R. M. OLIVEIRA-FILHO, V. A. CHIAUZZI, J. C. CALVO, E. H. CHARREAU et
R. S. CALANDRA, J. Androl., 3, 1982, p. 281-288.
Laboratoire de Biologie marine, Université de Bordeaux-I, avenue des Facultés, 33405 Talence Cedex.
C. R. Acad. Sci. Paris, t. 309, Série III, p. 441-446, 1989 441
Neurobiologie/Neurobiology
Effets de la stimulation des récepteurs Dt et D2
dopaminergiques sur la libération d'acide
y-[3H] aminobutyrique induite électriquement
dans le cortex préfrontal du rat
Jacqueline PENIT-SORIA, Sylvie RETAUX et Yves MAURIN
Résumé — Les effets d'agonistes et d'antagonistes spécifiques des récepteurs D, et D2 dopaminergiques sur la libération électriquement induite d'acide y-[3H] aminobutyrique (3H-GABA) ont été étudiés sur des tranches de cortex préfrontal de rat. La libération de 3H-GABA est en majeure partie dépendante du Ca++, puisque son omission de la solution de perfusion provoque une chute de la libération de 3H-GABA de 62%. Deux agonistes dopaminergiques spécifiques des récepteurs de type D2 : le RU 24926 (10- 7 M) et le lisuride (10-6M) inhibent respectivement de 32% et de 50% la libération de 3H-GABA induite électriquement. L'inhibition induite par le RU 24926 est totalement supprimée par le sulpiride (10-5M), un antagoniste sélectif des récepteurs dopaminergiques de type D2. L'effet du lisuride est presque totalement supprimé par la même concentration de sulpiride. L'activation des récepteurs D1 dopaminergiques par l'agoniste sélectif SKF 38393 (10- 5 M) ne provoque aucune modification significative de la libération de 3H-GABA. Ces résultats suggèrent qu'in vitro, dans le cortex préfrontal de rat, seuls les récepteurs dopaminergiques de type D2 sont impliqués dans la modulation de la libération de 3H-GABA. Leur activation entraîne une inhibition importante de la libération de 3H-GABA induite électriquement.
Stimulation of D1 and D2 dopaminergic receptors: effects on the electrically-evoked
release of y-[3H] aminobutyric acid in the rat prefrontal cortex
Abstract — The effects of Dl and D2 dopaminergic agonists and antagonists on the electricallyevoked release of y-[3H] aminobutyric acid (3H-GABA) have been studied on rat prefrontal cortex slices. The major part of the electrically-evoked release of 3H-GABA appeared to be Ca+ + dependent since a 62% decrease was observed when calcium was removed from the superfusion medium. Two specifie D2 dopaminergic agonists, RU 24926 (10-7M) and lisuride (10-6M), respectively induced a 32% and a 50% inhibition of the electrically-evoked release of3H-GABA. The selective D2 dopaminergic antagonist sulpiride (10- 5 M) totally abolished the effect of RU 24926 and partially abolished the effect of lisuride. The selective D1 agonist SKF 38393 (10_5M) did not affect 3H-GABA release. These results suggest that in the rat prefrontal cortex in vitro, the dopaminergic modulation of3H-GABA release is mediated through D2 but not Dl receptors. The activation of D2 dopaminergic receptors induces an inhibition of the electrically-evoked release of 3H-GABA.
Abridged English Version — The prefrontal cortex is the main cortical target of the mesencephalic dopaminergic neurons localized in the ventral tegmental area (VTA). In vivo, VTA stimulation decreases the spontaneous firing rate of prefrontal neurons [1]. This effect involves dopamine (DA) since it disappears after the selective destruction by 6-hydroxydopamine of the mesocortical dopaminergic pathway [1]. Furthermore, the D2 dopaminergic antagonist, sulpiride, abolishes the effect of VTA stimulation [2]. In an in vitro electrophysiological study, we previously showed that in the prefrontal cortex, DA increases the firing rate of GABAergic interneurons [3]. These in vitro results suggest that the inhibition of the spontaneous firing observed in vivo in response to VTA stimulation might be due, at least in part, to the excitatory effect of DA on GABAergic interneurons. In the present work, we studied the effects of selective agonists and antagonists of D1 and D2 dopaminergic receptors on the electrically-evoked release of 3H-GABA in prefrontal cortex slices.
The preparation of the slices and the measurement of the electrically-evoked 3H-GABA release were very similar to those previously described ([3], [4]). Briefly, rats were decapitatNote
decapitatNote par Pierre BUSER. 0249-6313/89/03090441 $ 2.00 © Académie des Sciences
C. R., 1989, 2' Semestre (T. 309) Série III - 32
442 C. R. Acad. Sci. Paris, t. 309, Série III, p. 441-446, 1989
ed and a block of tissue corresponding to the forebrain was isolated. Using a vibroslice, 500 um thick slices were eut in a coronal plane. The prefrontal part of the cortical slices was isolated using fine scisors under lens control. Endogenous stores of GABA were labelled with 3H-GABA by incubating the slices at 25°C, during 20 min., in a modified Krebs' solution containing 2x 10- 7 M 3H-GABA (S.A. 50 Ci/mmol). The modified Krebs solution was composed of: 118 mM NaCl, 4.7 mM KC1, 1.3 mM CaCl2, 1.2 mM MgCl2, 1.0 mM NaH2P04, 25 mM NaHC03, 11 mM glucose, 0.004 mM EDTA-Na2, 0.11 mM ascorbic acid, and 0.2 mM aminooxyacetic acid. The solution was bubbled with a mixture of 95% 02/5%CO2. Slices were then placed in superfusion chambers and washed at 25°C by continuous superfusion with an oxygenated Krebs solution at a rate of 1 ml/min. during 60 min. Two periods of electrical stimulation (SI, S2: 3 ms, 24 mA, 5 Hz, during 2 min.) were applied 64 and 96 min. after the beginning of the superfusion. Drugs were added 8 min. before S2, and their effect was measured by the value of S2/S1: ratio of the electrically-evoked 3H-GABA release induced by the second period of stimulation (S2) over the release induced in the first one (S1), measured in percent of tissue content. Our results can be summarized as follows:
(1) The electrivally-evoked 3H-GABA release was decreased by 62% when a calcium-free Krebs' solution was substituted for normal Krebs' solution (normal Krebs: S2/S1 =0.90 ±0.07, « = 12; OCa 2 + : S2/S1 =0.34 ±0.06, n = 7, p< 0.001, Student's f-test). Thus, the major part of the electrically-evoked release of 3H-GABA was calcium dependent.
(2) The D2 agonists RU 24926 (10- 7 M) and lisuride (10- 6 M) inhibited the electricallyevoked 3H-GABA release by 32 and 50%, respectively, while the selective D1 agonist SKF 38393 (10- 5 M) remained ineffective (Fig.). The inhibitory effect of RU 24926 was fully reversed, and the effect of lisuride was partially reversed by 10- 5 M sulpiride, a selective D2 antagonist (Fig.).
In conclusion, these results suggest that in the prefrontal cortex of the rat, the release of GABA is modulated by dopaminergic neurons acting through D2 and not Dl receptors.
INTRODUCTION. — Le cortex préfrontal (CPF) constitue la principale cible corticale des neurones dopaminergiques mésencéphaliques issus de l'aire tegmentale ventrale (ATV). In vivo, chez le rat anesthésié, la stimulation de l'ATV inhibe la décharge spontanée de la très grande majorité des neurones enregistrés dans le CPF [1]. L'abolition de cet effet après destruction sélective des neurones dopaminergiques de l'ATV par la 6-OHDA [1] implique une action de la dopamine sur les neurones du CPF. Cet effet est également aboli par l'administration de sulpiride, un antagoniste sélectif des récepteurs dopaminergiques de type D2 [2]. Récemment, dans une étude électrophysiologique in vitro sur tranches de cortex, nous avons montré dans le CPF que la dopamine a pour principal rôle d'exciter les interneurones GABAergiques [3]. Il pourrait s'agir là du mécanisme par lequel la dopamine inhibe la majorité des neurones du CPF in vivo. Nous avons donc entrepris l'étude des effets d'agonistes spécifiques des récepteurs dopaminergiques Dt et D2 sur la libération de 3H-GABA évoquée électriquement sur tranches de CPF. Dans le présent travail, nous montrons que la libération de 3H-GABA dans le cortex préfrontal est modulée par le système dopaminergique via les récepteurs D2 et non les récepteurs D,.
C. R. Acad. Sci. Paris, t. 309, Série III, p. 441-446, 1989 443
TECHNIQUES. — Les méthodes utilisées pour préparer les tranches et la mesure de la libération de 3H-GABA sont identiques à celles qui ont été décrites antérieurement ([3], [4]). En résumé, des tranches frontales, d'une épaisseur de 500 um ont été préparées à l'aide d'un vibratome (Campden Instruments, Londres, Grande-Bretagne). Elles sont ensuite redécoupées à l'aide de ciseaux fins afin d'isoler le cortex préfrontal médian [5]. Les tranches sont ensuite gardées pendant 1 h à température ordinaire dans une solution de Krebs. La composition de cette solution est la suivante : NaCl 118 mM; KC1 4,7 mM; CaCl2 1,3 mM; MgCl2 1,2 mM; NaH2PO4 1,0 mM; NaHCO3 25 mM; glucose 11 mM; EDTA-Na2 0,004 mM; acide ascorbique 0,11 mM et acide aminooxyacétique 0,2 mM. Ce milieu est oxygéné à l'aide d'un mélange 95 % 02/5 % C02. A 25°C, le pH de cette solution est de 7,4. Les tranches sont ensuite incubées en présence de 3H-GABA (2.10- 7 M, A.S. : 50 Ci/mmol) à 25°C pendant 20 mn. Après rinçage, elles sont introduites par groupes de cinq dans les chambres de superfusion. Dans ces chambres, elles sont posées sur un filet de nylon, entre les deux électrodes de platine situées aux extrémités de la chambre et distantes de 30 mm. Les tranches sont ensuite lavées avec une solution de Krebs maintenu à 25°C, à un débit de 1 ml/mn. Pendant les 60 premières minutes de rinçage, le superfusat est éliminé. Ensuite, il est collecté par fractions de 4 mn. La libération évoquée de 3H-GABA est provoquée par stimulation électrique. Des échelons rectangulaires sont délivrés par une source de voltage (Grass Instruments S44) que l'on règle de façon à obtenir une chute de potentiel de 4 V/cm ce qui correspond à une intensité de courant de 24 mA. Les échelons rectangulaires d'une durée de 3 ms sont délivrés à la fréquence de 5 Hz pendant une période de 2 mn. Deux périodes de stimulation (SI, S2) sont effectuées respectivement 64 mn et 96 mn après le début du rinçage. Sauf indication contraire, les drogues sont ajoutées dans le bain de perfusion 8 mn avant S2. A la fin de l'expérience, les tranches de tissu sont solubilisées par du Soluène. Le contenu en radioactivité des tranches et des fractions de superfusat est déterminé par comptage en scintillation liquide. La libération de 3H-GABA est mesurée par la fraction libérée, exprimée en pour cent du contenu tissulaire. Elle correspond au rapport du nombre de «Ci libérées contenues dans chaque fraction à la radioactivité totale présente dans le tissu au moment de la collection de cette même fraction. La libération de radioactivité induite par stimulation électrique correspond à la quantité de 3H-GABA libérée en plus de l'effux spontané, pendant la période qui suit la première et la seconde période de stimulation. L'effet des drogues sur la libération induite électriquement est mesurée par la valeur du rapport S2/S1 : rapport de la libération de 3H-GABA induite par S2 à celle induite par SI (exprimées en pour cent du contenu tissulaire). La libération spontanée de 3H-GABA est mesurée par la fraction libérée dans les 4 mn qui précèdent la première période de stimulation (Sp1) et la seconde période de stimulation (Sp2) et exprimées en pour cent du contenu tissulaire. L'effet des drogues sur la libération spontanée est déterminé par la valeur de Sp2/Sp1 : rapport entre Sp2 (le pourcentage de libération spontanée mesuré juste avant S2) et Spl (pourcentage de libération spontanée mesuré juste avant S1).
RÉSULTATS. — 1. Quand une solution de perfusion dépourvue de calcium est substituée à la solution normale 20 mn avant la seconde période de stimulation, la libération de 3H-GABA induite électriquement est diminuée de 62% (Krebs normal : S2/S1 =0,90 + 0,07, n=12; Krebs OCa++ : S2/S1 = 0,34+0,06, n=7;<0,001, test t de Student). La majeure partie de la libération de 3H-GABA induite par la stimulation électrique est donc dépendante de la présence de calcium.
444 C. R. Acad. Sci. Paris, t. 309, Série m, p. 441-446, 1989
Effets des agonistes et antagonistes dopaminergiques D1 et D2 sur la libération spontanée et induite électriquement de 3H-GABA dans des tranches de cortex préfrontal préalablement chargées. En ordonnées, S2/S1 est le rapport de la quantité de 3H-GABA libéré lors de la seconde période de stimulation à la quantité de 3HGABA libérée lors de la première stimulation. SI et S2 correspondent aux quantités respectives de 3HGABA libérées pendant la première (S1) et la deuxième (S2) période de stimulation électrique (5 Hz, 3 ms, 24 mA, pendant 2 mn) appliquées 64 et 96 mn après le début de la perfusion et exprimées en pour cent du contenu tissulaire. Le lisuride (10- 6 M), le RU 24926 (10- 7 M) et le SKF(10- 5 M) ont été ajoutés au milieu de superfusion 8 mn avant S2. Le sulpiride (10- 5 M) est ajouté 8 mn avant S2 et reste présent pendant toute la durée de l'expérience. Les valeurs correspondent à la moyenne ±SEM (n = 3 à 9 en présence de drogue, n = 45 pour le groupe témoin). *p>001 comparé au groupe témoin, +p<0,02 comparé au groupe où l'agoniste RU 24926 est seul présent, et NS comparé au groupe où le sulpiride est seul présent. + + p< 0,005 comparé au groupe où l'agoniste lisuride est seul présent, et p< 0,025 comparé au groupe où le sulpiride est seul présent (test t de Student).
Effects of Dt and D2 dopaminergic agonists and antagonist on the electrically evoked 3H-GABA release from preloaded prefrontal cortical slices. Ordinate: S2/S1 is the ratio of fractional release of 3H-GABA measured during the second period of stimulation (S2) to the fractional release measured during the first period of stimulation (SI). Each electrical stimulation (5 Hz, 3 ms, 24 m A) is applied during 2 min. The first and the second period began respectively 64 and 96 min. after the beginning of the superfusion. Lisuride (10- 3 M), RU 24926 (10- 7 M), and SKF 38393 (10- 5 M) were added to the superfusion medium, 8 min. before S2. Sulpiride (10- 5 M) was added 8 min. before S1 and was present ail over the rest of the experiment. Values are mean ±SEM (n = 3 to 9 for drug treated groups, n = 45 for control group). *p<0,001 when compared to control group. +p<0,02 when compared to RU 24926 alone and NS versus sulpiride alone. + +p<0,005 when compared to lisuride alone and p < 0,025 when compared to sulpiride alone, Student's t test.
2. L'étude du rôle des récepteurs D2 a été effectuée en utilisant deux agonistes spécifiques : le RU 24926 ([6], [7]) et le lisuride [8]. La libération de 3H-GABA induite électriquement est diminuée de 32% par 10- 7 M de RU 24926 et de 50% par 10- 6 M de lisuride (fig.) Des concentrations supérieures de RU24926 et de lisuride n'inhibent pas davantage la libération évoquée de 3H-GABA.
3. Le sulpiride (10- 5 M), un antagoniste spécifique des récepteurs D2 [9] est dépourvu d'effet propre sur la libération spontanée et évoquée de 3H-GABA. Néanmoins, à cette concentration, il abolit totalement (voir fig.) l'effet du RU 24926 (10- 7 M) et partiellement celui du lisuride (10- 5 M).
C. R. Acad. Sci. Paris, t. 309, Série III. p. 441-446, 1989 445
4. Le SKF 38393 (105 M), un agoniste sélectif des récepteurs D1 [10], demeure sans effet (fig.) sur la libération évoquée de 3H-GABA.
5. Aucun des agonistes et antagoniste Dx et D2 dopaminergiques utilisés n'a d'effet sur la libération spontanée de 3H-GABA, aux concentrations indiquées ci-dessus. En effet la valeur du rapport Sp2/Sp1 n'est changée par aucune de ces drogues (Test Anova), aux concentrations mentionnées dans la figure.
DISCUSSION. — Nos résultats montrent que dans des tranches de cortex préfrontal de rat, la libération électriquement induite de 3H-GABA est inhibée par les agonistes dopaminergiques D2. Cet effet est aboli totalement ou partiellement par l'antagoniste D2 sulpiride. Nos résultats constituent ainsi la première description d'une modulation dopaminergique de la libération de 3H-GABA dans le cortex préfrontal. Ils sont en accord avec une grande partie de ceux qui ont été décrits dans la substance noire et dans le noyau caudé. Dans la substance noire, une inhibition par les agonistes D2 de la libération de GABA induite in vitro par dépolarisation potassique a été mise en évidence [11]. Dans le noyau caudé, un phénomène similaire a été démontré lorsque la libération est induite électriquement [12]. Dans le striatum dorsal, la stimulation des récepteurs D2 inhibe in vivo la libération de 3H-GABA spontanée [13] ainsi que celle induite par une forte concentration de potassium extracellulaire [14]. Cette régulation n'a cependant pas toujours pu être retrouvée in vitro. Ainsi, la stimulation des récepteurs D2 est sans effet sur la libération évoquée par une forte concentration de potassium sur tranches de striatum de rat [15], ou sur la libération induite électriquement sur tranches de striatum de lapin [16]. Les résultats de notre étude ont permis de mettre en évidence dans le cortex préfrontal un effet inhibiteur de type D2 dopaminergique de la libération de 3H-GABA. Nous avions précédemment observé qu'à l'inverse, la superfusion de dopamine augmente la fréquence de décharge spontanée des interneurones GABAergiques [3]. Afin d'étudier cette apparente contradiction, des expériences en présence d'amphétamine (une drogue qui libère les catécholamines de leurs stocks intracellulaires) sont actuellement entreprises au laboratoire. Enfin, dans le cortex préfrontal, les récepteurs D2 responsables de la régulation par les neurones dopaminergiques de la libération de GABA ont encore une localisation cellulaire inconnue. La connaissance de leur localisation anatomique précise contribuera sans doute à l'élucidation du mécanisme de cette régulation.
Nos remerciements vont à M.-J. Besson pour les nombreuses discussions que nous avons eu au cours de ce travail et à F. Frédéric pour l'assistance technique qu'elle a apportée. Ce travail a été en partie financé par la D.R.E.T. (contrat n° 88/1313).
Note remise le 27 juillet 1989, acceptée le 1er août 1989.
RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES
[1] A. FERRON, A. M. THIERRY, C. LE DOUARIN et J. GLOWTNSKI, Brain Res., 302, 1984, p. 257-265.
[2] A. M. THIERRY, C. LE DOUARIN, J. PENIT, A. FERRON et J. GLOWTNSKI, Brain Res. Bull, 16, 1986, p. 155-160.
[3] J. PENIT-SORIA, E. AUDINAT et F. CREPEL, Brain Res., 425, 1987, p. 263-274.
[4] Y. MAURIN, S. ARBILLA et S. Z. LANGER, Eur. J. Pharmacol, 111, 1985, p. 37-48.
[5] A. J. MACLENNAN, M. A. PELLEYMOUNTER, S. ATMADJA, A. JACUBOVIC, S. F. MAIER et H. C. FIBIGER, Brain. Res., 477, 1978, p. 300-307.
[6] C. EUVRARD, J. PREMONT, C. OLERLANDER, J. R. BOISSIER et J. BOCKAERT, Naunyn-Schmiedeberg's Arch. PharmacoL, 309, 1979, p. 241-245.
[7] J. C. STOOF et J. W. KEBABIAN, Brain Res., 250, 1982, p. 263-270.
446 C. R. Acad. Sci. Paris, t. 309, Série III, p. 441-446, 1989
[8] D. B. CALNE, R. HOROWKSI, R. J. MCDONALD et W. WATTKE éd., Lisuride and other dopamine agonists, 1983, Raven Press, New York.
[9] P. SEEMAN, Pharmacol Rev., 32, 1980, p. 229-313.
[10] P. E. SETLER, H. M. SARAN, C. L. ZIRKLE et H. L. SAUNDERS, Eur. J. PharmacoL, 50, 1978, p. 419430.
[11] M. STARR, J. Neurochem., 49, 1987, p. 1042-1049.
[12] S. BERNATH, D. JACKSON et M. J. ZIGMOND, SOC. Neurosci. Abst., 1988, 46.18.
[13] J. A. GIRAULT, U. SPAMPINATO, J. GLOWINSKI, et M. J. BESSON, Neuroscience, 19, 1986, p. 1109-1117.
[14] J. C. STOOF, T. DE BOER, P. SMINIA et A. H. MULDER, Eur. J. PharmacoL, 84, 1982, p. 211-214.
[15] U. TOSSMAN et U. UNGERSTEDT, Eur. J. PharmacoL, 123, 1986, p. 295-298.
[16] N. LIMBERGER, L. SPATH et K. STARKE, J. Neurochem., 46, 1988, p. 1102-1108.
J. P.-S. et S. R. : Département de Neurophysiologie ontogénétique, Institut des Neurosciences,
Université Pierre-et-Marie-Curie, 9, quai Saint-Bernard, 75005 Paris;
Y. M. : Département de Neurochimie-Anatomie, Institut des Neurosciences,
Université Pierre-et-Marie-Curie, 9, quai Saint-Bernard, 75005 Paris.
C. R. Acad. Sci. Paris, t. 309, Série m, p. 447-452, 1989 447
Physiologie végétale/P/ant Physiology ( Moiysmologie/Molysmology)
Fixation et assimilation de 14C-formaldéhyde gazeux par des feuilles de tournesol
Françoise GIRARD, Pascale JOLIVET et Yves BELOT
Résumé — Les expériences d'incorporation de 14C-formaldéhyde atmosphérique dans les feuilles de tournesol (Helianthus annuus L.) ont montré que du formaldehyde se fixe sur les protéines insolubles des membranes cellulaires et sur les acides aminés libres, que ce composé est présent sous forme libre et qu'il est également métabolisé par l'intermédiaire d'un cycle de carboxylation particulier, au cours duquel du glycolate se forme.
Fixation and incorporation of atmospheric 14C-formaldehyde by sunflower leaves
Abstract — The study of atmospheric i4,C-formaldehyde incorporation in sunflower leaves (Helianthus anuus L.) has indicated that formaldehyde could bind on insoluble membrane proteins and on free amino acids, that there is free formaldehyde in the leaves and that this compound produces organic acids such as glycolate via a particular biochemical pathway.
Abridged English Version — Formaldehyde present in the atmosphere is produced by photochemical oxidation of atmospheric hydrocarbons ([1], [2]); it is also present in exhaust fumes of cars and industries. In rural sites, formaldehyde concentration reaches a few nm3.m- 3 in the air and a few mg.dm- 3 in the water of clouds and fogs [3]. Formaldehyde remains in the atmosphère during a relatively short time (5 to 10 days) because it is transformed into CO and washed down by rain. This compound is very soluble in water [4] and has a great chemical reactivity, so it is thought that it may be used by soil and plants. The work described here was to examine formaldehyde incorporation by sunflower leaves.
Sunflower plants (Helianthus annuus L. cv. Zebulon) were individually grown on vermiculite under the following conditions: nutrient solution for neutrophile plants [5], irradiance of 180 to 200 umol.m-2.s_ 1 during 14 hrs., temperature of 24°C during the day, 18°C at night, humidity 64%. Experiments were carried out with 3 to 4-week-old plants showing four foliar levels and a bud. 14C-formaldehyde exposition was realized with the apparatus shown in Figure. Nitrogen gas was bubbled (2.5 cm 3. s-l) into a 14C-formaldehyde solution (specifie activity 1.33 GBq.mmol- 1, C.E.N. Saclay) and was introduced into the main circuit before the chamber. The formaldehyde concentration in the air was 1 MBq.m- 3, i. e., 20 ug.m- 3. After an exposition of 3 hrs., the chamber was flushed by formaldehyde free air during 15 min. in experiment 1 (chase period) and 24 hrs. in experiment 2 to favour a metabolic process. Leaves were eut, weighed, dipped into liquid N2 and lyophilized. Organic matter was extracted by 50% aqueous EtOH according to [6]. Labelled compounds were separated by thin layer chromatography [7] and analyzed by autoradiography and liquid scintillation counting. Residues were acid hydrolyzed (5 cm 3 of 6N HC1 per 100 mg residue; 24 hrs., 110°C). Radioactivity of leaves and residues was determined by total combustion in an oxidizer.
14C-formaldehyde incorporation was more important in younger leaves (Table I); 35 to 45% of radioactivity was found in the extract; this ratio is slightly higher in the case of experiment 2 when there was a longer chase period. In the residues, 78% of the radioactivity
Note présentée par Alexis MOYSE.
0249-6313/89/03090447 $ 2.00 © Académie des Sciences
448 C. R. Acad. Sci. Paris, t. 309, Série m, p. 447-452, 1989
was acid hydrolyzed and was constituted of formaldehyde bound on membrane proteins. Indeed, formaldehyde has a great affinity for amine, hydroxyl, indol, sulfide... groups [8] and can be attached to proteins as methylol group. 22% radioactivity remaining after acid hydrolysis was constituted of the formaldehyde bound to insoluble compounds such as cellulose. In the extract, four sorts of compounds were labelled (Table II): unmoving metabolites (0 to 10% of radioactivity), free formaldehyde (1 to 10%), organic acids (6 to 12%) and amino acids (70 to 90%). In experiment 1, the radioactivity in the organic acids was mainly in glycolate (90%) and a little in glycerate; in experiment 2, the two organic acids were equally labelled as if there had been a redistribution of label during the chase period. The majority of radioactivity was in the amino acids, and it was verified that it consisted of compounds obtained by the addition of formaldehyde on free amino acids as suggested by Gautier et Piganiol [9]. In experiment 2, amino acid-bound-formaldehyde was liberated during the chase period so labeling decreased in amino acids and increased in free formaldehyde.
Our experiments were carried out with a formaldehyde concentration near that of a polluted atmosphere. In addition to formaldehyde attached to insoluble compounds and amino acids, there was a start of metabolisation of this compound into organic acids. In methylotrophic bacteria, formaldehyde is subjected to oxidation to C02 via the ribulose-monophosphate cycle [10]. In 1870, A. Von Baeyer suggested that formaldehyde is the first product of C02 photosynthetic assimilation [11], but the importance of this compound faded when experiments with 14C02 allowed the establishment of the Calvin cycle. However, in alfalfa, Nosticzius suggested that formaldehyde could produce glycolaldehyde used to form glycolate or phosphorylated sugars via transketolase activity [12]. In our experiments, glycolate was effectively 14C-labelled but no enrichment of phosphorylated sugars was observed. To test Nosticzius' hypothesis, experiments should be carried out with a longer time of incorporation and a higher formaldehyde concentration.
INTRODUCTION. — Le formaldehyde présent dans l'atmosphère provient principalement de l'oxydation photochimique des hydrocarbures atmosphériques ([1], [2]) ; c'est également un polluant d'origine artificielle présent dans les gaz d'échappement des voitures, dans les gaz de combustion de divers foyers industriels et dans les émissions de certaines industries chimiques. En atmosphère rurale, la concentration du formaldehyde dans l'air peut atteindre quelques nm 3. m -3 et sa concentration dans l'eau des nuages et des brouillards quelques mg. dm -3 [3]. Le temps de résidence du formaldehyde dans l'atmosphère est relativement court (5-10 jours), du fait de sa conversion en oxyde de carbone et de son transport au sol par les précipitations. La grande solubilité de ce composé dans l'eau [4] et sa réactivité chimique laissent penser qu'il pourrait être capté directement par le sol et les végétaux. L'objectif du présent travail est d'explorer les mécanismes d'incorporation du formaldehyde dans la matière organique des végétaux supérieurs.
MATÉRIEL ET MÉTHODES. — Matériel végétal. — Les plants de tournesol (Helianthus annuus L. cv. Zebulon) sont cultivés en pots individuels sur de la vermiculite et alimentés en solution nutritive pour plante neutrophile [5]. Les conditions de la chambre de culture sont les suivantes : éclairement de 180 à 200 umol.m-2.s_ 1 pendant 14 h, température de 24°C le jour et 18°C la nuit, humidité relative de 64%. Les expériences sont conduites sur des plantes âgées de 3 à 4 semaines, présentant un niveau cotylédonaire, trois niveaux foliaires et le bourgeon terminal d'où émerge un quatrième niveau foliaire.
C. R. Acad. Sci. Paris, t. 309, Série m, p. 447-452, 1989 449
Chambre expérimentale. — L'exposition au 14C-formaldéhyde est effectuée dans le dispositif en circuit ouvert représenté sur la figure. La partie aérienne de la plante est isolée dans une enceinte sphérique en verre de 4 dm 3 qui ne communique avec le compartiment racinaire que par l'intermédiaire de la tige. L'éclairement est fourni par une lampe à filament de tungstène (Hedler, 1000 W) qui dispense au niveau de la plante un éclairement d'environ 750 umol.m-2.s- 1. La température de la paroi de la chambre est maintenue constante par ruissellement d'eau. La chambre est balayée par un flux d'air de 55 cm3.s- 1 réglé en température et en humidité. L'air admis au contact de la plante est homogénéisé au moyen d'un microventilateur (Micronel AG type V361L, Suisse).
Production de l4C-formaldéhyde. — Le formaldehyde gazeux est obtenu en faisant passer un courant d'azote à faible débit (2,5 cm 3, s- 1) à travers une solution de 14Cformaldéhyde (activité spécifique 1,33 GBq.mmol- 1, C.E.N. Saclay) et injecté dans le circuit principal en amont de la chambre expérimentale. La radioactivité volumique de l'air, déterminée par piégeage du formaldehyde dans deux flacons laveurs montés en aval de la chambre et mesure par scintillation liquide, est d'environ 1 MBq.mT 3, soit une concentration pondérale massique de 20 ug • m - 3. La partie aérienne de la plante est exposée pendant 3 h au formaldehyde gazeux ainsi produit. Pour évacuer le formaldehyde présent dans l'enceinte, une circulation d'air est maintenue pendant 15 mn avant ouverture de la chambre. Dans le cas de l'expérience 2, cette circulation d'air a été maintenue 24 h afin de favoriser une métabolisation éventuelle du formaldehyde dans la plante. Puis les feuilles sont prélevées, pesées et plongées dans l'azote liquide.
Identification des composés marqués. — Le matériel végétal est lyophilisé avant broyage et extraction de la matière organique par de l'éthanol aqueux à 50% (v/v) [6]. Des fractions aliquotes d'extrait concentré sont utilisées pour la séparation bidimensionnelle des principaux métabolites libres des feuilles. Cette analyse consiste en une électrophorèse à haut voltage sur couche mince (cellulose 300) suivie d'une double chomatographie de partage selon le protocole de Schûrmann [7]. Les composés marqués sont repérés par autoradiographie, récupérés par grattage de la cellulose et leur radioactivité est mesurée par scintillation liquide (Tri-Carb 1500, Packard). Les résidus d'extraction sont soumis à une hydrolyse acide sous vide en présence d'HCl 6N pendant 24 h à 110°C (5 cm 3 d'HCl pour 100 mg de résidu sec). La radioactivité des feuilles avant extraction ou des résidus végétaux est déterminée par la combustion totale d'une fraction aliquote du matériel considéré (5 à 10 mg de matière sèche) dans un Oxymat IN 4101 (Intertechnique; rendement de combustion = 96 %).
RÉSULTATS ET DISCUSSION. — Incorporation du formaldehyde dans les feuilles. — La quantité de formaldehyde fixé par les feuilles dépend de leur niveau foliaire, les feuilles âgées (ft et f2) en incorporant moins que les suivantes (tableau I). La répartition de la radioactivité entre le résidu d'extraction et l'extrait varie suivant les feuilles et les expérimentations. Dans le cas de l'expérience 2, la période d'exposition de la plante au 14C-formaldéhyde a été suivie d'une longue période de chasse ce qui se traduit par une petite augmentation de la proportion de radioactivité contenue dans l'extrait hydroalcoolique. Après une hydrolyse acide du résidu, 78 % de la radioactivité passe en solution et proviendrait donc de la fixation du formaldehyde sur des molécules insolubles telles que les protéines membranaires. Le formaldehyde présente une forte affinité pour les groupements porteurs d'un atome d'hydrogène actif tels que les groupes aminé, hydroxyle,
450
C. R. Acad. Sci. Paris, t. 309, Série III, p. 447-452, 1989
indole, imidazole, guanidyle, sulfure et amide [8] et se fixerait sur les groupements latéraux des chaînes de protéines sous forme de méthylol. La radioactivité restant dans le résidu après l'hydrolyse acide correspondrait à une fixation du formaldehyde sur des composés insolubles peu ou pas hydrolysables tels que la cellulose.
Détermination des composés marqués dans Textrait hydroalcoolique. — Dans l'extrait, la radioactivité est principalement retrouvée dans quatre classes de composés (tableau II). Les substances qui ne se déplacent ni en électrophorèse ni en chromatographie sont faiblement représentées (moins de 10%). Un composé marqué se déplace uniquement en chromatographie jusqu'au front du solvant : c'est du formaldehyde libre. Un troisième groupe de composés marqués correspond aux acides organiques et plus précisément à du glycolate et du glycérate (6 à 12% de la radioactivité); dans la première expérience, le glycérate ne représente que 10% de la radioactivité des acides organiques; dans la deuxième, glycolate et glycérate contribuent chacun pour moitié au marquage observé comme s'il y avait transfert de la radioactivité du glycolate vers le glycérate au cours de la longue période de chasse. La majorité de la radioactivité (70-90%) se retrouve dans la zone des acides aminés et ces métabolites marqués ont une similitude de comportement (chromatographie, électophorèse, révélation chimique) avec des composés obtenus par combinaison de formaldehyde et d'acides aminés témoins. Dans ces expériences, il y aurait addition de 14C-formaldéhyde sur les acides aminés libres foliaires (alanine, glutamate, aspartate, glycine, serine et asparagine) selon le mécanisme proposé par Gautier et Piganiol [9]. La comparaison de l'expérience 2 et de l'expérience 1 montre que la radioactivité dans les acides aminés diminue significativement et que parallèlement on retrouve davantage de formaldehyde libre, comme s'il y avait libération du formaldehyde précédemment fixé aux acides aminés au cours de la période de chasse.
CONCLUSION. — Les expériences décrites ici ont été conduites dans des conditions de concentration atmosphérique en formaldehyde proches de celle d'une zone polluée, le
Dispositif expérimental pour l'incorporation de 14C-formaldéhyde par un plant de tournesol. (1) circuit principal d'air réglé en température et en humidité (55 cm3.s-1); (2) circuit d'injection du 14C-formaldéhyde par un courant d'azote (2,5 cm3.s-1); (3) barboteur contenant une solution diluée de 14C-formaldéhyde; (4) chambre à paroi de verre thermostatée (4 dm 3) avec homogénéisation de l'air au moyen d'un microventilateur; (5) hygromètre à point de rosée; (6) flacons laveurs permettant de déterminer la concentration du formaldehyde dans le courant d'air effluent.
Experimentai apparatus for 14C-formaldehyde incorporation by sunflower. (1) main circulating System of air regulated in temperature and moisture (55 cm 3. s- 1) ; (2) System of 14C-formaldehyde introduction with nitrogene gas (2.5 cm3.s-1); (3) bubbler with 14C-formaldehyde solution: (4) temperature regulated glass chamber (4 dm 3) with air ventilation; (5) dew point hygrometer; (6) water bubblers to determine the formaldehyde concentration in the circulating air.
C. R. Acad. Sci. Paris, t. 309, Série m, p. 447-452, 1989 451
TABLEAU I
Incorporation du formaldéhyde dans les feuilles des différents niveaux et proportion
de la radioactivité (RA) de l'extrait total retrouvée dans l'extrait hydroalcoolique.
Formaldehyde incorporation in différent leaves and percentage
of the total radioactivity (RA) recovered into alcoholic extract.
RA totale RA extrait hydroalcoolique
(Bq. mg- 1 MF) (% de RA totale)
Niveau foliaire Expérience 1 Expérience 2 Expérience 1 Expérience 2
f1 \ o,41 1,11 51,5
f2 ) 1,54 ) 42,1
f3 2,90 2,91 25,5 51,9
f4 5,11 2,95 22,7 39,6
BT 3,90 3,61 41,4 43,9
L'exposition au 14C-formaldéhyde (3 h) est suivie d'un balayage pendant 15 mn (expérience 1) ou 24 h (expérience 2). f1, f2, f3, f4 : 1er, 2e, 3e, 4e niveau foliaire; BT : bourgeon terminal. MF : matière fraîche.
1AC-formaldehyde exposition (3 hrs.) was followed with a chase-period of 15 min. (experiment 1) or 24 hrs. (experiment 2). f1 f2, f3, f4: Ist, 2nd, 3rd, 4th foliar level ; BT: upper bud. MF: fresh matter.
TABLEAU II
Répartition de la radioactivité entre les différents composés ou groupes
de composés marqués de l'extrait hydroalcoolique (% de la radioactivité totale de l'extrait).
Distribution of radioactivity between the different labeled compounds
in the extract (% of total extract radioactivity).
Formaldéhyde Acides
Dépôt libre organiques Acides aminés
foliaire Exp. 1 Exp. 2 Exp. 1 Exp. 2 Exp. 1 Exp. 2 Exp. 1 Exp. 2
f1 07 2,2 ) 6,2 \ 13,8 ) 70,9
f2 0, 7 10,0 l' 6 0,9 8' 6 5,4 86, 4 78,9
f3 0,8 3,9 1,5 7,0 8,6 5,5 86,5 79,0
f4 1,2 7,3 2,0 9,2 10,6 - 85,4 73,2
BT 0,0 4,7 1,0 9,3 3,6 11,1 95,5 58,6
L'exposition au 14C-formaldéhyde (3 h) est suivie d'un balayage pendant 15 mn (expérience 1) ou 24 h (expérience 2). f1 f2, f3, f4 : 1er, 2e, 3e, 4e niveau foliaire; BT : bourgeon terminal.
liC-formaldehyde exposition (3 hrs.) was followed with a chase-period of 15 min. (experiment 1) or 24 hrs. (experiment 2). f1, f2, f3, f4: lst, 2nd, 3rd, 4th foliar level; BT: upper bud.
but étant de connaître l'impact du formaldéhyde sur l'environnement. A côté du formaldehyde fixé sur les composés insolubles et sur les acides aminés libres, la présence d'acides organiques radioactifs indique l'existence d'un début de métabolisation du formaldéhyde. Chez les bactéries méthylotrophes, le formaldéhyde est oxydé en C02 au cours du cycle du ribulose-monophosphate [10]. A. Von Baeyer suggéra dès 1870 que le formaldehyde pourrait être le premier produit formé au cours de l'assimilation photosynthétique du C02 étant donné que ce composé avait le même état d'oxydation que les glucides et qu'il pouvait se condenser pour donner des hexoses [11]. Le rôle du formaldehyde comme premier intermédiaire a été occulté lorsque l'utilisation de 14C02 permit à Calvin, Benson et Bassham d'établir le cycle de fixation du C02. Cependant, chez la luzerne, Nosticzius a supposé que le formaldehyde peut être à l'origine de glycolaldéhyde qui donnerait du
452 C. R. Acad. Sci. Paris, t. 309, Série III, p. 447-452, 1989
glycolate ou participerait à la synthèse d'oses phosphorylés via l'action de la transcétolase [12]. Dans nos expériences, le glycolate est effectivement marqué et aucun enrichissement des esters phosphoriques des oses n'a été décelé. Afin de vérifier l'hypothèse de Nosticzius, il faudrait réaliser des expériences complémentaires avec une durée d'incorporation plus longue et éventuellement une concentration en formaldéhyde plus élevée.
Nous remercions M. P. Marini pour son aide précieuse à toutes les étapes de ce travail. Note remise le 3 juillet 1989, acceptée après révision le 4 août 1989.
RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES
[1] J. A. LOGAN, M. J. PRATHER, S. C. WOFSY et M. B. MCELROY, J. Geophys. Res., 86, 1981, p. 7210-7254.
[2] P. WARNECK, Chemistry of the Natural Atmosphere, International Geophysics Series, 41, R. DMOWSKA et J. R. HOLTON éd., Academic Press, London, 1988.
[3] D. GROSJEAN et B. WRIGHT, Atmospheric Environment, 17, 1983, p. 2093-2096.
[4] E. A. BETTERTON et M. R. HOFFMANN, Environ. Sci. Technol, 22, 1988, p.1415-1418.
[5] Y. Coïc et C. LESAINT, Rev. Hortic, 2316, 1973, p. 29-34.
[6] A. COUDRET et F. FERRON, Agronomie, 2, 1982, p. 429-436.
[7] P. SCHÛRMANN, J. Chromatogr., 39, 1969, p. 507-509.
[8] D. TOME et N. NAULET, Int. J. Peptide Protein Res., 17, 1981, p. 501-507.
[9] J. A. GAUTIER et P. PIGANIOL, Traité de Chimie organique, V. GRIGNARD, VII, 1950, Masson, Paris, p. 181-224.
[10] J. COLBY et L. J. ZATMAN, Biochem. J., 148, 1975, p. 513-520.
[11] I. ZELITCH, Photosynthesis, photorespiration and plant productivity, Academie Press, New York and London, 1971.
[12] A. NOSTICZIUS, Acta Agronomica Academiae Scientiarum Hungaricae, 25, 1976, p. 183-208.
F. G. et P. J. : Laboratoire de Chimie biologique,
Institut national agronomique, Centre de Grignon, 78850 Thiverval-Grignon ;
Y. B. : Service d'Études et de Recherches sur l' Environnement,
Centre d'Études nucléaires de Fontenay-aux-Roses, B.P. n° 6, 92265 Fontenay-aux-Roses Cedex.
C. R. Acad. Sci. Paris, t. 309, Série III, p. 453-458, 1989 453
Physiologie végétale/P/ant Physiology
Stimulation par les cytokinines de l'accumulation
d'alcaloïdes indoliques dans des suspensions cellulaires de
Catharanthus roseus G. Don.
Hippolyte KODJA, Di Liu, Jean-Michel MÉRILLON, Françoise ANDREU, Marc RIDEAU
et Jean-Claude CHÉNIEUX
Résumé — Les cytokinines stimulent l'accumulation de deux marqueurs alcaloïdiques (ajmalicine et serpentine) dans certaines souches tumorales de Catharanthus roseus. La réponse diffère selon la nature et la concentration de la cytokinine et selon la phase de la culture pendant laquelle les cellules sont traitées. Ces résultats sont discutés en fonction du fait que cette stimulation peut être inhibée par la nifédipine, la chlorpromazine ou, de façon précoce, par la cycloheximide. Une cascade d'événements déclenchée par la variation de concentration en Ca2+ cytoplasmique pourrait expliquer l'action des cytokinines.
Stimulation of indole alkaloid accumulation in suspension cell cultures of
Catharanthus roseus (G. Don.) by cytokinins
Abstract — Addition of cytokinins to culture media of tumorous cells of Catharanthus roseus stimulated the accumulation of two alkaloid markers (ajmalicine and serpentine). The response depended on the cell Une, the nature and concentration of the cytokinin and the growth phase at which the cells were treated. It was enhanced by using media with high-saccharose level. It was inhibited by nifedipine, chlorpromazine or cycloheximide. Variation in cytoplasmic Ca1+ concentration might start a cascade of events leading to an increase of alkaloid levels.
Abridged English Version — Indole alkaloid accumulation in plant cell cultures may be controlled by the components of the culture medium ([1]-[3]) or by inducers ([4], [5]) and elicitors [6]. We previously evaluated the alkaloid-accumulating capacities of Catharanthus roseus hormone-autotrophic cells ([7], [8]) and we found that cytokinins may affect the alkaloid level in these cells. This Note describes the cytokinin-stimulating effect on the formation of ajmalicine and serpentine in two tumorous cell lines and one normal cell line.
The tumor lines, designated CR 6 and CR 1 c [8], were established from separate crowngalls on the stems of C. roseus plandets infected with Agrobacterium tumefaciens (strain C 58587/A). Cell suspensions were subcultured every 15 days (dilution 1/10) in hormone-free B 5 medium [9] containing 58 mM saccharose. We also used a normal cell line (C20) provided by V. Pétiard (Francereco, Tours). The alkaloid-accumulating capacities of this line has been studied be several workers ([3], [7], [10]-[12]). The C20 cells were subcultured every 7 days (dilution 1/10) in B5 medium containing 58 mM saccharose 4.5 uM 2,4-dichlorophenoxy acetic acid (2,4-D) and 0.28 uM kinetin. Other media were used: "B5-50"=B5 medium with 148 mM saccharose; "MP", a production medium modified from [1] = "B550"+5uM benzyladenine (BAP) + 1 uM indolyl acetic acid (IAA) + 2.45 mM tryptophan (Trp). Ajmalicine and serpentine were dosed by spectrofluorometry [13] after alkaloidextraction by the EBN method described in [14]. In all cases, the alkaloids were intracellular and were only detected in trace amounts in the media.
Culture of tumorous cells CR 6 in MP for one passage resulted in an enhancement of the alkaloid level. Figure 1, A shows that BAP was responsible for this effect; increasing the saccharose concentration above that of B 5 medium resulted in higher alkaloid amounts; addition of Trp did not stimulate alkaloid level and even at 2.45 mM inhibited the BAP
Note présentée par Roger GAUTHERET. 0249-6313/89/03090453 $ 2.00 © Académie des Sciences
454 C. R. Acad. Sci. Paris, t. 309, Série III, p. 453-458, 1989
effect. Stimulation by BAP depends on the cell line: alkaloid level was not enhanced in another tumorous line (CR 1 c) grown in MP; this resuit resembles those obtained with other tumorous lines ([17], [18]). Stimulation also depends on cytokinin concentration: BAP was optimal at 5-10 uM. Other cytokinins were active: zeatin=BAP>kinetin = 6-(y, y-dimethylallyl amino) purine (Fig. 1, B).
CR6 cells became less sensitive to BAP as the cultures aged: greater alkaloid amounts were observed in the case of an earlier addition of BAP. Addition after 3 days of culture in "B 5-50" produced little enhancement of production (Fig. 2, A). In another experiment the cells cultured in a "B5-50" medium containing BAP were washed (saccharose 148 mM) and transferred to a BAP-free "B 5-50" medium at différent times of cultures: when the cells were transferred after 2 days of culture, BAP-alkaloid stimulation was of the same order of magnitude than for the control cells grown in "B 5-50" medium with BAP throughout the culture (results not shown). Stimulation by BAP was also observed when the cells were maintained for 2 days in a saccharose solution containing BAP, then grown in "B 5-50" without BAP (Fig. 2, B). BAP also enhanced the indole alkaloid production of the non tumorous C20 cells maintained in a growth-limiting culture medium (148 mM saccharose) for 14 days (Table).
Calcium has been implicated in various regulatory roles in plant cells, including cytokinininduced betacyanin accumulation in Amaranthus seedlings [15] and promotion of bud development on protonema of Pylaisiella selwynii (Kindb.) Steere and Anderson by zeatin [19]. cAMP had no effect on CR6 cells but we found that the anticalmodulin agent, chlorpromazine and the calcium channel blocker, nifedipine inhibited the BAP-stimulated production when added to the BAP-saccharose solution (Fig. 2, B). We think that cytokinins may regulate calcium concentration which in turn regulates a cascade of biochemical events leading to alkaloid biosynthesis in CR6 cells (including enzyme synthesis, as it was reported for kinetin-induced scopoletin in Tobacco cell cultures [16]). In fact, cycloheximide inhibited the action of BAP on alkaloid accumulation (Fig. 2, B). One of these events may be an activation of the terpenoid pathway: loganin and loganic acid which were not detectable in CR6 cells appeared in BAP-stimulated cells [P. Doireau, unpublished results].
Smith et al., [20] recently reported on the effect of absisic acid on indole alkaloid production in C. roseus cells. These results and those we obtained with CR6 cells show that phytohormones other than auxins, added at precise timing, may be of interest for controlling the secondary metabolite pathways in plant cell cultures.
INTRODUCTION. — La production d'alcaloïdes indoliques par des cellules cultivées in vitro peut être régulée par les divers constituants du milieu de culture ([1]-[3]) ou par l'emploi d'inducteurs ([4], [5]) et d'éliciteurs [6]. Au cours d'études entreprises pour estimer les capacités de production de cellules de Catharanthus roseus autotrophes aux substances de croissance ([7], [8]), nous avons observé que les cytokinines peuvent augmenter les teneurs en ajmalicine et serpentine de certaines souches tumorales. La Note décrit quelques modalités de cette action, retrouvée ensuite avec une souche non tumorale.
MATÉRIEL ET MÉTHODES. — Deux souches de cellules transformées (CR 6 et CR 1 c), établies à partir de deux galles développées sur des plantules infectées par Agrobacterium tumefaciens (C 58-587/A) ont été utilisées [8]. Les suspensions sont repiquées tous les 15 jours (dilution au 1/10) dans le milieu B5 de Gamborg et coll. [9] contenant du saccharose 58 mM et dépourvu de phytohormones. Nous avons aussi utilisé la souche
C. R. Acad. Sci. Paris, t. 309, Série III, p. 453-458, 1989 455
de cellules normales, C20, fournie par V. Pétiard (Francereco, Tours), et dont les capacités d'accumulation alcaloïdique ont été étudiées par plusieurs équipes ([3], [7], [10]-[12]). Cette souche est repiquée tous les 7 jours dans le même milieu que précédemment additionné d'acide dichloro-2,4 phenoxyacétique (2,4-D) 4,5 uM et de kinétine 0,28 uM. D'autres milieux ont aussi été utilisés : « B5-50 » = milieu B5 avec saccharose 148 mM; « MP », milieu de production dérivé de celui de Zenk et coll. [1] = « B 550 » + benzyladénine (BAP) 5 uM +acide indolyl-acétique (AIA) 1 uM + tryptophane (Trp) 2,45 mM. L'ajmalicine et la serpentine ont été dosées par spectrofluorimétrie [13] après extraction des alcaloïdes par la méthode EBN décrite dans [14]. Dans toutes les expériences réalisées, les alcaloïdes sont intracellulaires et n'existent qu'à l'état de traces dans les milieux.
RÉSULTATS. — La réponse des cellules tumorales au « milieu de production » MP a d'abord été étudiée. Les teneurs des deux marqueurs alcaloïdiques des cellules CR 1 c, cultivées dans ce milieu pendant un passage, ne sont pas modifiées mais celles des cellules CR 6 sont sensiblement accrues (surtout pour l'ajmalicine). La figure 1, A montre que la BAP est responsable de cette stimulation, laquelle est renforcée par une augmentation de la concentration en saccharose dans le milieu; l'AIA n'a pas d'effet; le Trp inhibe partiellement l'action de la BAP. Celle-ci agit de façon optimale à 5-10 uM. Elle n'active plus la production à 50 uM bien qu'à cette concentration la croissance (biomasse sèche) ne soit pas modifiée de façon significative. D'autres cytokinines peuvent être utilisées (fig. 1, B) : dans l'ordre d'activité décroissante, zéatine = BAP> kinétine = 6-( y, y diméthylallyl amino) purine.
La période pendant laquelle agit la cytokinine a été recherchée. Les cellules CR 6 ont été cultivées dans un milieu « B 5-50 » auquel on ajoute la BAP à différents moments : celle-ci n'est efficace que si elle est présente en début de culture (fig. 2, A). Dans une seconde expérience, les cellules ont été cultivées pendant des temps variables dans un milieu « B 5-50 » additionné de BAP, lavées rapidement (saccharose 148 mM) puis transférées dans le même milieu sans BAP : là encore un contact des cellules avec la cytokinine pendant les 2 premiers jours suffit pour stimuler les teneurs en ajmalicine et serpentine (résultats non montrés). Le même effet s'observe si les cellules sont conservées pendant 48 h dans une solution de saccharose et de BAP avant d'être transférées dans un milieu « B 5-50 » sans BAP. La nifédipine (bloquant des canaux calciques), la chlorpromazine (anti-calmoduline) ou la cycloheximide, ajoutée pendant le temps d'action de la BAP inhibe la stimulation due à celle-ci; l'AMPc n'exerce aucun effet (fig. 2, B). Aux concentrations utilisées, aucune de ces substances n'a d'action significative sur la croissance ultérieure des cellules.
L'action de la BAP a été retrouvée pour une souche non tumorale (C20) utilisée avec une technique différente : les cellules prélevées en début de phase stationnaire sont transférées dans une solution de saccharose 148 mM; elles accumulent des teneurs plus élevées en ajmalicine et serpentine quand on ajoute de la BAP (tableau).
DISCUSSION. — L'action des cytokinines sur le métabolisme secondaire a été moins étudiée que celle des auxines ([15], [16]). Les résultats rapportés dans cette Note montrent qu'elles peuvent augmenter les teneurs en deux alcaloïdes indoliques pris comme marqueurs. Cet effet se manifeste tant sur des cellules tumorales que non tumorales. Il est donc dissocié de l'action des cytokinines sur la croissance puisque les cellules CR6 sont autotrophes vis-à-vis de ces substances. Il dépend de la souche utilisée, ce qui peut
456 C. R. Acad. Sci. Paris, t. 309, Série III, p. 453-458, 1989
expliquer l'absence de réactions signalée par d'autres auteurs pour d'autres systèmes tumoraux ([17], [18]). La cinétique d'action de la BAP sur la teneur alcaloïdique des cellules CR 6, l'effet des inhibiteurs calciques pourraient indiquer que la cytokinine agit de façon précoce en régulant la concentration en calcium intracellulaire. Une action de ce type a été postulée pour les synthèses de bétacyanines induites par la kinétine dans des plantules d'Amaranthe [15] et pour le développement, induit par la zéatine, des bourgeons sur des protonémas de Pylaisiella selwynii (Kindb.) Steere et Anderson [19]. Contrairement à ce dernier exemple cependant, l'AMPc n'interviendrait pas dans l'action
Fig. 1. — Accumulation alcaloïdique (ug par g de matière sèche) des cellules CR6 cultivées pendant 21 jours dans différents milieux (la production d'ajmalicine, en milligrammes par litre de milieu, est donnée entre parenthèses). Les concentrations en hormones sont exprimées en uM; Trp : 2,45 mM. ajmalicine; serpentine; 6yy = 6-(Y, y-diméthylallyl amino) purine ; K = kinétine; Z = zéatine.
Fig. 1. — Alkaloid level (ug.g- 1 dry weight) in CR6 cells grown for 21 days in different media. Hormone concentrations are in \iM. Ajmalicine production (mg. T 1) is given into brackets; Trp: 2.45 mM.
Fig. 2. — Concentration en ajmalicine des cellules CR 6 cultivées dans le milieu « B 5-50 » sous différentes conditions. A, la BAP (5 uM) est ajoutée (f) à différents jours de la culture. B, les cellules sont précultivées (2 jours) dans une solution de saccharose 58 mM contenant les diverses substances indiquées [concentrations (uM)] puis transférées dans un milieu « B 5-50 ». Les résultats sont exprimés en pourcentage par rapport au témoin (T). Nf = nifédipine; Cp = chlorpromazine; CH = cycloheximide.
Fig. 2. — Ajmalicine concentration in CR 6 cells grown in "B 5-50" medium. A, BAP (5 uM) was added (]) at different days of culture. B, cells were precultured (2 days) in 58 mM saccharose solution supplemented with different substances (uM) then transferred into "B 5-50" medium. Results are expressed in percent of the control ((T).
C. R. Acad. Sci. Paris, t. 309, Série III, p. 453-458, 1989 457
TABLEAU
Influence de la BAP sur les teneurs en alcaloïdes des cellules C20. (Les teneurs sont exprimées en microgrammes par gramme de matière sèche; moyenne de trois fioles expérimentales + écart-type.) Les cellules prélevées en début de phase stationnaire (7e jour) sont entretenues pendant 14 jours dans une solution de saccharose 148 mM sans ou avec BAP (5 uM). La concentration cellulaire après transfert est de 180 g de matière fraîche par 1 de milieu.
BAP action on alkaloid level (ug.g- 1 dry weight) in C20 cells. (Three flasks per condition: mean + standard error.) The cells were grown for 7 days then transferred for 14 days in 148 mM saccharose without or with 5 uM BAP. The cell concentration was 180 g. fresh weight per l of medium after transfer.
Teneurs alcaloïdiques
Ajmalicine Serpentine
Jours 3 7 14 3 7 14
Saccharose 0 32 + 7 71+4 1±0,1 4 + 0,2 16+1
Saccharose + BAP. 39 288±61 349±3 3±1 21 ± 1 49±3
de la cytokinine. La modification de concentration en calcium déclencherait ensuite une cascade de réactions conduisant d'abord à des synthèses de protéines précoces qu'inhiberait la cycloheximide (au cours des 2 premiers jours de culture : fig. 2B), puis à des synthèses d'enzymes impliquées dans le métabolisme alcaloïdique. Hino et coll. [16] ont par exemple démontré la synthèse de novo de la phénylalanine-ammonia-lyase dans des cellules de Tabac stimulées par la kinétine, et qui accumulent alors de la scopolétine. Chez C. roseus, la voie des terpènes pourrait être une des étapes contrôlées : en effet, les cellules CR6 stimulées par la BAP accumulent de la loganine et de l'acide loganique alors que ces substances ne sont pas décelables dans les cellules non stimulées [P. Doireau, non publié]. Une partie d'entre elles pourrait être utilisée pour la synthèse des alcaloïdes. Smith et coll. [20] ont récemment montré que l'acide abscissique pouvait, sous certaines conditions, stimuler la production d'alcaloïdes indoliques. L'action rapportée ici pour les cytokinines montre l'intérêt d'étudier l'effet des hormones non auxiniques, apportées à des moments choisis du cycle de culture, pour une maîtrise des voies de biosynthèse des métabolites secondaires. Note remise le 24 avril 1989, acceptée après révision le 10 août 1989.
RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES
[1] H. M. ZENK, H. EL SHAGI, H. ARENS, J. STÔCKIGT, E. W. WEILER et B. DEUS, In H. M. ZENK., Plant tissue culture and its biotechnological application, Springer-Verlag, Berlin, 1977, p. 27-43.
[2] K.-H. KNOBLOCH et J. BERLIN, Z. Naturforsch., 35 c, 1980, p. 551-556.
[3] C. AMBID, J. P. ROUSTAN, C. NEF et J. FALLOT, In A. FUJIWARA, Plant Tissue Culture, J.A.P.C, Maruzen, Tokyo, 1982, p. 331-332.
[4] S.-L. LEE, K.-D. CHENG et A. I. SCOTT, Phytochem., 20, 1981, p. 1841-1843.
[5] J.-I. SMITH, N. J. SMART, M. MISAWA, W. G. W. KURZ, S. G. TALLEVI et F. Di COSMO, Plant Cell Rep., 6, 1987, p. 142-145.
[6] F. DI COSMO, A. QUESNEL, M. MISAWA et S. G. TALLEVI, Appl. Biochem. Biotechnol, 14, 1987, p. 101-106.
[7] J. M. MÉRILLON, K. RAMAWAT, F. ANDREU, J. C. CHÉNIEUX et M. RIDEAU, C. R. Acad. Sci. Paris, 303, série m, 1986, p. 689-692.
[8] H. KODJA, Évaluation des capacités de production alcaloïdique de diverses souches végétales transformées par Agrobacterium tumefaciens. Induction par les cytokinines de l'accumulation d'alcaloïdes indoliques dans une suspension de cellules tumorales de Catharanthus roseus, Thèse Doct. (Biophysicochimie et Biologie moléculaires et cellulaires), 1988, Tours, dactyl., 124 p.
C R., 1989, 2e Semestre (T. 309) Série III - 33
458 C. R. Acad. Sci. Paris, t. 309, Série III, p. 453-458, 1989
[9] O. L. GAMBORD, R. A. MILLER et K. OJIMA, Exp. Cell Res., 50, 1968, p. 151-158. [10] R. ENCISO-RODRIGUEZ, R. GOLDBERG et L. COSSON, C. R. Acad. Paris, 308, série III, 1989, p. 199-203. [11] F. MAJERUS et A. PAREILLEUX, Plant Cell. Resp., 1986, p. 302-305.
[12] J. P. RENAUDIN, S. C. BROWN, H. BARBIER-BRYGOO et J. GUERN, Physiol. Plantarum, 68, 1986, p. 695-703. [13] J. M. MÊRILLON, J. C. CHENlEUX et M. RIDEAU, Planta Med., 47, 1983, p. 169-176. [14] V. PÉTIARD, L. COSSON et D. COURTOIS, C. R. Acad. Sci. Paris, 294, série III, 1982, p. 123-126. [15] D. C. ELLIOTT, Plant Physiol, 72, 1983, p. 215-218.
[16] F. HINO, M. OKASAKI et Y. MIURA, Agr. Biol. Chem., 46, 1982, p. 2195-2202. [17] J. PAYNE, M. J. C. RHODES et R. J. ROBINS, Planta Med., 53, 1987, p. 367-372. [18] U. EILERT, V. DE LUCA, W. G. W. KURZ et F. CONSTABEL, Plant Cell Rep., 6, 1987, p. 271-274. [19] L. D. SPIESS, B. B. LIPPINCOTT et J. A. LIPPINCOTT, Am. J. Bot., 71, 1984, p. 1416-1423. [20] J. I. SMITH, M. J. SMART, W. G. W. KURZ et M. MISAWA, Planta Med., 53, 1987, p. 470-474.
Laboratoire de Biologie végétale, Faculté de Pharmacie, 37042 Tours Cedex.
C. R. Acad. Sci. Paris, t. 309, Série III, p. 459-464, 1989 459
Physiologie cellulaire végétale/Plant Cell Physiology
Étude cinétique de l'évolution des pH cytoplasmique
et vacuolaire après administration de piqûres
sur les cotylédons de Bidens pilosa L.
Patrick BONNIN, Michel GENDRAUD et Marie-Odile DESBIEZ
Résumé — Des piqûres cotylédonaires induisent à distance l'inhibition de la croissance de l'hypocotyle de Bidens pilosa L. Celle-ci ne s'exprime que lorsque les plantes ont été préalablement transférées sur un milieu pauvre en ions (ici de l'eau désionisée). Bien que les cotylédons ne subissent pas d'inhibition de croissance suite à l'application des piqûres, ils présentent 24 h plus tard un abaissement de leur pH cytoplasmique (pHc). Lorsque les piqûres provoquent une inhibition de la croissance des hypocotyles, le pHc de ces mêmes hypocotyles diminue de manière rapide et transitoire. Ceci pourrait correspondre à l'une des premières étapes de l'expression du message initié par les piqûres et transmis des cotylédons à l'hypocotyle.
Time course of the cytoplasmic and vacuolar pH following pricking the cotylédons
of Bidens pilosa L.
Abstract — Pricking the cotyledons of young Bidens pilosa L. plants induces the inhibition of the hypocotyl growth. This long-distance effect is observed when the plants have been transferred previously onto deionized water. Pricking the plant cotyledons does not affect their growth; however, this induces a decrease of the cytoplasmic pH of the cotyledonary cells, which is observed 24 hrs. after pricking. The cytoplasmic pH of the hypocotyl cells also decreases, but here, the modification is fast and transient; it occurs just after the cotyledonary prickings inhibit hypocotyl growth. This might correspond to one of the first step of the expression of a growth inhibition message induced by pricking the cotyledons.
Abridged English Version — It has been shown previously that delivering a few needle pricks to the cotyledons of a plantlet of Bidens pilosa reduces the growth of the hypocotyl but not that of the cotyledons ([1], [2]). The growth inhibition of the hypocotyl was observed when the plants were transferred, 1 day prior to performing the pricking treatment, from their standard nutrient medium (Cera III/10) onto deionized water [3]. When the plants were left on the basic (Cera 111/10) nutrient medium, there was no reduction of the hypocotyl growth; however when these plants were finally transferred onto deionized water, up to 2 days after delivering the pricks, the hypocotyl growth was immediately inhibited [3]. This means that the growth inhibition message induced by pricking the cotyledons can remain stored in the plants during at least 2 days. The transport of the message from the pricked cotyledon to the hypocotyl was fairly rapid [4]. It was estimated to be close to 1 cm.mn- 1.
Since cell growth in volves a membrane bound mechanism of H+-excretion and a transport of protons from cell to apoplast ([5] to [8]) we have studied the time course of the cytoplasmic and of the vacuolar pH's in the cotyledons (whether pricked or not) and in the hypocotyl, following the cotyledonary prickings.
Using the 14C-DM0 method as modified by Kurkdjian and Guern ([9] to [12]) using suspension cultures of Acer pseudoplatanus cells, and adapted to the Bidens cotyledons and hypocotyls, we have shown the following points.
— The cotyledons exhibit a decrease of the cytoplasmic pH, 24 hrs. after the prickings (Fig. 1, a, b). It cannot be excluded that this is merely associated to the healing of the cotyledons following the pricks.
Note présentée par Michel THELLIER. 0249-6313/89/03090459 S 2.00 © Académie des Sciences
460 C. R. Acad. Sci. Paris, t. 309, Série III, p. 459-464, 1989
— No change of the cytoplasmic pH of the hypocotyl was observed with the plants growing on nutrient medium (Cera 111/10) (Fig. 2, b). On the contrary, when the plants were transferred to deionized water, the cotyledonary prickings, within 0 to 190 min. after the pricks, induced a temporary and fast acidification (Fig. 2, a) followed, up to 24 hrs. later, by the restoration of the initial pH. In this case, the percentage of potassium in the hypocotyl is lowered (40%). This latter resuit agrees with these observed, (i) in Elodea leaves [16], potassium added to the basic standard medium induced an increase intracellular pH, (ii) in Bidens, prickings initiate intracellular K+ transports in the radial direction [17].
Using the cell sap extracted from frozen thawed tissues according to the procedure previously reported ([13], [14]) we have shown that, in all of the cases under study, the vacuolar pH remained unchanged. This resuit was in inagreement with previous observations: osmotic pressure was also unchanged after cotyledonary prickings (F. Chanteloube, internai report).
The fast and transient cytoplasmic pH variation of the hypocotyl, following the cotyledonary prickings is probably of greater interest than the absolute value of this pHc. It has been shown that the data obtained using the 14G-DMO technique were reliable when this method was adaptated to pH measurements in an organ of a whole plant ([11], [15], [16]). Ours results should be confirmed by 31PNMR technique.
As a conclusion the fast and transitory change of the cytoplasmic pH which affects only the hypocotyl is not the second messager in Bidens ([18] to [20]) that ellicits the depolarization wave after cotyledonary pricking. On the contrary, the cytoplasmic pH change controls the expression of the growth inhibition of the hypocotyl.
INTRODUCTION. — Des piqûres d'aiguilles faites sur les faisceaux médians des cotylédons induisent à distance l'inhibition de la croissance de l'hypocotyle de jeunes Bidens [1]. Cette inhibition, observée dans des conditions de nutrition minérale défavorables (milieu pauvre en ions), est faible ou nulle lorsque les plantes sont maintenues sur le milieu standard de culture [2]. Le message induit par les piqûres n'en est pas moins enregistré et stocké puisqu'il suffit de transporter les plantes sur un milieu pauvre en ions pour observer enfin l'inhibition de croissance [3]. La transmission de l'information est rapide : le message émis lors des piqûres cotylédonaires met moins de 1 mn pour atteindre les cellules cibles de l'hypocotyle ([2], [4]).
Sachant que la croissance cellulaire des plantes est liée à une excrétion de protons ([5] à [8]) et afin d'aborder le mécanisme de l'inhibition de la croissance de l'hypocotyle à la suite de piqûres cotylédonaires, nous avons étudié les modifications des pH cytoplasmique et vacuolaire des cotylédons et des hypocotyles.
MATÉRIEL ET MÉTHODES. — Les plantules de Bidens ont été cultivées selon la méthode déjà décrite ([1], [2], [3]) en jour court de 9 h, à 21°C, sous une énergie d'éclairement de 64 umol.m- 2. s- 1. 5 jours après l'imbibition des akènes (J5), les plantes ont été placées soit sur une solution nutritive Cera III de Homès diluée 10 fois, soit sur de l'eau désionisée. A J6, la moitié des plantes a reçu 4 « piqûres » sur chaque cotylédon, l'autre moitié servant de témoin.
Le pH intracellulaire (pH;) a été mesuré suivant la méthode mise au point par Kurkdjian et Guern [9] sur des cellules isolées d'Acer pseudoplatanus et adaptée aux cotylédons et hypocotyles de Bidens. La sonde utilisée est un acide faible radioactif la 5,5-dimethyloxazolidine-2,4-dione 2-14C (DMO, 0,2 G.Bq.mol-1). Les fragments d'hypocotyle de 1 cm de long (à partir du noeud cotylédonaire), ou les cotylédons, ont
C. R. Acad. Sci. Paris, t. 309, Série IN, p. 459-464, 1989 461
été incubés en présence de 50 Bq de DMO dans 250 ul de milieu Cera III dilué 10 fois ou d'eau désionisée (suivant la solution sur laquelle sont placées les plantes), à 21°C, à l'obscurité pendant 12 h, temps au bout duquel on a obtenu chez la Bidens l'équilibre de diffusion de la sonde. Le matériel végétal a été alors rapidement lavé, séché sur papier et soumis à une extraction hydroalcoolique [10]. L'inuline (3H) et le mannitol (3H) (sondes habituellement utilisées pour mesurer le volume extracellulaire) pénétrent rapidement dans les cellules de Bidens et n'ont pas pu être utilisés. Nous avons donc calculé ce volume à partir de coupes d'hypocotyle fixées [11] et observées au microscope électronique : il a été estimé à 11 % du volume des échantillons. Le pH; a été calculé à partir du rapport, à l'équilibre de diffusion, des concentrations intracellulaire (C,) et extracellulaire (Ce) de la DMO, en utilisant l'équation de Waddel et Butler [12] :
Pour les Bidens témoins, Ci/Ce est égal, à 2,38 + 0,05 à l'équilibre de diffusion. Les pHi et pHe sont respectivement les valeurs des pH intra- et extracellulaires. Le pHe, mesuré au pHmètre (électrode à cupule Tacussel TSP), est égal en fin d'incubation à 7,62 ± 0,08 lorsque le milieu d'incubation est du Cera III dilué 10 fois et 7,10+0,10 lorsqu'il est de l'eau désionisée. Ka étant la constante de dissociation de la DMO, le pKa est 6,3. Ci est donné par le rapport de la quantité de DMO intracellulaire, correction faite de sa métabolisation (16,4 + 1,2%), au volume intracellulaire déterminé à partir du volume total de tissus et du volume extracellulaire.
Le pH vacuolaire (pH„) a été mesuré, après extraction du suc vacuolaire par congélation-décongélation et centrifugation, à l'aide de l'électrode à cupule, selon la méthode de Kurkdjian et Guern ([13], [14]). Le volume de la vacuole représente en moyenne (tissus végétaux non homogènes) 83% du volume cellulaire. Le pHc a été calculé à partir du pH; et du pH„ en tenant compte du volume relatif du cytoplasme, k, qui a été estimé à 6% du volume des échantillons à partir de mesures faites sur des coupes d'hypocotyle observées au microscope électronique. Les résultats indiqués ont été obtenus à partir de 6 à 10 répétitions. Dans les figures 1 et 2 chaque valeur est donnée avec son écart-type.
RÉSULTATS. — Pendant les 10 premières minutes après le début de l'expérimentation, quelles que soient les conditions de culture, on observe une légère et passagère alcalinisation (inférieure à 0,07 unité pH) du pHc des cotylédons et des hypocotyles des plantes témoins qui n'ont pas subi de traumatismes cotylédonaires (fig. 1 et 2). Après piqûres cotylédonaires le pHc des cotylédons évolue à peu près de la même manière pour les plantes cultivées sur la solution de Cera III dilué 10 fois et pour celles placées depuis 24 h sur de l'eau désionisée. Rien ne se passe durant les 30 premières minutes qui suivent les traumatismes. Par contre, 24 h plus tard, on observe une forte acidification (respectivement de 0,24 et 0,33 unité pH par rapport aux plantes témoins) (fig. 1, a et b). Lorsque les plantes sont cultivées sur le milieu Cera III dilué 10 fois, le pHc des hypocotyles n'est pas modifié après les piqûres cotylédonaires. Par contre, lorsque les Bidens ont été transférées sur eau désionisée, on observe, immédiatement après les piqûres cotylédonaires, une diminution importante et rapide du pHc des hypocotyles (0,24 unité pH en 5 mn). Cette acidification est passagère : le pH,. réaugmente de 0,1 unité pH pendant les 5 mn suivantes. Cette réalcalinisation se poursuit, et 24 h plus tard, le pHc est redevenu voisin de celui observé sur des plantes témoins (fig. 2, a et b). Quel que soit le milieu de culture, qu'il s'agisse de plantes témoins ou traumatisées, et quel que soit l'organe étudié et le moment de la mesure (5, 10, 30 mn et 24 h après les piqûres
462
C. R. Acad. Sci. Paris, t. 309, Série in, p. 459-464, 1989
cotylédonaires), avec la méthode que nous avons utilisée nous n'avons pas observé de variation de pHv : il reste égal à 5,93 pour les cotylédons comme pour les hypocotyles. Le pouvoir tampon de la vacuole est très élevé, 220 mmole H+ l- 1 (unité pH)- 1 pour des variations de pH comprises entre 5,7 et 5,3.
DISCUSSION ET CONCLUSION. — La technique de la DMO, mise au point sur des cellules isolées ([9], [13]), puis adaptée à des tissus entiers, pour obtenir une estimation du pH intracellulaire (pHi) lorsque l'équilibre de diffusion est atteint, commence à être utilisée sur de nombreux végétaux ([14], [15], [16]). Vu l'hétérogénéité des tissus composants les organes isolés, un certain nombre de précautions doivent être prises lors de l'interprétation des résultats. Nous avons comparé le même organe (cotylédon, ou premier centimètre d'hypocotyle) chez des plantes témoins et des plantes traitées par des piqûres cotylédonaires. Les cotylédons peuvent être comparés car durant les 24 h étudiées leur croissance est identique. Pour les hypocotyles les plus importantes variations du pHc ont été observées lors des 10 premières minutes qui suivent le traitement. Il est raisonnable de penser que, durant cette courte période, les fragments restent comparables. L'hétérogénéité de ces tissus existe aussi au niveau cellulaire. La sonde radioactive se répartit entre les deux compartiments cellulaires les plus volumineux : le cytoplasme et la vacuole, en fonction de leurs pH respectifs. A l'équilibre de diffusion, les pH pariétal et extracellulaire sont estimés être égaux au pH de la solution d'incubation, car cette dernière a un faible pouvoir tampon.
En tenant compte de ces réserves, il faut insister sur le fait que le principal intérêt des résultats que nous venons de décrire est la variation rapide et passagère du pH cytoplasmique (ApHc des hypocotyles après les piqûres cotylédonaires, et non la valeur absolue de ce pH.
La faible alcalinisation, elle aussi passagère, du pHc des cotylédons et hypocotyles des plantes témoins peut être mentionnée puisque, bien qu'à la limite de la signification, elle a été obtenue lors de chaque manipulation. Des expériences complémentaires devront être faites afin de savoir s'il s'agit ou non d'un artéfact de manipulation.
Fig. 1. — Modifications du pH cytoplasmique des cotylédons, après piqûres cotylédonaires. •, plantes témoins; ▲ , plantes ayant reçu des piqûres cotylédonaires. a. Plantes ayant été transférées depuis 24 h sur de l'eau
désionisée. b. Plantes restant sur le milieu nutritif Cera III dilué 10 fois. Fig. 1. — Modifications of the cytoplasmic pH of the cotylédons after the cotyledonary prickings. •, controls;
, pricked plants, a. Plantlets transferred onto deionised water since 24 hrs. b. Plantlets remaining on the
Cera IlI/XO nutrient medium.
C. R. Acad. Sci. Paris, t. 309, Série m, p. 459-464, 1989
463
Ainsi, les cotylédons et les hypocotyles des plantes soumises à des piqûres cotylédonaires, présentent d'importantes modifications de pHc. Les cotylédons, qui ont été piqués, donc blessés, n'ont pas subi de modification de croissance. Ils ont présenté, 24 h plus tard, quel que soit le milieu de culture utilisé un abaissement de pH cytoplasmique. Cette réaction tardive ne correspond peut-être qu'à un processus de cicatrisation. Le pH cytoplasmique des hypocotyles n'a été sensiblement diminué que sur des fragments prélevés, dans les minutes qui suivent les piqûres cotylédonaires, sur des plantes maintenues sur de l'eau désionisée. Dans ce cas, la teneur en potassium de cette portion d'hypocotyle est de 40% plus faible que celle des hypocotyles des plantes cultivées sur du milieu Cera III dilué 10 fois (résultat non publié). Ce fait est en accord avec les résultats de Marré et coll. [16] qui ont montré, sur des feuilles d'Elodea, qu'un apport de K+ extracellulaire modifiait la régulation du pH intracellulaire. De plus, sur des Bidens plus âgés, après piqûres cotylédonaires, des migrations de potassium dans le sens transversal ont été mises en évidence par autoradiographie de 42K [17].
Le pH vacuolaire, avec la technique que nous avons utilisée, ne varie pas dans les cotylédons et hypocotyles de Bidens après piqûres cotylédonaires. Ces essais devront être confirmés par une autre technique. Celle utilisant une base faible, la nicotine marquée au 14C [14], n'a pu être utilisée, car, sur cette plante, le 14C a été rejeté en moins d'une heure sous forme de C02. Cette absence de variation de pH vacuolaire concorde cependant avec d'autres observations : le potentiel osmotique ne varie pas, dans des conditions expérimentales analogues, après piqûres cotylédonaires (F. Chanteloube, mémoire de D.E.A.). Des mesures de pH par la RMN 31P devront être faites pour étayer ces résultats.
Enfin, les modifications rapides et passagères de pH,., obtenues à distance de l'organe où a été émis le signal, pourraient faire penser à un messager secondaire ([18], [19], [20]) qui engendrerait, par ouverture des canaux potassiques, une dépolarisation membranaire : un potentiel d'action accompagné d'une onde à propagation lente (PA + OL) a été enregistré sur le parcours de l'information entre le cotylédon et l'hypocotyle [4]. Un tel rapprochement ne peut pas être fait car le message émis par les piqûres, puis transmis
Fig. 2. — Modifications du pH cytoplasmique des hypocotyles, après piqûres cotylédonaires. , plantes
témoins; plantes ayant reçu des piqûres cotylédonaires. a. Plantes ayant été transférées depuis 24 h sur
de l'eau désionisée. b. Plantes restant sur le milieu nutritif Cera III dilué 10 fois. Fig. 2. — Modifications of the cytoplasmic pH of the hypocotyls after the cotyledonary prickings. 0, controls;
, pricked plants, a. Plantlets transferred onto deionised water since 24 hrs. b. Plantlets remaining on the
Cera 111/10 nutrient medium.
464 C. R. Acad. Sci. Paris, t. 309, Série III, p. 459-464, 1989
des cotylédons à l'hypocotyle, (i) entraîne une variation rapide du pHc uniquement dans l'hypocotyle, (ii) peut être stocké « en mémoire » [3] pendant plusieurs heures ou jours, tant que les plantes sont maintenues sur le milieu Cera III dilué 10 fois, sans qu'aucune modification du pHc et de la croissance ne soit visible. Si par la suite on transfère les plantes sur de l'eau désionisée, on les appauvrit en potassium et le message peut alors être traduit par une inhibition de croissance. Ces arguments montrent que les variations de pHc des cellules en croissance de l'hypocotyle sont corrélées à l'expression du message et non à sa transmission ni à son stockage.
Note remise le 26 juin 1989, acceptée le 27 juillet 1989.
RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES
[1] M. O. DESBIEZ, N. BOYER et Th. GASPAR, Plant Physiol, 68, 1981, p. 41-43.
[2] M. O. DESBIEZ, P. CHAMPAGNAT, N. BOYER, J. M. FRACHISSE, Th. GASPAR et M. THELLIER, Bull. Soc. Bot. Fr., 130, 1983, p. 67-77.
[3] M. O. DESBIEZ, Th. GASPAR, D. CROUZILLAT, J. M. FRACHISSE et M. THELLIER, Plant Physiol. Biochem., 25, 1987, p. 137-143.
[4] J. M. FRACHISSE, Physiol Plant., 64, 1985, p. 48-52.
[5] R. E. CLELAND, Plant Physiol, 58, 1976, p. 210-213.
[6] E. VAN VOLKENBURGH et R. E. CLELAND, Planta, 148, 1980, p. 273-278.
[7] M. C. Cocucci et S. DALLA ROSA, Plant Physiol, 48, 1980, p. 302-306.
[8] H. GORING, W. BLEISS et H. KRETSCHMER, Biochem. Physiol Pflanzen., 173, 1978, p. 373-376.
[9] A. KURKDJIAN et J. GUERN, Plant Sci. Lett., 11, 1978, p. 337-344.
[10] T. G. JEFFORD et J. EDELMAN, J. Exp. Bot., 12, 1961, p. 177-187.
[11] M. TORT et M. GENDRAUD, C.R. Acad. Sci. Paris, 299, série III, 1984, p. 431-434. [12] W. J. WADDEL et T.C. BUTLER, J. Clin. Invest., 38, 1959, p. 720-729.
[13] A. KURKJIAN, J. F. MOROT-GAUDRY, S. WUILLEME, A. LAMANT, E. JOLIVET et J. GUERN, Plant Sci. Lett., 23, 1981, p. 233-243.
[14] A. KURKJIAN et J. GUERN, Plant Physiol, 67, 1981, p. 953-957.
[15] M. GENDRAUD, Physiol. vég., 15, 1981, p. 473-481.
[16] E. MARRE, N. BEFFOGNA et G. ROMANI, Bot. Acta, 101, 1988, p. 24-31.
[17] M. O. DESBIEZ et M. THELLIER, Physiol. vég., 16, 1978, p. 785-798.
[18] K. KOHLER, W. STEIGNER, J. KOLBOWSKI, U. P. HANSEN, W. SIMONIS et W. URBACH, Planta, 167, 1986, p. 66-75.
[19] W. STEIGNER, K. KOHLER, W. SIMONIS et W. URBACH, J. Exp. Bot., 39, 1988, p. 23-36.
[20] H. FELLE, Alan R. Liss Inc., p. 145-166.
Laboratoire de Phytomorphogenèse, U.R.A. n° 45, C.N.R.S., 4, rue Ledru, 63038 Clermont-Ferrand Cedex.
C. R. Acad. Sci. Paris, t. 309, Série III, p. 465-470, 1989 465
Nutrition des végétaux/P/ant Nutrition
Influence de l'activité rhizosphérique du pin maritime
(Pinus Pinaster Soland in Ait) sur les teneurs du sol en
cuivre soluble à l'eau
Etienne SAUR et Alain GOMEZ
Résumé — Le dosage par spectrophotométrie d'absorption atomique par électrothermie en four graphite permet de mesurer, dans les sols, de très faibles quantités de cuivre extractible à l'eau. Une corrélation positive a pu ainsi être établie entre la biodisponibilité du cuivre et sa solubilité dans l'eau; elle fait apparaître, pour cet élément, le rôle solubilisant d'une culture de pins conduite sur un sol sableux acide. Le même effet solubilisant est obtenu en faisant agir une solution d'exsudats racinaires sur trois sols de teneur variable en matière organique. Parmi sept acides organiques entrant dans la constitution des exsudats testés, les solutions d'acides tartrique, malique, oxalique et citrique sont celles qui possèdent le plus fort pouvoir solubilisant.
Effect of maritime pine rhizosphere on water soluble copper of the soil
Abstract — Water soluble copper was determined by electrothermic atomic absorption spectrophotometry. A correlation between soluble copper and its bioavailability for roots was shown. Copper solubility in acid sandy soils increased markedly with pine culture or root exudate solutions. Some organic acids (tartric, malic, oxalic and citric acids) known as existing in pine root exudates showed a similar effect on the soil copper.
Abridged English Version — Pine wood production is a very important economie resource in the Landes de Gascogne area (France) with 1,000,000 ha at the present time 95% being as Pinus pinaster Soland in Ait. This species grows on very poor sandy soil and could easily mobilize copper (near 200 g Cu/ha in a 16 year-old forest) in soils containing 0,8-2,4 mg/kg total copper [1]. The good adaptation of maritime pine with regard to copper nutrition is probably bound to rhizospheric activity. It has been suggested for many years that root exudates may affect metal speciation in the soil solution.
Root exudates are influential in increasing soil cation solubility by changing pH and redox conditions ([2], [3], [4]). It is commonly assumed that chelation by root exudates is a process making a significant contribution to trace element solubilization and acquisition ([5], [6], [7]).
The objectives of this study were to determine how pine root exudates would alter the total soluble fraction of copper.
Maritime pine was grown for 6 months on an acid sandy soil of Landes de Gascogne, under greenhouse conditions. The following six treatments: 0, 2, 4, 8, 16 and 32 mg Cu/kg soil DW, involving or not Pine crop, were replicated five times. Copper was analyzed in roots and soil solution [11], water soluble copper being determined by electrothermic atomic absorption spectrophotometry (modifier: HN03-palladium, perfected in our laboratory). Figure 2 shows a significant correlation [12] between soluble copper levels in soil and the root metal contents. Soluble copper could be considered a valuable indicator of copper bioavailability to the plant. Moreover, soluble copper is strongly correlated with total soil copper; the amounts of extractable copper were in a range of 0.9 to 2.2% of the total copper content. Further, it may be seen from Figure 1 that copper content is significantly higher in the soil solution of samples without plants. These data suggest that, in addition to microbial activity measured in the control, pine rhizosphere increases the mobility of copper.
Note présentée par André CAUDERON.
0249-6313/89/03090465 $ 2.00 © Académie des Sciences
466 C. R. Acad. Sci. Paris, t. 309, Série III, p. 465-470, 1989
In order to demonstrate the direct effect of pines on the copper solubility, root exudate solutions (100 mg C/l) were used as extracting reagent onto three different acid sandy soils [8] containing respectively 0.8, 3.7 and 9.3% DW organic matter (Table I). Soluble copper concentration was markedly increased by exudate solution compared to deionized water in the three soils. These data, obtained in a short time experiment (4 hrs.), testify to the effectiveness of soluble exudate on copper mobilization irrespective of microbial activity.
Exudate compositions were collected from previous literature [9], [10], and seven aminoacids known to existe in pine root exudates (Pinus radiata D. Don, P. lambertiana Dougl., P. banksiana Lamb., P. rigida Mill. et P. stobus L.) were used to assess their ability for copper mobilization. Table II shows a significant classification with regard to decreasing copper solubilizing power: citric acid>oxalic acid > malic acid = tartric acid>fumaric acid = succinic acid > acetic acid = water.
In conclusion, in addition to microbial activity and pH, the release of organic exudates by the maritime pine roots may modify the copper solubility and consequently the flow of nutrients in the rhizosphere. There is increasing evidence that soluble root exudates promote the solubility of copper, possibly as a sequence of the formation of soluble metal complexes. Soluble complexing agents could contribute to the copper movement by massflow and diffusion to plant roots.
In particular, amino-acids produced as root exudates will made a significant contribution to the total soluble copper occuring in the rhizosphere. Robert et al. [3] have already shown the rôle of these amino-acids in soil weathering and cation solubilization under temperate climate. The rise in exudate concentrations depending on the species may be important in order to obtain a sufficient supply of copper for the plants, explaining the good adaptation of maritime pine in poor sandy soils.
INTRODUCTION. — Le pin maritime est une espèce ligneuse très frugale colonisatrice d'espaces réputés infertiles, comme l'illustre l'exemple du massif forestier des Landes de Gascogne, caractérisé par des sables quartzeux d'une extrême pauvreté originelle en éléments nutritifs majeurs et mineurs. La capacité de cette plante à mobiliser le cuivre par exemple (près de 200 g/ha dans un peuplement de 16 ans) à partir de sols dont la pauvreté en cuivre total (0,8-2,4 mg/kg) est exceptionnelle [1] constitue probablement un facteur important d'adaptation lié à son activité rhizosphérique et donc aux phénomènes d'exsudation et de rhizodéposition.
Le rôle des exsudats racinaires solubles dans la nutrition minérale a en effet été reconnu par de nombreux auteurs. Ces composés interviennent, entre autres, sur le pH et les conditions redox de la solution rhizosphérique et tendent à augmenter la solubilité des cations ([2], [3], [4]). Mais il faut citer aussi la formation de complexes organo-métalliques, déterminante pour le maintien en solution et la biodisponibilité des métaux ([5], [6], [7]).
Notre objectif est de vérifier l'hypothèse d'une action solubilisante du système racinaire du pin, et plus précisément des exsudats solubles, sur le cuivre dans le cas des sols sableux acides.
MATÉRIEL ET MÉTHODES. — 1. Matériel. — Sols. — Nous avons utilisé trois sols sableux forestiers des Landes de Gascogne, constitués de plus de 85 % de sables grossiers quartzeux [8] :
— sol dunaire, matière organique =0,8%, cuivre total =0,8 mg/kg;
— lande sèche, matière organique =3,7%, cuivre total = 1,0 mg/kg;
C. R. Acad. Sci. Paris, t. 309, Série III, p. 465-470, 1989 467
— lande humide, matière organique =9,3%, cuivre total = 2,4 mg/kg.
Les pH des sols sont indiqués dans le tableau I.
Plante. — Toutes les cultures ont été réalisées avec Pinus pinaster Soland in Ait, provenance landaise (lot CEMAGREF standard).
Composés modèles. — Nous avons utilisé des solutions 10- 3 M d'acides acétique, succinique, fumarique, tartrique, malique, oxalique et citrique, préparées à partir de poudres purifiées et d'eau bipermutée et distillée.
2. Méthodes. — Expérience n° 1. — Des semis de Pin maritime ont été cultivés en serre, durant 6 mois, dans des conteneurs. On a utilisé un sol sableux de lande humide, enrichi par des doses croissantes de sulfate de cuivre équivalant à 2, 4, 8, 16 et 32 mg de Cu/kg de terre. A l'issue de la culture, les plantules ont été récoltées et leurs racines séparées puis soigneusement rincées à l'eau distillée. On a procédé immédiatement à l'extraction du cuivre hydro-soluble dans les sols qui ont reçu les mêmes Rapports mais ont porté ou non une culture de pins. Le cuivre a également été dosé dans les racines séchées et broyées.
Fig. 1. — Teneurs en cuivre soluble à l'eau en fonction des teneurs en cuivre total du sol en présence
et en l'absence d'une culture de pin. Les barres verticales indiquent deux écarts-types de la moyenne.
Fig. 1. — Soluble Copper levels to total soil Copper with or without pine.
Vertical bars represent 2 SE of the mean.
Fig. 2. — Corrélation entre les teneurs en cuivre soluble à l'eau du sol
et les teneurs en cuivre racinaire (r = 0,904).
Fig. 2. — Correlation between soluble Copper levels in soil and root Copper levels.
468 C. R. Acad. Sci. Paris, t. 309, Série III, p. 465-470, 1989
Expérience n° 2. — Le cuivre hydrosoluble a été extrait des trois sols. Les quantités de cuivre hydrosolubles ont été comparées à celles extraites, dans les mêmes conditions, par des solutions d'exsudats racinaires de plantules de Pin maritime obtenues par trempage des racines de 50 plantules dans 1 1 d'eau distillée durant 24 h; cette solution utilisée comme réactif d'extraction contenait 100 mg/1 de carbone organique après filtration à 0,45 um.
Expérience n° 3. — Le pouvoir d'extraction de l'eau et des solutions aqueuses d'exsudats racinaires a été comparé à celui des solutions des sept acides organiques identifiés dans des exsudats de Pinus radiata D. Don, P. lambertiana Dougl., P. banksiana Lamb., P. rigida Mill. et P. strobus L. ([9], [10]).
Extraction et analyse. — Le protocole suivant a été adopté lors de la mise en oeuvre de tous les réactifs d'extraction : agitation de 50 g de sol dans 100 ml de solution durant 4 h, puis filtration sur millipore de 0,45 um et mesure du pH des filtrats. En raison des très faibles quantités présentes, le cuivre des solutions a été dosé par spectrophotométrie d'absorption atomique par électrothermie en four graphite. La sensibilité de ce dosage a été améliorée par nos soins, en mettant en oeuvre un modificateur à base de palladium et d'acide nitrique : il se crée en effet dans ces conditions un oxyde mixte cuivre-palladium qui demeure stable jusqu'à la température d'atomisation (2300°C), permettant ainsi d'obtenir une absorption très intense. Le cuivre contenu dans les racines a été dosé par spectrophotométrie d'absorption atomique de flamme après calcination à 480°C et reprise des cendres par une solution d'acide chlorhydrique [11].
Les résultats présentés sont la moyenne de cinq répétitions et ont été analysés par un test de comparaison de moyennes [12].
RÉSULTATS. — 1. Comparaison des teneurs en cuivre hydrosoluble des sols ayant porté ou non une culture de pins. — L'extraction du cuivre à partir des sols directement prélevés dans les conteneurs permet d'obtenir une bonne représentation de la solubilité réelle du métal dans les conditions de la culture. La figure 1 montre une relation entre cuivre hydrosoluble et cuivre total du sol, où le cuivre hydrosoluble ne représente qu'une très faible fraction de la totalité du métal (0,9 à 2,2%) présent dans le sol non enrichi par le sulfate de cuivre. D'autre part, la quantité de cuivre extraite par l'eau dans les sols ayant porté la culture est très significativement supérieure à celle issue des conteneurs non cultivés. Le pH de toutes les solutions analysées étant identique (environ 4), les différences observées ne peuvent pas être imputées à des différences d'acidité. Ces résultats traduisent l'influence de la rhizosphere du végétal sur la solubilité du cuivre.
Il y a une corrélation significative au seuil de 5% (r—0,904, fig. 2) entre le cuivre contenu dans les racines et la fraction hydrosoluble du métal, qui apparaît donc comme un indicateur intéressant de sa biodisponibilité. Les masses de sol et les biomasses racinaires produites n'étant pas différentes dans les six traitements, ces constations sont transposables en termes de minéralomasses.
2. Extraction du cuivre dans trois sols différents par des exsudats de pin. — Le tableau I fait apparaître que la teneur en cuivre hydrosoluble est un bon reflet de la concentration en cuivre total puisqu'elle représente en moyenne 1 % de celle-ci. Par ailleurs, les solutions d'exsudats racinaires ont un pouvoir d'extraction très significativement supérieur (de 34% en moyenne) à celui de l'eau. Dans ce cas également, le pH des solutions d'extraction ne saurait expliquer les différences observées.
C. R. Acad. Sci. Paris, t. 309, Série III, p. 465-470, 1989 469
TABLEAU I
Effet de la solution d'exsudats racinaires sur les teneurs en cuivre soluble de trois sols sableux acides.
Effect of root exudate solution on soluble copper levels in three acide sandy soils.
Sable dunaire Lande sèche Lande humide
Moyenne Écart-type Moyenne Écart-type Moyenne Écart-type
Cu total (mg/kg) 0,8 0,1 1,0 0,1 2,4 0,2
Cu soluble :
-eau(ug/kg) 7,9 0,9 11,4 0,8 16,0 0,6
eau + exsudats (ug/kg) 11,6 0,6 15,1 0,8 21,0 1,3
pH eau 4,2 3,7 3,6
pH eau + exsudats 4,3 3,9 3,5
TABLEAU II Effet de sept solutions 10- 3 M d'acides organiques sur les teneurs en cuivre soluble du sol (g/kg).
Copper levels in the soil (ug/kg).
Solution 10- 3 M Moyenne Écart-type pH
Eau 15,8 a 0,3 3,8
Acide acétique 16,1a 0,5 3,7
Acide succinique 18,1 b 0,7 3,7
Acide fumarique 18,2b 0,7 3,5
Acide partique 20,3 c 0,5 3,5
Acide malique 21,5 c 0,3 3,7
Acide oxalique 24,5d 1,0 3,6
Acide citrique 27,2e 0,9 3,6
Deux valeurs affectées de la même lettre ne sont pas significativement différentes au seuil de 5 %.
Means followed by the same letter are not significantly different (p=0.05).
3. Efficacité solubilisante de plusieurs acides organiques vis-à-vis du cuivre contenu dans un sol. — Les solutions des sept acides expérimentés ont un pouvoir d'extraction très variable; par rapport à l'eau distillée, le classement de leur efficacité s'établit comme suit, avec un haut degré de signification statistique (5%) (fig. 4) : eau distillée = acide acétique < acide succinique = acide fumarique < acide tartrique = acide malique < acide oxalique < acide citrique. Pour tous les acides organiques, le pH final des solutions d'extraction est égal à 3,9.
DISCUSSION. — Ce travail met principalement en évidence l'action mobilisatrice, vis-àvis du cuivre, des produits rhizosphériques solubles de racines de plantules de Pin maritime; elle contribue à l'augmentation de la teneur en cuivre hydrosoluble du sol qui a porté pendant 6 mois cette culture, en présence de la microflore naturelle du sol. Le pouvoir solubilisant des exsudats en solution aqueuse est vérifié par le supplément d'extraction de cuivre observé quand on les met en contact, même un temps court, avec différents types de sol.
Il existe de fortes présomptions pour attribuer ce pouvoir solubilisateur très particulier à des acides aliphatiques contenus dans la solution d'exsudats. L'expérimentation a montré en particulier le pouvoir solubilisateur prononcé des acides citrique, oxalique, malique et tartrique sur le cuivre complexé par la phase solide du sol. Robert et coll. [13] ont déjà montré par de nombreux travaux le rôle déterminant de ces acides en régions tempérées et froides sur l'altération des sols et la solubilisation des cations.
470 C. R. Acad. Sci. Paris, t. 309, Série III, p. 465-470, 1989
Ces données apportent des éléments nouveaux par rapport aux résultats de Nielsen [6] qui a montré l'augmentation des teneurs en cuivre extrait avec une solution de NaOH 0,5 M et des agents complexants organiques en présence d'une culture d'orge, dans un sol tourbeux calcaire. D'une part, nous avons évité le biais possible engendré par la relative agressivité de l'extractant dans l'estimation du cuivre soluble du sol en remplaçant la solution de soude par de l'eau distillée et en contrôlant le pH des solutions. D'autre part, nous avons mis en évidence le rôle direct des composés organiques d'origine végétale dans la solubilisation du cuivre qui, dans le phénomène observé, vient en renfort de l'activité microbienne du sol. Note remise le le 17 avril 1989, acceptée après révision le 4 août 1989.
RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES
[1] H. AUBERT et M. PINTA, Travaux et documents de ro.R.S.T.O.M., 1971, p. 104. [2] W. K. GARDNER et D. G. PARBERY, Plant Soil, 68, 1982, p. 19-32.
[3] V. RÔMHELD et H. MARSCHNER, Plant Physiol, 71, 1983, p. 949-954. [4] C. LEYVAL, et J. BERTHELIN, Rev. Ecol. Biol. Sol, 29, 1983, p. 191-206.
[5] W. L. LlNDSAY, The role of chelation in micronutrient availability in "The plant root and its environment". Carson, Univ. Press. Virgina, 1974, p. 412. [6] E. NIELSEN, Plant Soil, 45, 1976, p. 679-687.
[7] M. MENCH, J. L. MOREL et A. GUCKERT, J. Soil Sci., 39, 1988, p. 521-527. [8] E. SAUR, Agronomie, accepté.
[9] V. SLANKIS, V. C. RUNECKLES et GKOTKOV, Physiol. Plant., 17, 1964, p. 301-313. [10] W. H. SMITH, For. Sci., 15, 1969, p. 138-143.
[11] E. SAUR, Ann. Sci. For., 2, 1989 (sous presse).
[12] J. BACHACOU, J. P. MASSON et C. MILLIER, Serv. Doc. I.N.R.A., 1981, p. 561.
[13] M. ROBERT, M. K. RAZZAGHE, M. A. VINCENTE et G. VENEAU, Sci. Sol, 2, 1979, p. 153-174.
I.N.R.A., Station d'Agronomie, Centre de Recherches de Bordeaux, B.P. n° 131, 33140 Pont-de-La-Maye.
COMPTES RENDUS DE L'ACADÉMIE DES SCIENCES
23, quai de Conti. 75006 Paris. Tél. (1) 43.26.66.21 ; Télex 206521 F; Télécopie(1) 43.54.63.99.
INSTRUCTIONS AUX AUTEURS
Langue et présentation
Le français est la langue normalement utilisée dans les Comptes rendus. La rédaction doit être claire, accessible au plus grand nombre de spécialistes et bien mettre en évidence l'originalité du résultat (*).
La Note rédigée en français doit tenir dans quatre pages imprimées (figures et tableaux compris).
Toutefois les Notes bilingues contenant une version abrégée en anglais d'une page imprimée au moins, de deux pages au plus, et faisant appel aux figures, tableaux et références bibliographiques, peuvent atteindre une longueur maximale de 6 pages (figures et tableaux compris).
Les auteurs étrangers peuvent présenter une Note rédigée en anglais (ou éventuellement et sur demande spéciale dans une langue usant de caractères latins), à condition de l'accompagner d'une version abrégée en français d'une page imprimée au moins et faisant appel aux figures, tableaux et références bibliographiques. Les Notes répondant à cette règle peuvent atteindre une longueur totale de 6 pages (figures et tableaux compris).
En cas de nécessité, et avec l'autorisation d'un des Secrétaires perpétuels, une ou deux pages de figures hors texte peuvent être ajoutées à la Note. Ces planches sont à la charge des auteurs, qui doivent soumettre une mise en page prête à l'impression.
Comité de Lecture
Les Secrétaires perpétuels sont responsables de la publication des Comptes rendus. Ils sont assistés d'un Comité de lecture qui peut suggérer de recueillir l'avis de spécialistes. Ils peuvent ainsi être conduits à demander aux auteurs d'apporter certaines modifications à leur texte initial. Ils décident en dernier ressort de l'acceptation des Notes. La date de remise du manuscrit, et celle de son acceptation définitive ne varietur, sont indiquées à la fin du texte imprimé.
Composition d'une Note
Une Note aux Comptes rendus comprend normalement et dans l'ordre :
1. la rubrique sous laquelle elle est publiée (**), en français et en anglais (éventuellement une deuxième rubrique peut être ajoutée);
2. le titre en français;
3. les noms des auteurs précédés de leur prénom;
4. un court résumé en français;
5. le titre et un court résumé en anglais;
6. éventuellement une « version abrégée » en anglais;
7. le texte de la Note;
8. les légendes des tableaux et des figures en français et en anglais;
9. la liste des références numérotées dans 1 ordre ou elles sont citées dans le texte, chacune donnant auteur(s) (initiales des prénoms, et nom), titre de la revue, tome, année, première et dernière page de référence (et, pour les Notes de la série I, titre complet de l'article);
10. l'adresse postale et le numéro de téléphone des auteurs ou des Laboratoires;
11. le nom, l'adresse, les numéros de téléphone, télex et télécopie de la personne qui doit corriger les épreuves.
Les auteurs étrangers écrivant le texte de la Note (cf. 7) en anglais ou dans leur langue, joignent une version abrégée en Français (cf. 6) et des légendes pour tableaux et figures rédigées en français (cf. 8).
Caractéristiques techniques
Les Notes sont obligatoirement dactylographiées en double interligne (texte, résumés, légendes, etc.) et adressées en deux exemplaires.
Une page imprimée des Comptes rendus compte 47 lignes de 85 caractères, signes ou espaces. Les résumés sont imprimés en petits caractères (95 caractères ou espaces par ligne). Les titres, résumés, tableaux, figures et bibliographie doivent tenir dans le nombre de pages indiqué.
— Fournir les originaux des figures avec des lettres ou des chiffres de dimension suffisante pour permettre la réduction. Ne pas donner de documents dépassant le format 21 x 30 cm.
— Utiliser les unités internationales (**).
— Présenter clairement les équations mathématiques (dactylographiées si possible) en particulier exposants et indices.
— Indiquer dans la marge ou dans une liste les symboles non usuels et si nécessaire consigner les directives et explications pour l'Imprimeur sur un feuillet séparé, attaché au manuscrit.
— Ne pas commencer une phrase par une formule mathématique.
— Les Notes de « bas de page » sont à éviter dans la mesure du possible; elles seront numérotées séparément des références et figureront à la fin du texte avant la bibliographie.
Correction des Épreuves
Les corrections sur épreuves ne peuvent être que d'ordre typographique. Les épreuves corrigées doivent être retournées par retour du courrier avec le manuscrit à l'Académie des Sciences (Service des Comptes rendus, 23, quai de Conti, 75006 Paris).
Tirages à part
Chaque Note donne lieu à 25 exemplaires de tirages à part gratuits pour les auteurs. Ceux-ci pourront en acquérir un plus grand nombre, à leurs frais, à condition d'envoyer la commande en même temps que le renvoi des épreuves corrigées.
(*) Il n'est parfois pas possible, en raison de la concision exigée, de donner les démonstrations ou les preuves complètes du résultat énoncé, spécialement dans la série I; il est alors recommandé de joindre à l'appui de la Note un texte, si possible dactylographié, explicitant les compléments nécessaires à une bonne compréhension qui facilite l'examen de la Note par le présentateur et qui sera conservé cinq ans dans les Archives de l'Académie pour pouvoir être communiqué à tout lecteur des Comptes rendus qui en fait la demande. Il est alors fait mention au bas de la Note de l'existence de ce document par la formule suivante : « Résumé d'un texte qui sera conservé cinq ans dans les Archives de l'Académie et dont copie peut être obtenue. »
(**) La liste des rubriques ainsi que des tableaux d'unités internationales sont donnés dans le premier numéro de chaque tome.
COMPTES RENDUS DE L'ACADÉMIE DES SCIENCES
23. quai de Conti. 75006 Paris (France). Tel. (33.1)43.26.66.21 ; Telex 206521 F; Telefax (33.1) 43.54.63.99.
INSTRUCTIONS TO AUTHORS
A Note in the Comptes rendus is the first report of an important discovery or a significant new resuit. It is rapidly published. It must be submitted by a Member, a Foreign Associate or a Corresponding Member of the Academy. Languages used and presentation
Notes for the Comptes rendus are usually published in French. They must be clear, within the comprehension of the majority of specialists and distinctly highlight the originalîty of the results (* ).
The French text must not exceed 4 pages in length, including tables and figures.
However, a "Note" may be bilingual and include an "Abridged English Version" of at least one but not more than two printed pages, which refers to the figures, tables and bibliographical entries. In this case, the total length including, figures and tables etc. may extend to 6 pages.
Foreign authors may submit a "Note" written in English (other languages using latin characters may be accepted upon request), on condition that they include an Abridged French Version of at least one page, which refers to the figures, tables and bibliographical entries. In this case, the total length of the Note (including title, figures, tables, etc.) may extend to 6 printed pages.
If necessary, and with the authorization of one of the Permanent Secretaries of the Academy, one or two additional pages of figures may be added to the "Note". These additional plates must be submitted with a final layout and are published at the authors' expense.
Advisory Board
The Permanent Secretaries are responsible for the publication of the Comptes rendus. They are assisted by an Advisory Board which may suggest to refer to specialists in the field and may also request that the author(s) amend their initial text. They make the final decision regarding acceptance of the "Note". The date on which the manuscript is submitted and the date of its final acceptance ne varietur are indicated at the end of the printed text.
Contents of the "Note"
As a rule each "Note" should include the following items:
1. the heading denoting, in French and English, the scientific field under which it is to be published (**) (where applicable, a second heading for cross-reference in the tables of contents may be given);
2. the title in French;
3. the first names, followed by the surname, of the author(s);
4. a short Abstract in French (called "Résumé");
5. the title and a short Abstract in English;
6. if desired, an Abridged English Version;
7. the text of the "Note";
8. the captions for the tables and figures in both French and English;
9. a numbered list of references in the order cited in the text. Each reference is to show the author(s)' first initial and surname, title of the review, volume, year, first and last pages of the article (for "Notes" in Series I, the complete title of the article should also be given);
10. the mailing address and phone number, of the author(s) or Laboratories;
11. the name, address, phone, telex and telefax number of the person to whom the texts are to be sent for proof-reading.
Foreign authors who write their "Note" in English (or in another language) (§ 7 above), must include an Abridged Version in French (substituted for § 6 above) and captions for tables and figures in French, as indicated in § 8 above.
Technical Requirements
A "Note" must be typed, double-spaced and submitted in two copies.
A printed page for the Comptes rendus consists of 47 lines of 85 Ietters, symbols or spaces. The Abstract and Résumé are printed in small letters (95 letters or spaces per line). Titles, abstracts, tables, figures captions and bibliographie entries must be included in the total number of pages allowed.
— The originals of the figures must be submitted with letters and numbers large enough to allow for reduction. No document should exceed 21 x 30 cm.
— Internationally accepted units should be used (**).
— Mathematical equations must be clearly written (typed if possible), especially sub- and superscripts.
— The meaning of uncommon symbols should be specified in the margin or on a separate list. Special instructions and explanations for the printer are to be noted on a separate sheet attached to the manuscript.
— No sentence may begin with a mathematical formula.
— Footnotes are to be avoided. However, if they must be used, they should be numbered differently from the references and will appear at the end of the text, before the bibliography.
Proof-reading
Only typographie corrections may be made on the proofs. Corrbcted proofs should be sent to the Academy of Sciences by return mail, along with the manuscript (Service of the Comptes rendus, 23, quai de Conti, 75006 Paris).
Reprints
Twenty-five reprints will be sent to the author(s) free of charge. Additional copies may be obtained, at the author's expense, provided an order is included when the corrected proofs are returned to the printer.
(*) Due to the brevity required, it may not always be possible to include all the conclusive experiments or the complete proof of the results obtained, especially in Series I. Therefore, we recommend that a text, typed if possible, be enclosed in support of the "Note", providing the supplementary information needed for a thorough understanding, in order that the submitting Member might easily examine the "Note". This document will be kept at the Academy for five years so that, on request, any Comptes rendus reader may have access to it. In this case, a footnote will appear at the end of the "Note"stating "this the succinct version of a text on file for five years in the Academy Archives. Copy available upon request."
(**) The list of Headings and tables of international units appear in the first issue of each Volume.
COMPTES RENDUS DE L'ACADÉMIE DES SCIENCES
Series I: Mathematics ; Series II : Mechanics, Physics, Chemistry, Earth Sciences, Space Sciences ; Series III : Life Sciences.
Subscription Rates. Foreign Countries 1989 Vol. 308+309-40 numéros
One series 3 450 F
Two series 6210 F
Three series (I, II, III) 7770 F
For foreign countries, subscription rates include surface mail charges. For faster delivery, please mark your order "Air Mail charges invoiced in addition". For 1989, all subscribers receive a free service of Série générale "La Vie des Sciences".
La Vie des Sciences : Institution 490 FF/Individual 294 FF
Subscriptions should be sent to : C.D.R., Centrale des Revues, 11, rue Gossin, 92543 Montrouge Cedex, France •
Spécimen copy on request
COMPTES RENDUS
DE L'ACADÉMIE DES SCIENCES
, SCIENCES DE LAVIE
1989 — Tome 309 — Série III — n° 10
Biologie théorique
La maximisation du plaisir, réponse à un conflit de
motivations. Michel CABANAC 397
Biologie moléculaire
Identification nucléotidique et modèle cinétique d'une délétion hétéroplasmique de 4 666 paires de bases de l'ADN mitochondrial dans le syndrome de KearnsSayre. Isabelle NELSON, LUC d'AURIOL, Francis GALIBERT, Gérard PONSOT et Patrick LESTIENNE. . . 403
Biochimie générale
Sur l'hydroxylation du carbone-1' du déoxyribose comme mécanisme de coupure du poly(dA) par une porphyrine de manganèse associée au monopersulfate de potassium. Jean BERNADOU, Brigitte LAURETTA, Geneviève PRATVIEL et Bernard MEUNIER 409
Cancérologie
Modification des concentrations relatives des groupements méthyle et méthylène plasmatiques dans la pathologie cancéreuse : une étude par spectroscopie RMN du proton. Jean VION-DURY, Martine SCIAKY, Sylviane CONFORT-GOUNY, Mostafa KRIAT, Roger FAVRE, François GRISOLI, Jean-Robert HARLÉ, Eric FONTANARAVA, Maurice MONGIN, Yves CARCASSONNE et Patrick COZZONE 415
Évolution
Démonstration de l'origine indépendante des ventouses digitales dans deux lignées phylogénétiques de Ranidae (Amphibiens, Anoures). Annemarie OHLER et Alain DUBOIS 419
Ecologie générale
Accroissements en surface terrière dans des forêts semi-caducifoliées de Côte-d'Ivoire. Jean-Louis DEVINEAU 423
Molysmologie
(voir tome 309, série III, 1989, p. 447)
Contents with English abstracts I-III
Cytologie animale
Détection ultrastructurale d'ARN ribosomal par hybridation in situ à l'aide d'une sonde biotinylée sur coupes ultrafines de cellule animale en culture. Françoise ESCAIG-HAYE, Vladimir GRIGORIEV et Jean-Guy FOURNIER 429
Endocrinologie
Prolactine et liaison spécifique de testosterone dans les cellules de vésicule séminale de Gobius niger L. en culture. Jean-Pierre BONNIN 435
Neurobiologie
Effets de la stimulation des récepteurs Dj et D2 dopaminergiques sur la libération d'acide y-[3H] aminobutyrique induite électriquement dans le cortex préfrontal du rat. Jacqueline PENIT-SORIA, Sylvie RETAUX et Yves MAURIN 441
Physiologie végétale
Fixation et assimilation de 14C-formaldéhyde gazeux par des feuilles de tournesol. Françoise GIRARD, Pascale JOLIVET et Yves BELOT 447
Stimulation par les cytokinines de l'accumulation d'alcaloïdes indoliques dans des suspensions cellulaires de Catharanthus roseus G. Don. Hippolyte K.ODJA, Di Liu, Jean-Michel MÉRILLON, Françoise ANDREU, Marc RIDEAU et Jean-Claude CHÉNIEUX 453
Physiologie cellulaire végétale
Étude cinétique de l'évolution des pH cytoplasmique et vacuolaire après administration de piqûres sur les cotylédons de Bidens pilosa L. Patrick BONNIN, Michel GENDRAUD et Marie-Odile DESBIEZ 459
Nutrition des végétaux
Influence de l'activité rhizosphérique du pin maritime (Pinus Pinaster Soland in Ait) sur les teneurs du sol en cuivre soluble à l'eau. Etienne SAUR et Alain GOMEZ 465
Les « Comptes Rendus de l'Académie des Sciences » figurent dans « Current Contents » et « Pascal »
4078-89 — Dépôt légal septembre 1989 Imprimeur 3174 — CPPP 60385 — Imprimé en France